JP6138690B2 - 組み換え大腸菌からヒト顆粒球コロニー刺激因子を精製する方法 - Google Patents
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Description
より具体的には、本発明は、(a);ヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する組み換え大腸菌を培養した後、遠心分離して細胞沈殿物を収得する段階と、(b);(a)段階で得られた細胞沈殿物からヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む上清液を分離する段階と、(c);(b)段階で得られた上清液を酸で処理し、そこから生成された沈殿物を濾過して分離する段階と、(d);(c)段階で得られた濾液を陽イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階と、(e);(d)段階で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する段階と、(f);(e)段階で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階とを含む 、組み換え大腸菌から高純度のヒト顆粒球コロニー刺激因子を高収率で精製する方法に関する。
したがって、微生物を利用して、アミノ末端にメチオニン残基が付加されていない天然型と同一のヒト顆粒球コロニー刺激因子を大量に収得することのできる方法が求められている。
(a) ヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する組み換え大腸菌を培養した後、遠心分離して細胞沈殿物を収得する段階と、
(b) (a)段階で得られた細胞沈殿物から人間顆粒球コロニー刺激因子を含む上清液を分離する段階と、
(c) (b)段階で得られた上清液を酸で処理し、そこから生成された沈殿物を濾過して分離する段階と、
(d) (c)段階で得られた濾液を陽イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階と、
(e) (d)段階で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する段階と、
(f) (e)段階で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階とを含む、組み換え大腸菌から高純度のヒト顆粒球コロニー刺激因子を高収率で精製する方法を提供することにある。
(a) ヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する組み換え大腸菌を培養した後、遠心分離して細胞沈殿物を収得する段階と、
(b) (a)段階で得られた細胞沈殿物からヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む上清液を分離する段階と;
(c)(b)段階で得られた上清液を酸で処理し、そこから生成された沈殿物を濾過して分離する段階と、
(d)(c)段階で得られた濾液を陽イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階と、
(e)(d)段階で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する段階と、
(f) (e)段階で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階とを含むことができる。
(a)段階は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する組み換え大腸菌を培養した後、遠心分離して細胞沈殿物を収得する段階である。この段階で使用される組み換え大腸菌は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する。好ましくはペリプラズム内に発現するものであればいずれも制限なしに使用することができる。さらに好ましくは、本発明のヒト顆粒球コロニー刺激因子は、組み換え大腸菌内で可溶性の形態で発現される。本発明において、ヒト顆粒球コロニー刺激因子をペリプラズム内に発現させる組み換え大腸菌は、分泌配列とヒト顆粒球コロニー刺激因子が融合された融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された組み換え大腸菌である。上記組み換え大腸菌の代表的な例としては、本発明者らの大韓民国特許第356140号に開示された、大腸菌の耐熱性エンテロトキシンIIの変形した分泌配列とヒト顆粒球コロニー刺激因子が融合した発現ベクターで形質転換された大腸菌HM10310、HM10311(KCCM-10154)、HM10409、HM10410(KCCM-10151)、HM10411(KCCM-10152)、HM10413、HM10414、HM10415、HM10510(KCCM-10153)、HM10511およびHM10512が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌の耐熱性エンテロトキシンIIの変形された分泌配列とヒト顆粒球コロニー刺激因子が融合した発現ベクターpT017SGで形質転換された大腸菌HM10411(KCCM-10152、大韓民国特許第356140号)を1Lの滅菌LB培地(トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L)が含まれているガラスの培養容器に接種して1次種菌培養(seed culture)を行った。上記培養液を強力に攪拌および通気させながら、37℃で11〜13時間培養した後、滅菌LB培地14Lの入った培養容器に接種し、2〜3時間2次種菌培養を行った。これから得られた培養液を発酵のための種子菌として使用し、炭素源としてグルコース1.4g/L、無機塩類としてKH2PO4 10g/L、(NH4)2HPO4 2.5g/L、NaCl 5g/LおよびMgCl2 1.2g/L、並びに様々な微量元素、酵母抽出物およびトリプトンが添加された120Lの滅菌された培地に接種した。発酵中にさらにブドウ糖と酵母エキスを添加しながら、流加式培養(fed-batch culture)を25時間以上行って、培養液の容積180Lで終了した。発酵が終了した後、発酵液を7,000rpmで遠心分離して菌体を得て、-70℃で保管した。
<1-1> ペリプラズムタンパク質の浸透圧抽出
上記参照例で得られた大腸菌の菌体を170Lのスクロース緩衝溶液(20%のスクロース、1mMのEDTA、30mMのTris、pH7.5)に懸濁し、90分間攪拌した後、7,000rpmで1次遠心分離してペレットを分離した。分離されたペレットに4℃の蒸留水170Lを添加した後、再び7,000rpmで2次遠心分離してペレットを除去し、ペリプラザズムタンパク質を含む上清液を分離した。この過程で大腸菌の菌体のペリプラズム内に存在するタンパク質が得られた。上記1次遠心分離および2次遠心分離過程で得られた上清液をSDS-PAGEで分析した(図1のレーン2および3)。
前記実施例<1-1>で得られたペリプラズムタンパク質を含む上清液に1%の酢酸を加えてpHを5.6〜5.7に調節した。この際、酸処理により、上清液内に含まれていた不溶性物質が沈殿し、これを濾過して除去することにより、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む濾液を得た。上記で酸処理後に得られた上清液および濾過後に得られた濾液をSDS-PAGEで分析した(図1のレーン4および5)。
前記実施例<1-2>で得られた濾液にSP-セファロース(SP-sepharose)カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを次のように行った。緩衝液1(10mMナトリウム酢酸、pH5.4)で予め平衡化したSP-セファロースのカラムに上記の濾液を40cm/時間の流速でロードして吸着させた後、吸着されていないタンパク質を同一の緩衝液で十分に洗浄して除去した。続いて、このカラムのカラムの容積の5倍の容量で300mM塩化ナトリウムが含まれた緩衝液1(10mMナトリウム酢酸、pH5.4)を流して込み、カラムからヒト顆粒球コロニー刺激因子を溶出した。上記陽イオン交換クロマトグラフィーの過程で得られた通過液および溶出液をSDS-PAGEで分析した(図1のレーン6〜8)。
前記実施例<1-3>で得られた溶出液に最終濃度が300mMになるようにアンモニウム硫酸を添加して希釈した後、ブチル‐セファロース(Butyl-sepharose)カラムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを次のように行った。緩衝液2(300mMの硫酸 アンモニウム 、10mMのTris、pH7.5)で予め平衡化したブチル‐セファロースのカラムに上記溶出液を80cm/時間の流速でロードして吸着させた後、吸着されていないタンパク質を同一の緩衝液で十分に洗浄して除去した。続いて、このカラムのカラム容積の1.5倍の容量で 硫酸アンモニウムを含まない緩衝液2(10mMのTris、pH 7.5)を流し込み、カラムからヒト顆粒球コロニー刺激因子を溶出した。上記疎水性相互作用クロマトグラフィーの過程で得られた通過液および溶出液をSDS-PAGEで分析した(図1のレーン9および10)。
前記実施例<1-4>で得られた溶出液に最終濃度が50mMになるように尿素を添加した後、Q-セファロースカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを次のように行った。緩衝液3(10mMのTris、pH7.5、100mMの尿素)に予め平衡化されたQ‐セファロースカラムに上記溶出液を60cm/時間の流速でロードして吸着させた後、吸着されていないタンパク質を同一の緩衝液で十分に洗浄して除去した。続いて、このカラムのカラム容積の3倍の容量に250mM塩化ナトリウムを含む緩衝液3(10mMのTris、pH7.5、100のmM尿素)を流し込み、カラムからヒト顆粒球コロニー刺激因子を溶出した。上記陰イオン交換クロマトグラフィーの過程で得られた溶出液をSDS-PAGEで分析した(図2のレーン2)。
まず、前記実施例<1-1>〜<1-5>の各過程で得られた上清液、カラム通過液および溶出液と標準品にG-CSF(NIBSC、Code No 88/502)を通常の方法によりSDS-PAGEで分析した。 SDS-PAGE分析の結果を図1および2に示した。図1においてレーン1は、標準品G-CSFであり、レーン2は、実施例<1-1>の浸透圧を抽出過程で得られた1次遠心分離上清液であり、レーン3は実施例<1-1>の浸透圧抽出プロセスで得られた2次遠心分離上清液であり、レーン4は、実施例<1-2>酸の沈殿過程で酸処理した後に得られた上清液であり、レーン5は、実施例<1-2>の酸の沈殿過程で濾過した後得られた濾液であり、レーン6は、実施例<1-3>のSP-セファロースカラムクロマトグラフィーにおけるカラム通過液であり、レーン7および8は、実施例<1-3>のSP-セファロースカラムクロマトグラフィーのカラム溶出液1および2であり、レーン9は、実施例<1-4>のブチル‐セファロスカラムクロマトグラフィーにおけるカラム通過液であり、レーン10は、実施例<1-4>のブチル‐セファロースカラムクロマトグラフィーのカラム溶出液である。図2にレーン1は、標準品Met-hG-CSFであり、レーン2は、実施例<1-5>のQ-セファロースカラムクロマトグラフィーにおけるカラム溶出液である。
SDS-PAGE分析の結果、本発明の精製方法に応じて組み換え大腸菌から分離、精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子が、これらの天然型と同様の分子量を持つことを確認した。
前記実施例<1 - >〜<1-5>の過程で精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子をSDS-PAGEゲルに電気泳動した後、PVDF膜に転換した。転換した膜をポンソー(Ponceau)S溶液で染色した後、韓国基礎科学支援研究院(ソウル分所)にN末端アミノ酸分析(アミノ酸15個)を依頼した。
その結果、本発明の精製方法によって、組み換え大腸菌から分離、精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子のN-末端配列は、天然型のヒト顆粒球コロニー刺激因子と同一であり、この時、宿主由来タンパク質は、100ng/mg以下、宿主由来DNAは100pg/mg以下、内毒素は10 EU/ U hG-CSF以下で確認された。
前記実施例<1-5>で得られた溶出液をブチルシリルシリカのカラムに注入した後、移動相に0.1%TFA/水と0.1%TFA/アセトニトリルを上記カラムに流し込みながら、逆相高圧クロマトグラフィーを行った。上記の方法で分析したクロマトグラムを図3に示した。
図3に示すように、本発明の精製方法によって、組み換え大腸菌から分離、精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子は、同様の性質の微細変形体が効果的に除去されて純度が極めて高いことが確認された。
前記実施例<1-5>で得られた溶出液を親水性シリカゲルカラム(分子量20,000〜200,000)に注入し、移動相として20mMのリン酸カリウム(pH6.0)/ 200mM塩化ナトリウム溶液を流し込みながら、サイズ排除高圧クロマトグラフィーを実施した。上記の方法で分析したクロマトグラムを図4に示した。
図4に示すように、本発明の精製方法によって、組み換え大腸菌から分離、精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子は、同様の性質のペプチドが効果的に除去されて純度が極めて高いことを確認した。
上記実験例1〜4を介して、本発明の精製方法によって、組み換え大腸菌から99%以上の純度を有する天然型ヒト顆粒球コロニー刺激因子を培養液1Lあたり110mgの収率で収得できることが確認された。比較群として大韓民国特許第356140号で開示された精製方法(イオン交換樹脂、吸着およびゲル濾過カラムまたは抗体カラムラムクロマトグラフィー)によって、組み換え大腸菌からヒト顆粒球コロニー刺激因子を精製した結果、99%以上の純度を持つ人間顆粒球コロニー刺激因子を培養液1L当たり70mgの収率で得た。したがって、本発明の精製方法は、大韓民国特許第356140号で開示された精製方法に比べて99%以上の高純度のヒト顆粒球コロニー刺激因子を得ることにおいて、50%以上向上した方法であることが分かる。
本発明の精製方法により得られたヒト顆粒球コロニー刺激因子の生理活性を調べるために、実施例<1-5>で精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子と国際標準品(NIBSC)をマウス由来の骨髄細胞を対象にして、生体内の力価分析を行った。具体的には、4〜6週齢マウスの大腿部を切断して骨髄細胞を回収した後、これを適切な濃度になるように培養した。精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子と国際標準品試料の各濃度別(100.00、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.14、0.05、0.02、0.01 ng/mL)に、上記で培養した骨髄細胞と混合した後、これを2〜3日間培養した。上記培養液に[メチル-H2]チミジンを添加し、10〜20時間さらに培養した後、細胞を分離し、ベータ・カウンターを利用してCPM値を測定した。その結果、本発明の精製方法によって分離、精製されたヒト顆粒球コロニー刺激因子は、国際標準品基準である0.6〜1.4×108 IU/mgを満足することを確認した。
Claims (18)
- (a)組み換え大腸菌のペリプラズム内にヒト顆粒球コロニー刺激因子を発現する組み換え大腸菌を培養した後、遠心分離して細胞沈殿物を得る段階と、
(b)(a)段階で得られた細胞沈殿物からヒト顆粒球コロニー刺激因子(hG-CSFs)を含む上清液を分離する段階と、
(c)(b)段階で得られた上清液を酸で処理し、そこから生成された沈殿物を濾過して分離する段階と、
(d)(c)段階で得られた濾液を陽イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階と、
(e)(d)段階で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する段階と、
(f)(e)段階で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用する段階を含む、組み換え大腸菌から高純度のヒト顆粒球コロニー刺激因子を高収率で精製する方法。 - 上記組み換え大腸菌が、大腸菌BL21(DE3)(HM10311;寄託番号:KCCM-10154)、大腸菌BL21(DE3)(HM10410;寄託番号:KCCM-10151)、大腸菌BL21(DE3)(HM10411;寄託番号:KCCM-10152)、および大腸菌BL21(DE3)(HM10510;寄託番号:KCCM-10153)からなる群から選択される1種以上のものである、請求項1に記載の方法。
- (b)段階において、ヒト顆粒球コロニー刺激因子を含む上清液を細胞沈殿物から浸透圧抽出によって分離されるものである、請求項1に記載の方法。
- 上記浸透圧抽出が、細胞沈殿物の10%〜30%のスクロースを含有する緩衝液を処理した後、遠心分離して細胞沈殿物を得て、この細胞沈殿物に蒸留水を添加した後、遠心分離して成されるものである、請求項3に記載の方法。
- (c)段階の酸処理によって上清液のpHが5.0〜5.8に調整されるものである、請求項1に記載の方法。
- (c)段階の酸が、酢酸、リン酸、およびクエン酸からなる群から選択される1種以上のものである、請求項1に記載の方法。
- (d)段階の陽イオン交換クロマトグラフィーが、セファロース(Sepharose)(登録商標)、セファデックス(Sephadex)(登録商標)、アガロース(agarose)、セファセル(Sephacel)(登録商標)、ポリスチレン(Polystyrene)、ポリアクリレート(Polyacrylate )、セルロース(Cellulose)、トヨパール(Toyopearl)(登録商標)からなる群から選択されるカラムを使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (d)段階の陽イオン交換クロマトグラフィーが、SP-セファロースカラム(登録商標)を使用して実施されるものである、請求項7に記載の方法。
- (d)段階の陽イオン交換クロマトグラフィーが、pH4.0〜6.0を維持しながら、塩の濃度が200〜500mMであり、酢酸を含有する緩衝液を使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (d)段階の陽イオン交換クロマトグラフィーが、200〜500mM塩化ナトリウムおよび5〜20mMの酢酸ナトリウムを含むpH5.0〜6.0の緩衝溶液を使用して実施されるものである、請求項9に記載の方法。
- (e)段階の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソアルキル、ネオアルキルおよびオリゴエチレングリコールからなる群から選択された官能基を有するセファロース(登録商標)、バイオゲルA(Bio-Gel A)(登録商標)またはMinileak(登録商標)カラムを使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (e)段階の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ブチル-セファロースカラム(登録商標)を使用して実施されるものである、請求項11に記載の方法。
- ステップ(e)の疎水性相互作用クロマトグラフィーをpH7.0〜8.5を維持しながら、塩の濃度が0〜100mMの緩衝液を使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (e)段階の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、5〜20mMのTrisを含むpH7.0〜8.0の緩衝溶液を使用して実施されるものである、請求項13に記載の方法。
- (f)の陰イオン交換クロマトグラフィーが、Q-セファロース(登録商標)、マクロ-プレップQ(Macro-Prep Q)(登録商標)、Q-ハイパーD(Q-HyperD) (登録商標)およびフラクトゲル(Fractogel) (登録商標)EMD‐TMAE 650からなる群から選択されたカラムを使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (f)段階の陰イオン交換クロマトグラフィーが、Q-セファロースカラム(登録商標)を使用して実施されるものである、請求項15に記載の方法。
- (f)段階の陰イオン交換クロマトグラフィーが、pH6.5〜8.5を維持しながら、塩の濃度が100〜300mMの緩衝液を使用して実施されるものである、請求項1に記載の方法。
- (f)の陰イオン交換クロマトグラフィーが、100〜300mMの塩化ナトリウム、5〜20mMのTrisおよび50〜200mMの尿素を含むpH7.0〜8.0の緩衝溶液を使用して実施されるものである、請求項17に記載の方法。
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