CN102262097B - 一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法及其图谱模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法及其图谱模型。构建方法包括以下步骤：获取已经脱离人体的静脉血液3ml，静置30分钟；以3000转/分钟离心10分钟；吸取上清液500ul，置于零下80℃环境中保存；冻融后，吸取200ul上清液，加入D2O为99.5％的重水200ul混合，得到混合液；将混合液置于5mm核磁管，通过核磁共振谱仪获取混合液的一维氢谱的谱图；对一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、相位调整、基线校正、定标及积分处理，得到上清液的***性红斑狼疮谱图；对若干个上清液的***性红斑狼疮谱图建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型，进行多元统计分析；根据分析结果，建立***性红斑狼疮图谱模型。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种获取作为中间结果的***性红斑狼疮信息，尤其涉及一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法，以及采用该构建方法所构建的***性红斑狼疮的图谱模型。
【背景技术】
***性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫性***炎症性疾病，伴随疾病的进展可以产生大量对抗自身抗原的抗体，从而导致多器官***的损伤，包括皮肤，关节，肾脏和中枢神经***等。然而SLE的发病机制并不是十分清楚，由于临床表现的多样性及复杂的病理过程都给疾病早期及正确的诊断提出了挑战。
代谢组学作为一门新兴的***生物学技术，通过对体液及组织中的小分子代谢物的整体组成进行动态的跟踪监测，其中，小分子代谢物一般是指相对分子量小于1000的低分子化合物，然后结合模式识别多元变量统计分析方法，来检测和分析机体在受到环境及病理刺激时内源代谢物的改变。代谢组学常用的技术包括核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）和质谱技术（massspectrometry，MS）。而1H NMR（核磁共振氢谱）由于其损伤性小，重复性高及无偏向性等优点，使得代谢组学技术已经广泛应用于临床研究，尤其是应用在临床疾病代谢标志物的寻找，疾病的分型和严重程度的区分，代谢机制的探讨以及预后及疗效的评估等。
近年来，以NMR技术结合模式识别分析方法（pattern recognition，PR）成功地被应用于多种疾病的研究，包括心血管***、神经***，多器官肿瘤，自身免疫性疾病等。
SLE是一种累积多器官***的疾病，患者体内的代谢网络必然发生变化，而这种变化使得患者循环***中代谢物种类、浓度或相对比例发生改变。如何结合代谢组学方法进行综合分析，目前尚未有具体的研究结果和技术信息。
因此，现有技术需要改进。
【发明内容】
有鉴于此，有必要提出一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法及其图谱模型。
本发明的一个技术方案是，一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法，其包括以下步骤：A1、获取已经脱离人体的静脉血液3ml，静置至少30分钟；A2、以3000转/分钟离心至少10分钟；A3、从3/4液面高度处吸取上清液500μl，置于零下80℃环境中保存；A4、冻融后，从1/2液面高度处吸取200μl所述上清液，加入D2O为99.5%的重水200μl混合，得到混合液；A5、将所述混合液置于5mm核磁管，通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图；A6、采用TopSpin软件对所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、相位调整、基线校正、定标及积分处理，得到所述上清液的***性红斑狼疮谱图；其中，在进行傅立叶变换时乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数，以内标乳酸在1.33ppm的双峰进行定标处理，并且，在进行积分时，去除水峰积分值后将其余积分值进行加合和归一化处理；A7、采用SIMCA-P+软件对若干个上清液的***性红斑狼疮谱图建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型，进行多元统计分析；其中，所述多元统计分析包括主成分分析、偏最小二乘法-判别分析及其正交信号校正处理；A8、根据多元统计分析的分析结果，建立所述***性红斑狼疮图谱模型。
应用于上述方案，所述的构建方法中，所述重水预冷到4至8摄氏度后再与所述上清液混合。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，步骤A7中，所述多元统计分析采用平均中心化换算和自适换算的数据标度换算方式，并且，在所述多元统计分析之后还执行以下步骤A71：采用20折交叉验证法检验各模型的质量，作为所述分析结果的一部分。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，步骤A71之后还执行以下步骤A72：采用交叉验证后得到的模型可解释变量以及模型可预测度，评判各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，步骤A72之后还执行以下步骤A73：通过排列实验随机200次改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测度，进一步检验各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，步骤A5中，所述通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图，包括选用标准预饱和压水的NOESY1DPR序列，弛豫延迟时间为2.5秒，混合时间为100毫秒，累加次数128次。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，所述弛豫延迟时间及所述混合时间内，都进行饱和照射。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，在温度25℃下进行，采集时间为0.9541s，谱宽为8384.9Hz。
应用于上述各方案，所述的构建方法中，步骤A6中，积分区间为9.0-0.4ppm，积分间距为0.005ppm。
本发明的又一个技术方案是，一种***性红斑狼疮的图谱模型，其采用任一上述方案的构建方法构建获得。
上述方案，提供了***性红斑狼疮图谱模型，为通过在代谢物水平整体地、***地研究SLE提供作为中间结果的信息，具有高特异性及敏感性，在SLE的发病机制的探讨方面，是对基因及转录组的成果的有力补充，但由于SLE存在缓解期及活动期，且多伴有其他***并发症，因此还需要进一步的验证才能实现对***性红斑狼疮的诊断。
【附图说明】
图1是本发明一个实施例的SLE和正常对照血清600MHz1H NMR谱图；
图2是本发明一个实施例的SLE患者和正常对照的PCA得分图；
图3A是本发明一个实施例的PLS-DA得分图；
图3B是图3A的验证图；
图4是本发明一个实施例的SLE患者和正常对照组的OPLS-DA得分图；
图5是本发明一个实施例的方法示意图。
【具体实施方式】
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述。
如图5所示，本发明的一个实施例是，一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法，其包括以下步骤。
A1、获取已经脱离人体的静脉血液3ml，静置至少30分钟；一般来说，静置时间在30至60分钟较好，优选30分钟或40分钟。优选的，分别获取试验组和参照组已经脱离人体的静脉血液3ml，静置至少30分钟后，分别进行后续步骤；例如，试验组可以包括多个不同SLE患者的已经脱离人体的静脉血液，同样的，参照组可以包括多个不同健康志愿者的已经脱离人体的静脉血液。
A2、以3000转/分钟离心至少10分钟；一般来说，离心的时间在10至20分钟较好，优选10分钟或15分钟。
A3、从3/4液面高度处吸取上清液500μl，置于零下80℃环境中保存；考虑到取样的精确度，不宜从过高或过低液面处吸取上清液，经反复试验，大约在1/2液面高度至3/4液面高度处并一直保持该相对高度吸取上清液较佳，优选3/4液面高度。液面高度是指，对于一试管内的溶液，所述溶液的高度即为所述液面高度，例如，某试管内的溶液高度为4厘米，则溶液的底部距离其液面为4厘米，则3/4液面高度处即为3厘米高度处。
A4、冻融后，从1/2液面高度处吸取200μl所述上清液，加入D2O为99.5%的重水200μl混合，得到混合液；同样的，考虑到取样的精确度，不宜从过高或过低液面处吸取上清液，经反复试验，大约在1/2液面高度至3/4液面高度处吸取上清液较佳，冻融后优选在1/2液面高度处吸取上清液。优选的，所述重水预冷到4至8摄氏度后再与所述上清液混合，最好是，重水的温度与上清液的温度相同或相近，例如，上清液冻融至5摄氏度，重水预冷至5摄氏度，再将两者在5摄氏度的环境下混合，以避免实验误差。
A5、将所述混合液置于5mm核磁管，通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图；例如，所述通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图，包括选用标准预饱和压水的NOESY1DPR序列，弛豫延迟时间为2.5秒，混合时间为100毫秒，累加次数128次。应用于上例，再优选的，所述弛豫延迟时间及所述混合时间内，都进行饱和照射。应用于上例，再优选的，所述通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图，在温度25℃下进行，采集时间为0.9541s，谱宽为8384.9Hz。
A6、采用TopSpin软件对所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、相位调整、基线校正、定标及积分处理，得到所述上清液的***性红斑狼疮谱图；其中，在进行傅立叶变换时乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数，以内标乳酸在1.33ppm的双峰进行定标处理，并且，在进行积分时，去除水峰积分值后将其余积分值进行加合和归一化处理；优选的，积分区间为9.0-0.4ppm，积分间距为0.005ppm。
A7、采用SIMCA-P+软件对若干个上清液的***性红斑狼疮谱图建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型，进行多元统计分析；其中，所述多元统计分析包括主成分分析、偏最小二乘法-判别分析及其正交信号校正处理；例如，所述多元统计分析采用平均中心化换算和自适换算的数据标度换算方式，并且，在所述多元统计分析之后还执行以下步骤A71：采用20折交叉验证法检验各模型的质量，作为所述分析结果的一部分。应用于上例，再优选的，步骤A71之后还执行以下步骤A72：采用交叉验证后得到的模型可解释变量以及模型可预测度，评判各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。应用于上例，再优选的，步骤A72之后还执行以下步骤A73：通过排列实验随机200次改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测度，进一步检验各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。
A8、根据多元统计分析的分析结果，建立所述***性红斑狼疮图谱模型。
本发明的又一个实施例是，一种***性红斑狼疮的图谱模型，其采用上述任一例或其组合所述构建方法，构建获得所述图谱模型。即采用上述任一例或其组合所述构建方法，构建获得所述***性红斑狼疮的图谱模型。
本发明上述各实施例，通过应用ＮMR技术检测SLE患者血清中代谢物，发现与健康对照者相比血清中代谢物轮廓的改变，结合模式识别分析方法构建***性红斑狼疮的图谱模型，即SLE血清代谢物核磁共振谱图模型，为通过在代谢物水平整体地、***地研究SLE提供作为中间结果的信息。下面再继续通过具体的实例说明本发明。
标本采集：清晨采血，包括SLE组和正常组若干例，每一例采集3ml静脉血于生化管，静置30min后，3000r/m离心10min，从3/4液面高度处吸取上清液500μl，放入-80℃保存待测。
核磁共振检测：将标本室温冻融，从1/2液面高度处吸取200μl血清混入200μl重水（D2O99.5%）用于锁场。将混合液放入5mm核磁管，在VarianNMR600MHz谱仪上采集血清样品的一维氢谱。实验是标准一维水峰抑制实验，选用标准预饱和压水的NOESY1DPR序列[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]，弛豫延迟（采样延迟，RD）为2.5s，混合时间（tm）为100ms，累加次数128次，在采样延迟（RD）及混合时间（tm）都对水进行饱和照射。温度25℃，采集时间0.9541s，谱宽8384.9Hz。
统计学分析：使用TopSpin软件（V3.0，Bruker Biospin，Germany）对谱图进行了傅立叶变换，相位调整，基线校正，及定标等处理，所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数以提高信噪比。本例中血清的核磁共振谱图以内标乳酸在1.33ppm的双峰定标。积分区间为9.0-0.4ppm，积分间距为0.005ppm，去掉5.225-4.66ppm一段包含残余的水峰积分值，然后将剩下的积分值进行加合和归一化处理。
所有模式识别多元统计分析均应用SIMCA-P+软件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden），包括监督的主成分分析法（principal component analysis，PCA）、监督的偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和对PLS-DA进行正交信号校正处理（orthogonal signal correction，OSC）的OPLS-DA分析。采用平均中心化换算（mean center-Scaling）和自适换算（unit variance scaling）的数据标度换算方式。对模型的质量用20折交叉验证法进行检验，并用交叉验证后得到的R2X和Q2（分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度）对模型有效性进行评判。在此之后，通过排列实验随机多次（n=200）改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。
下面以具体的SLE患者和正常人为例，进一步给出实例说明本发明。
选取64例SLE患者，男女比例为10:54，年龄在34.44±12.13岁，均来自深圳市人民医院风湿科2008-2009年住院病人；诊断标准参照临床用的美国风湿病学1982年的诊断标准，并且排除近2周内有呼吸道感染患者。健康对照组选取35例同期本院体检中心体检的健康志愿者，男女比例为9/26，年龄在36.46±10.65岁。
根据上例所述方法获取SLE患者血清1H NMR图谱和健康志愿者的血清1H NMR图谱，SLE患者的谱图和正常组的谱图有些相似，但仍可以看到主要的差异信号集中在脂肪及氨基酸区域。其中主要的差异代谢物来源一些脂质的代谢片段（L6、L7、L8、L9、L10），其中高密度脂蛋白（HDL，L1）、胆固醇（Cholesterol，L1）和磷酸胆碱（Phosphocholine：PC）水平有所降低，而低密度脂蛋白（LDL：L2、L4）和极低密度脂蛋白（VLDL：L3、L5）水平升高。一些生酮和生糖氨基酸包括缬氨酸（Valine：Val）、丙氨酸（Alaine：Ala）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、组氨酸（Histidine，His）、异亮氨酸（Isoleucine，Ileu）、酪氨酸（Tyrosine：Tyr）和谷氨酸（Glutamate：Glu）水平都有所下降。其它信号减弱的代谢物还包括柠檬酸（Citrate：Ci）、丙酮酸（Pyruvate：Py）、甲酸（Formate：For）、肌酸（Creatine：Cr）和肌氨酸酐（Creatinine：Cn）和谷氨酸盐（Glutamate，Gln）。氮乙酰基糖蛋白信号（N-acetyl glycoprotein signals：NAG）呈显著增强。
本例所涉及的SLE患者及健康对照者血清NOESY1DPR谱图如图1所示，包括化学位移从δ0.4-4.7和δ5.2-9.0；其中，与δ0.4-4.7相比，在虚线框中的δ5.2-9.0是放大了4倍的谱图。
然后进行PR分析，PCA分析结果以主成分（principal component，PC）PC1和PC2构建得分图（scores plot），其中PC1与PC2分别代表总变量的76.6%和10.9%；得分图上的每个点代表一个血清标本，SLE患者和正常对照的PCA得分图如图2所示，SLE组和正常对照组有一定意义的被非显著性区分，其中，R2X=87.4%，Q2=0.860。图3A是PLS-DA预测模型的得分图，其中，R2X=69.9%，R2Y=0.452，Q2=0.393，而图3B是图3A经过200次排序验证的验证图。如图4所示，是SLE患者和正常对照组的OPLS-DA得分图，其中，R2X=69.9%，Q2=0.390，进一步揭示了组间可能存在的差异，从OPLS-DA的构建的模型预测敏感性和特异性分别是60.9%和97.1%。上述各图中，■符号代表RA患者，而●符号代表正常对照者。
本发明上述各例，以NMR为基础的代谢组学技术，结合模式识别分析方法，NMR技术可构建机体整体的代谢指纹图谱来区分疾病的病理状态，其提供的中间信息优于传统的单一标志物。从血清NOESY1DPR谱图看出，SLE患者与对照者之间血清代谢物的差异主要集中在脂质和氨基酸区域。脂质区域中HDL的降低和LDL及VLDL的升高，与之前的研究相似，说明SLE引起脂质代谢的紊乱。而SLE患者血清氨基酸水平降低包括一些生糖及生酮的氨基酸和三羧酸循环的中间代谢产物柠檬酸也下降，加之糖酵解中间产物丙酮酸的下降说明SLE患者存在能量代谢的紊乱，这可能与蛋白质分解代谢加强和全身炎症状态下对能量需求的增加。但是，需要说明的是，单一代谢物乃至于多个代谢物的改变并不能作为SLE特异的标志物，只有收集整体代谢物改变的信息、并经过医学验证才能准确区分SLE的疾病状态。
本发明上述各例，还结合模式识别分析方法对采集的代谢物信息进行分析，PCA是一种将原始特征压缩至最小可能性成分数的维数缩减分析方法，即用较少的综合性变量代替原来众多的相关变量。在PCA得分图中，SLE与对照组得到了一定参考意义上的区分。说明SLE患者与健康对照组血清代谢物轮廓确实有可能存在一定的差异。而PLS-DA得分图验证了这一点，但是此模型预测性达到0.393，不足以作为诊断SLE的依据。为了进一步为了消除其它非实验因素的影响，对PLS-DA进行了正交滤噪得到OPLS-DA得分图更显著地区分疾病组与对照组，最大化地凸显两组间的差异。对模型进行验证得到较高的特异性和敏感性。
从最后一个实施例的结果可见，应用血清差异代谢物构建的SLE图谱模型有助于提供一种区分SLE患者和正常对照组的可能途径，但是得分图均显示代表健康对照组的点较集中而代表SLE患者的点相对离散，并且，考虑由于SLE存在缓解期及活动期，且多伴有其他***并发症，因此根据现有技术中的医学知识和本发明申请公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出该SLE疾病的诊断结果。但是随着后续研究工作的开展，采用上述各例及其组合的构建方法，其所构建的***性红斑狼疮的图谱模型，将作为中间结果的有效信息，为下一步的分析工作提供良好的信息支持和辅助数据。
综上所述，本发明的应用是以NMR为基础的代谢组学技术对SLE患者血清标本进行分析，发现SLE患者血清的代谢轮廓与正常人存在一定差异，而在采用模式识别分析方法对海量数据进行分析时，不仅成功区分疾病组与对照组，而且构建SLE具有较高特异性及敏感性的图谱模型。这都说明了代谢组学有望成为临床SLE研究的有力助手，而且在SLE的发病机制的探讨方面，可以作为对基因及转录组的成果的有力补充。
需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即血清，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；并且，上面列出的各个技术特征，其相互组合所能够形成各个实施方案，应被视为属于本发明说明书记载的范围。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种***性红斑狼疮图谱模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1、获取已经脱离人体的静脉血液3ml，静置至少30分钟；
A2、以3000转/分钟离心至少10分钟；
A3、从3/4液面高度处吸取上清液500μl，置于零下80℃环境中保存；
A4、冻融后，从1/2液面高度处吸取200μl所述上清液，加入D2O为99.5%的重水200μl混合，得到混合液；
A5、将所述混合液置于5mm核磁管，通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图；
A6、采用TopSpin软件对所述一维氢谱的谱图进行傅立叶变换、相位调整、基线校正、定标及积分处理，得到所述上清液的***性红斑狼疮谱图；其中，在进行傅立叶变换时乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数，以内标乳酸在1.33ppm的双峰进行定标处理，并且，在进行积分时，去除水峰积分值后将其余积分值进行加合和归一化处理；
A7、采用SIMCA-P+软件对若干个上清液的***性红斑狼疮谱图建立主成分分析模型和偏最小二乘法模型，进行多元统计分析；其中，所述多元统计分析包括主成分分析、偏最小二乘法-判别分析及其正交信号校正处理；
A8、根据多元统计分析的分析结果，建立所述***性红斑狼疮图谱模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重水预冷到4至8摄氏度后再与所述上清液混合。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤A7中，所述多元统计分析采用平均中心化换算和自适换算的数据标度换算方式，并且，在所述多元统计分析之后还执行以下步骤A71：采用20折交叉验证法检验各模型的质量，作为所述分析结果的一部分。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤A71之后还执行以下步骤A72：采用交叉验证后得到的模型可解释变量以及模型可预测度，评判各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤A72之后还执行以下步骤A73：通过排列实验随机200次改变分类变量的排列顺序得到相应的随机模型可预测度，进一步检验各模型的有效性，作为所述分析结果的一部分。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤A5中，所述通过Varian NMR600MHz核磁共振谱仪获取所述混合液的一维氢谱的谱图，包括选用标准预饱和压水的NOESY1DPR序列，弛豫延迟时间为2.5秒，混合时间为100毫秒，累加次数128次。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述弛豫延迟时间及所述混合时间内，都进行饱和照射。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在温度25℃下进行，采集时间为0.9541s，谱宽为8384.9Hz。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤A6中，积分区间为9.0-0.4ppm，积分间距为0.005ppm。
10.一种***性红斑狼疮的图谱模型，其特征在于，其采用如权利要求1至9任一所述的构建方法构建获得。
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