CN112209999B - 一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 - Google Patents
一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112209999B CN112209999B CN202011171039.1A CN202011171039A CN112209999B CN 112209999 B CN112209999 B CN 112209999B CN 202011171039 A CN202011171039 A CN 202011171039A CN 112209999 B CN112209999 B CN 112209999B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- epidermal growth
- recombinant epidermal
- filler
- pigment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 title claims abstract description 94
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 69
- 239000000049 pigment Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract description 67
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 10
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 8
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 6
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 14
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 14
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 12
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，属于生物医药技术领域。本发明快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法包括如下步骤：对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入疏水高效液相色谱填料，随后进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；采用流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子；本发明分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，产品活性、纯度均较高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法。
背景技术
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质，人表皮生长因子(hEGF)最早在1974年从人尿中提纯。hEGF是由53个氨基酸组成的小分子多肽组成，分子量约为6000道尔顿，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。
hEGF是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物学效应，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖、加速细胞新陈代谢。hEGF在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。
20世纪80年代以前，hEGF的来源主要是通过组织和体液提取，由于hEGF在组织和体液中的含量极微，造成提取成本高且产品纯度低，使hEGF的应用受到了限制。80年代以后，随着基因工程技术的发展，人们通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产hEGF获得了成功，为工业化生产基因重组人表皮生长因子(rhEGF)打下了基础。然而目前采用基因重组技术制得的rhEGF发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高；其中，发酵液培养基里一般会含有色素，发酵过程中代谢也会产生色素分子，成为重组表皮生长因子发酵液中占比较大的杂质，影响重组表皮生长因子的纯度及功效的发挥。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，工艺简便快速、步骤少、易于工业化放大等特点，产品活性、纯度均较高。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，包括如下步骤：
S1、对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入疏水高效液相色谱填料，随后进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
S2、采用流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子。
作为优选，步骤S1所述预处理的步骤为，
1)酸沉：用酸液调节重组表皮生长因子发酵液的PH至2-3，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液。
2)加入疏水高效液相色谱填料前在上清发酵液中加入终浓度为0.6～0.8mol/L的氯化钠。
作为优选，所述酸液包括稀盐酸、三氟乙酸中的一种或两种。
本发明在预处理过程中通过酸沉处理(等电点沉淀法)，将重组表皮生长因子发酵液的PH控制在2～3，能够去除重组表皮生长因子发酵液的大多数蛋白质，这是由于除重组表皮生长因子发酵液的大多数杂蛋白的等电点在都在PH3±0.5的酸性范围内。
本发明在预处理后期在上清发酵液中加入终浓度为0.6～1.0mol/L的氯化钠，能够增加重组表皮生长因子的疏水性，使重组表皮生长因子蛋白表面露出疏水基。
作为优选，所述搅拌游离吸附为磁力搅拌至疏水高效液相色谱填料悬起后继续搅拌12～18min，然后于2～8℃环境中静置待吸附填料沉淀。
作为优选，步骤S1所述重组表皮生长因子发酵液采用大肠杆菌分泌表达，并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中。
作为优选，步骤S1所述疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有疏水基团。
作为优选，所述疏水基团为苯基基团。
本发明选用疏水高效液相色谱填料对重组表皮生长因子发酵液进行处理，由于重组表皮生长因子发酵液中的色素分子大部分无疏水性，与疏水色谱填料吸附性不强，而表皮生长因子的疏水性能大于色素分子，能够与疏水色谱填料产生较强的吸附作用，因此在采用适当的流动相Ⅰ对吸附填料进行洗脱时，重组表皮生长因子发酵液中的色素会在疏水色谱上样时流穿，而重组表皮生长因子得以保留，从而可实现色素与重组表皮生长因子的有效分离，随后再采用流动相Ⅱ对吸附填料进行洗脱，将保留的重组表皮生长因子从疏水色谱填料上洗脱，可获得去除色素的重组表皮生长因子。并且重组表皮生长因子与疏水色谱填料之间的疏水作用是比较温和的相互作用，在洗脱后不会对其分子结构和活性造成损害。
本发明优选苯基基团作为疏水高效液相色谱填料的键合基团，苯基基团疏水作用力强，对发酵液中的重组表皮生长因子和色素分离效果最佳。
本发明去除重组表皮生长因子发酵液中色素的方法效率高、效果好，明显优于其他方法，如明显优于采用阴离子交换填料进行重组表皮生长因子发酵液中色素的分离，原因在于阴离子交换填料能吸附保留大部分色素，但同时也会吸附保留重组表皮生长因子，色素和重组表皮生长因子在阴离子交换填料的吸附强度相差不大，导致二者难以被有效分离；另外如采用阴离子填料进行分离，发酵液需要进行脱盐处理，增加了分离成本，也不利于规模化生产。
作为优选，步骤S1所述疏水高效液相色谱填料的颗粒度为16～25μm。
本发明通过控制色谱填料的颗粒度，使得填料在搅拌吸附后能够快速有效自然沉降，无需等待时间过久，即可进行下一步操作，倾倒出上清液，进行洗脱。如颗粒过小沉降时间长，洗脱速度慢。
作为优选，步骤S2所述流动相Ⅰ包括以下组分：调节PH至2.5～3.5的0.6～0.8mol/L氯化钠；所述流动相Ⅱ为调节PH至2.5～3.5的超纯水。
本发明重组表皮生长因子发酵液中的色素在疏水作用条件下与疏水色谱填料吸附作用力小，在高强度的流动相Ⅰ冲洗作用下，大部分不吸附或弱吸附色素被流动相1洗脱下来，而达到色素被优先脱除的目的；然后通过流动相Ⅱ将重组表皮生长因子洗脱下来，达到分离将重组表皮生长因子和色素分离并浓缩重组表皮生长因子的目的。本发明中流动相Il和流动相1的洗脱顺序不能颠倒，如果用流动相Il先洗脱，部分残留在填料表面的色素和EGF会被同时洗脱下来，色素的去除效果会相对差很多。
作为优选，步骤S2所述洗脱在洗脱装置中进行，所述洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵。
进一步优选，步骤S2所述洗脱为将收集的吸附填料放置于布氏漏斗中，在抽真空的同时向布氏漏斗中流加洗脱液。
本发明的洗脱装置由布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵组合，收集的吸附填料加入布氏漏中抽真空，流加流脱液并收集流出液从而完成浓缩。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明整个吸附-洗脱流程快速并操作简单，对重组表皮生长因子发酵液中色素的分离速度快、效率高、成本低，适于工业化大规模生产；
(2)本发明的方法在去除重组表皮生长因子发酵液中色素的同时还具有浓缩纯化的作用，从而大幅提高最终产品纯度；
(3)本发明通过优选键合有苯基基团的疏水高效液相色谱填料，实现了发酵液中的重组表皮生长因子和色素较佳的分离效果；
(4)本发明通过优选洗脱液的组分，能够快速将色素重组表皮生长因子从色谱填料上依次洗脱，从而实现二者的快速高效分离；
(5)本发明通过控制色谱填料的粒径范围大小，提高了色谱填料的沉降速度。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例中快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法具有如下步骤：
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，具体为，先酸沉：先用稀盐酸调节分离重组表皮生长因子发酵液的PH至2.5，静置2小时后进行离心，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；并于使用前在上清发酵液中加入终浓度为0.8mol/L的氯化钠；
(3)在预处理后的上清发酵液加入疏水高效液相色谱填料(疏水高效液相色谱填料由硅胶基质及其表面键合的苯基基团组成，颗粒度为20μm)，磁力搅拌至疏水高效液相色谱填料悬起后继续搅拌15min，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，然后于5℃环境中静置待吸附填料沉降，弃去上层液，收集吸附填料；
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，先向布氏漏斗中流加流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后流加流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子，
流动相Ⅰ为0.7mol/L氯化钠，用2mol/L盐酸调pH至3；流动相Ⅱ为超纯水，用2mol/L盐酸调pH至3。
实施例1收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为89％。
实施例2
本实施例中快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法具有如下步骤：
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，具体为，先酸沉：先用稀盐酸调节分离重组表皮生长因子发酵液的PH至2.0，静置2.5小时后进行离心，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；并于使用前在上清发酵液中加入终浓度为0.6mol/L的氯化钠；
(3)在预处理后的上清发酵液加入疏水高效液相色谱填料(疏水高效液相色谱填料由硅胶基质及其表面键合的苯基基团组成，颗粒度为20μm)，磁力搅拌至疏水高效液相色谱填料悬起后继续搅拌18min，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，然后于3℃环境中静置待吸附填料沉降，弃去上层液，收集吸附填料；
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，先向布氏漏斗中流加流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后流加流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子，
流动相Ⅰ为0.6mol/L氯化钠，用2mol/L盐酸调pH至2.5；流动相Ⅱ为超纯水用2mol/L盐酸调pH至2.5。
实施例2收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为86％。
实施例3
本实施例中快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法具有如下步骤：
(1)以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，具体为，先酸沉：先用稀盐酸调节分离重组表皮生长因子发酵液的PH至3静置1.5小时后进行离心，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；并于使用前在上清发酵液中加入终浓度为1.0mol/L的氯化钠；
(3)在预处理后的上清发酵液加入疏水高效液相色谱填料(疏水高效液相色谱填料由硅胶基质及其表面键合的苯基基团组成，颗粒度为20μm)，磁力搅拌至疏水高效液相色谱填料悬起后继续搅拌12min，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，然后于8℃环境中静置待吸附填料沉降，弃去上层液，收集吸附填料；
(4)将收集的吸附填料放置于洗脱装置(洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵)的布氏漏斗中，在抽真空的同时，先向布氏漏斗中流加流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后流加流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子，
流动相Ⅰ为0.8mol/L氯化钠，用2mol/L盐酸调pH至3.5；流动相Ⅱ为超纯水，用2mol/L盐酸调pH至3.5。
实施例3收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为83％。
对比例1
采用DEAE弱碱性阴离子交换填料进行吸附处理，重组表皮生长因子发酵液进行脱盐预处理，采用洗脱液洗脱重组表皮生长因子主活性部分，洗脱液的组分为：150mmol/L氯化钠溶液10mmol/LTris-HCl、PH7.0，采用再生液对阴离子交换填料进行再生，再生液的组分为：1mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl，pH7.0，其他与实施例1相同。
观察对比例1的试验过程，在搅拌游离吸附后，通过观察可发现色素分子几乎完全被阴离子交换填料吸附，洗脱后色素也被同时洗脱下来并被浓缩，由于色素和重组表皮生长因子在阴离子交换填料的吸附强度相差不大，导致二者难以通过流动相洗脱被有效分离，经多次试验重组表皮生长因子的活性回收率约在50-60％。在阴离交换填料上，色素分子比EGF相对要保留强些，但因差异性不大而很难分开，部分保留强些的色素在填料再生时可被洗下来。
对比例2
重组表皮生长因子发酵液未进行预处理，其他与实施例1相同。
收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为52％。
本发明实施例和对比例中重组表皮生长因子的活性回收率＝(产物每毫升活性单位数×体积)/发酵液总活性单位数×100％。
本发明整个吸附-洗脱流程快速并操作简单，去除色素的同时还具有浓缩纯化的作用，活性回收率可达80％以上，电泳纯度可达75％以上。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对重组表皮生长因子的发酵液进行预处理，然后加入疏水高效液相色谱填料，随后进行搅拌游离吸附，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，待吸附填料沉降后去掉上层液，收集吸附填料；
S2、采用流动相Ⅰ洗脱吸附填料至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ继续对吸附填料进行洗脱并收集流出液，即得到去除色素的重组表皮生长因子；
步骤S1所述预处理的步骤为，
1）酸沉：用酸液调节重组表皮生长因子发酵液的PH至2.5，静置后进行固液分离，弃去固体沉淀，保留上清发酵液；
2）加入疏水高效液相色谱填料前在上清发酵液中加入终浓度为0.8mol/L的氯化钠；
步骤S1所述疏水高效液相色谱填料由硅胶基质及其表面键合的疏水基团组成；所述疏水基团为苯基基团；步骤S1所述疏水高效液相色谱填料的颗粒度为20μm；
步骤S1收集吸附填料具体为磁力搅拌至疏水高效液相色谱填料悬起后继续搅拌15min，使重组表皮生长因子吸附在疏水高效液相色谱填料上，形成吸附填料，然后于5℃环境中静置待吸附填料沉降，弃去上层液，收集吸附填料；
步骤S2所述流动相Ⅰ为PH调节至3的0.7mol/L氯化钠，所述流动相Ⅱ为PH调节至3的超纯水；
步骤S2所述洗脱在洗脱装置中进行，所述洗脱装置包括布氏漏斗、抽滤瓶和循环真空泵。
2.根据权利要求1所述快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法，其特征在于，步骤S1所述重组表皮生长因子采用发酵液大肠杆菌分泌表达，并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011171039.1A CN112209999B (zh) | 2020-10-28 | 2020-10-28 | 一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011171039.1A CN112209999B (zh) | 2020-10-28 | 2020-10-28 | 一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112209999A CN112209999A (zh) | 2021-01-12 |
| CN112209999B true CN112209999B (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=74057321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011171039.1A Active CN112209999B (zh) | 2020-10-28 | 2020-10-28 | 一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112209999B (zh) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7779191A (en) * | 1990-04-11 | 1991-10-30 | Indu Parikh | Method for the purification of epidermal growth factor |
| CN1279288A (zh) * | 2000-07-19 | 2001-01-10 | 深圳市华生元基因工程发展有限公司 | 重组人表皮生长因子基因及其表达产物的生产和应用 |
| CN100489096C (zh) * | 2005-04-21 | 2009-05-20 | 甘人宝 | 分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达*** |
| US20080207487A1 (en) * | 2006-11-02 | 2008-08-28 | Neose Technologies, Inc. | Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines |
| CN102020710B (zh) * | 2010-09-03 | 2012-09-05 | 深圳市华生元基因工程发展有限公司 | 人表皮生长因子一个新的突变体en-46 |
| EA025626B1 (ru) * | 2013-10-11 | 2017-01-30 | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" | ПРОДУЦЕНТ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ЧЕЛОВЕКА (рчЭФР) |
| CN107353338B (zh) * | 2017-07-27 | 2020-11-17 | 宁波博睿修存生物科技有限公司 | 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法 |
| CN107987150A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-04 | 江苏艾迪药业有限公司 | 一种可工业化生产的从尿液中制备人表皮生长因子的方法 |
-
2020
- 2020-10-28 CN CN202011171039.1A patent/CN112209999B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112209999A (zh) | 2021-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10428107B2 (en) | Method for isolating and purifying recombinant human serum albumin from transgenic rice grain | |
| CN108070032B (zh) | 一种重组人源胶原蛋白的纯化方法 | |
| JP6138690B2 (ja) | 組み換え大腸菌からヒト顆粒球コロニー刺激因子を精製する方法 | |
| CN101260145B (zh) | 一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 | |
| CN112724242B (zh) | 利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法 | |
| CN113121705A (zh) | 用于制备短肽混合物的融合蛋白、目的多肽、短肽混合物的制备方法及应用 | |
| CN107353338B (zh) | 一种分离水蛭素发酵液中色素分子的方法 | |
| CN103497248B (zh) | 一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法 | |
| CN111777676B (zh) | 一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法 | |
| CN112175063B (zh) | 一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺 | |
| CN112209999B (zh) | 一种快速分离重组表皮生长因子发酵液中色素的方法 | |
| EP0446582B1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
| TWI758285B (zh) | 一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法 | |
| CN107129531B (zh) | 一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 | |
| CN113121637B (zh) | 一种重组蛋白的分离纯化方法 | |
| CN112250753B (zh) | 一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法 | |
| CN103102417B (zh) | 一种重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的纯化方法 | |
| CN1142281C (zh) | 重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法 | |
| CN117466992B (zh) | 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用 | |
| CN117777274A (zh) | 一种乳铁蛋白的晶胶吸附层析分离方法 | |
| CN114163517A (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法 | |
| JP3737252B2 (ja) | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 | |
| CN116410295A (zh) | 一种大肠杆菌表达物的纯化方法 | |
| JP4154743B2 (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| KR920008377B1 (ko) | 인간 인슐린 유사 성장인자-i의 정제방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Room 202, 2 / F, 021 building, 211 Xingguang Road, high tech Zone, Ningbo City, Zhejiang Province, 315048 Applicant after: Ningbo Borui Handa Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 714, block B, No.1 Huamao Xuefu, Shounan street, Yinzhou District, Ningbo City, Zhejiang Province, 315194 Applicant before: Ningbo Borui Handa Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |