CN109900843A

CN109900843A - 微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法

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Publication number: CN109900843A
Application number: CN201910232317.0A
Authority: CN
Inventors: 张洪昌; 沈根祥; 胡双庆; 郭春霞; 钱晓雍; 李贞金; 王真; 张紫琴
Original assignee: Shanghai Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN109900843B

Abstract

本发明涉及一种微波萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法。该方法为：(1)粪便样品预处理，分别加入17β‑***D₃ 3‑β‑D‑葡糖苷酸、17β‑***硫酸钠‑D₄这两种指示回收率的内标物；再经提取溶剂微波萃取、过滤收集提取液，用水稀释，调pH值；(2)固相萃取富集净化目标***；(3)采用内标法，用液质联用仪定量检测畜禽粪便中7种结合态***。该方法通过对提取方法、富集净化条件、液质检测条件进行优化，同时通过选用合适的内标物，可一次性同时检测出畜禽粪便中7种结合态***的残留情况，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。

Description

微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法

技术领域

本发明属于有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种畜禽粪便中结合态***的检测方法，特别涉及一种微波萃取-固相萃取前处理结合液相色谱串联质谱技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***含量的方法。

技术背景

随着畜禽养殖业向现代化、规模化和集约化的方向快速发展，畜禽养殖污染日益严重，通过畜禽粪便进入环境中的***已超出环境容量。内源类固醇***由畜禽养殖场粪尿进入环境中，微量内源类固醇***便可强烈干扰人类和其他动物的内分泌***，改变机体在发育和成年阶段胞内信号肽过程，从而导致发育、行为和生殖问题。畜禽粪便基质本身是一种复杂的环境样品，有效的样品提取和净化是准确测定其中***含量的前提。因此，一种有效的提取和净化方法对测定畜禽粪便中***含量尤为重要。

样品前处理中常用的提取方法主要有索式萃取法、加速溶剂萃取法、超声萃取法、微波萃取法等。其中，微波萃取法对容器中的溶剂和样品直接进行加热，样品与溶剂可在很短的时间内升高到很高的温度，提高了加热速率，强化了溶剂萃取效率，具有时间短、节省试剂、回收率高等优点，尤其适用于粪便等复杂基质。同时，提取剂的选择对回收率高低有着直接的影响。理想的环境样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，并且能使待测组分与基质有效分离。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HLPC)和高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。HPLC-MS/MS兼具HLPC强的分离能力，同时又具有MS高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质结合态***残留最有效的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。

目前针对畜禽粪便中结合态***的分离富集和共检测尚无一套完整可靠的检测方法，因此，急需一种检测结果稳定、干扰小，能够快速、高效、灵敏、准确，同时检测出畜禽粪便中多种结合态***的方法，包括分离富集和共检测的完整可靠的检测方法。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时测定畜禽粪便中7种结合态***的方法，即一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法。

本发明的技术构思如下：

本发明的方法采用微波萃取结合固相萃取作为畜禽粪便样品的前处理，并以高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)作为检测器，同时测定样品中7种结合态***的含量。选择畜禽粪便中常见的7种结合态***雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-***17-硫酸钾盐(E2-S-K)、BETA-***3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)、雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、17β-***17-β-D葡糖苷酸(E2-G)，采用单因素试验，选择最优的条件，得到最优条件下结合态***的最大萃取率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法，按以下步骤进行：

(1)结合态***的提取：微波萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛的畜禽粪便样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；

所述的指示回收率的内标物为17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)，17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)；

(2)富集净化：固相萃取(SPE)

依次用等体积的甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制样品过柱流速；富集完后，用淋洗液淋洗固相萃取柱，并真空干燥固相萃取柱；再用一定体积的甲醇洗脱目标物，洗脱液再经过甲醇活化过的氨基柱进行净化，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容、超声、过滤后转移至进样瓶，待测；

(3)高效液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中7种结合态***的含量

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测经步骤(2)处理得到的进样瓶内的待测样品中从畜禽粪便中富集到的7种结合态***的含量。所述的7种结合态***分别为雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-***17-硫酸钾盐(E2-S-K)、BETA-***3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)、雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、17β-***17-β-D葡糖苷酸(E2-G)。

进一步的技术方案如下：

步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)，17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)这两种内标物指示回收率。

步骤(1)中，所述的提取溶剂，甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)，即甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液体积比为1:1的甲醇与:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取粪便中的结合态***。

步骤(1)中，粪便样品过筛所用的筛网为孔径0.25mm的筛网。微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜并没有特别的限定，例如孔径可为0.45μm、0.47μm或0.7μm，其目的是去除提取液中残留的粪便，防止后续对富集和检测的影响。

步骤(1)中，稀释后的样品pH值调至3-4，并没有特定的数值要求。

步骤(2)中，富集净化所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂(填料)是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。

步骤(2)中，净化所用的氨基柱为Waters公司NH₂Cartridges柱，它具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过弱阴离子交换(水溶液)或极性吸附(非极性有机溶液)达到保留作用，亦即，该氨基柱的NH₂(氨丙基)键合相在非极性有机溶剂中具有强极性吸附，具有弱阴离子交换保留作用。

步骤(2)中，样品经过固相萃取柱的流速并没有特别的限定。为了保证目标物质在固相萃取柱上充分吸附，样品流经速度(即样品过柱流速)最好不要超过5mL/min。

步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和超纯水用量为5-10mL；活化氨基柱所用的甲醇用量为3-6mL；淋洗固相萃取柱所用的淋洗液依次为低浓度甲醇水溶液、超纯水、体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水各5-10mL；真空干燥的时间在20-30min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min；

步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂溶解、定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样小瓶；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

其中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇中，甲醇与水的比例并没有特别的限定。其目的是洗去固相萃取柱中多余的杂质，但为了防止目标物质同时被洗出的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的比例不要超过10％。

步骤(2)中，用于溶解氮吹后残留物质的有机溶剂，没有特别的限定，可选用甲醇、或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈-水溶液，如：甲醇:水体积比为7:3的甲醇-水溶液，或乙腈:水体积比为8:2的乙腈-水溶液等。

步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱，对7种目标结合态***类物质进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-PackXR-ODSII C18柱型号75mm×2mm，1.0μm。

步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min^-1；流动相A为体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。

步骤(3)中，电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。

本发明的有益效果：

本发明的检测方法，采用微波萃取-固相萃取-高效液相色谱串联质谱技术，通过对提取方法、富集净化条件、液质检测条件进行优化，能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测出畜禽粪便中7种结合态***，大大提高了检测效率，降低了检测成本，并且，检测结果稳定、干扰小。

与现有技术相比，本发明存在的优势是：

1.本发明采用微波萃取法对粪便中的结合态***进行提取。相比于振荡提取，可有效提高萃取效率，减少萃取剂用量，降低萃取时间，提高回收率，达到对目标物质提取的目的。

2.本发明选择Oasis HLB固相萃取柱对7种结合态***进行富集纯化，回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的。

3.本发明用Waters公司NH₂Cartridges柱对7种结合态***进行进一步的净化，去除色素，在上机测试待测样品时能够很好地保护进样口和色谱柱不受污染，延长使用寿命。

4.本方法采用内标标准曲线法对结合态***定量，测定结果线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。

5.本发明采用高效液相色谱串联质谱仪进行定量分析检测，灵敏度高。此外，串联三重四级杆质谱仪根据对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定性分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。

6.本发明的方法将指示回收率的内标物质加在微波萃取前，能够更准确地表示整个前处理过程中结合态***的损失，同时，考虑不同种类的***在前处理过程中有不同程度的损失，对结构相似的***选用同种内标物质指示回收率；本发明中分别选用17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)作为雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-***17-β-D葡糖苷酸(E2-G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)的内标物质，选用17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)作为雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-***3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-***17-硫酸钾盐(E2-S-K)的内标物质，由于内标物质选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。

7.本发明中有机试剂使用量少，环境友好。一次进样可以检测出粪便中的7种结合态***，检测过程耗时少，节约人力物力成本。

附图说明

图1是使用三种不同提取剂测得的牛粪中7种结合态***的加标回收率图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

以下提供一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态***的方法的具体实施方式和内容。

实施例1：加标回收率实验

采用内标法考察本发明的微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术检测方法对畜禽粪便中7种结合态***回收率的影响。加标回收率实验以牛粪为例：分别向粪便中添加100ng、200ng的混合标准液(混合标准液为7种结合态***的混合标准液)。具体按以下步骤实施：

步骤一、畜禽粪便的提取

将采集的粪便冷冻干燥后，研磨并过孔径0.25mm的筛网。设立两组用于对比试验的粪便样品，一组为标准样品组，另一组为空白样品组，每组设两个平行。分别准确称取1.00g的粪便样品于100mL的烧杯中。向标准样品组中分别加入100ng、200ng的结合态***的混合标准溶液(即7种结合态***的混合标准溶液)使添加到粪便中结合态***的最终浓度为100μg/kg、200μg/kg。空白样品组不添加任何结合态***。

每种粪便样品中分别加入100ng的17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)，17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)这两种指示回收率的内标物，与粪便样品充分混合均匀后，放置在通风橱干燥30min。

将烧杯中的粪便样品转移至微波萃取罐中，加入50mL甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为95℃，萃取功率为800W，萃取时间梯度设置为：温度爬升10min、保持60min、降温20min。萃取结束后过滤，收集提取液，用蒸馏水稀释至500mL，调节pH值至3。

步骤二、固相萃取(SPE)前处理：富集净化过程

使用Reeko Fotector Plus全自动固相萃取仪、Oasis HLB固相萃取柱、NH₂Cartridges柱对结合态***富集净化。固相萃取程序如下：对Oasis HLB固相萃取柱，甲基叔丁基醚活化(5mL/min，6mL)，甲醇活化(5mL/min，6mL)，超纯水H₂O活化(5mL/min，6mL)，大体积上样(5mL/min，500mL)；上样结束后，依次用体积浓度为8％的甲醇-水溶液淋洗(5mL/min,6mL)，pH＝3的水淋洗(5mL/min,6mL)，体积比为2:10:88的氨水-甲醇-水淋洗(5mL/min,6mL)；之后，将萃取柱置于真空状态下干燥5min；甲醇洗脱(5mL/min,10mL)；对NH₂Cartridges柱，甲醇活化(5mL/min，6mL)，上样(4mL/min，10mL)，收集上样液，用氮气吹干，得到残渣；用体积浓度为80％的甲醇溶解、定容至1mL，超声5min后，经0.22μmPTFE针式滤器过滤，然后，将溶液样品转移至棕色进样瓶中，待测。

结合态***属于类固醇类物质，属于微极性或非极性物质。本发明中通过实验对比了依次用甲醇、超纯水活化固相萃取柱，以及依次用甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱这两种情况，发现后者对结合态***类物质具有更高的回收率及重复率。本发明中还通过实验对比了分别用体积浓度为12％、8％、5％的甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱这三种情况，发现用体积浓度为8％的甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱，相对回收率较高且能去除部分杂质，再依次用pH＝3的超纯水溶液和体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水溶液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)分别淋洗溶于酸性溶液和碱性溶液中的杂质，可更好地去除样品中的无机盐、大分子物质及色素等杂质。

淋洗固相萃取柱的所用一定比例的甲醇-水溶液中甲醇的比例并没有特别的限定，其目的是洗去保留在固相萃取柱上的杂质成分，但为了防止目标物质同时被淋洗的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的体积浓度比例最好不超过10％。

步骤三、液相色谱串联质谱法测定7种结合态***的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中7种结合态***的含量(浓度)。检测条件如下：

选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对7种目标结合态***类物质进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSIIC18柱型号75mm×2mm，1.0μm。。

液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min^-1；流动相A为体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。

质谱检测条件为：电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。

考虑到不同种类的结合态***结构和性质存在差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)作为雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-***17-β-D葡糖苷酸(E2-G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)的内标物质，选用17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)作为雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-***3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-***17-硫酸钾盐(E2-S-K)的内标物质。

回收率计算：

采用步骤一至步骤二的前处理方法进行前处理，采用步骤三的方法进行定量检测，对牛粪样品进行加标回收率计算(加标的最终浓度为100μg/kg)，计算结果如表1所示。

加标回收率(RE％)的计算公式为：

其中，RE：加标回收率，％；

C0：混合标准液的浓度，ng/mL；

C1：未加入混合标准液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；

C2：加入混合标准溶液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；

V0：混合标准液的体积，mL；

V1：未加入混合标准液的粪便样品上机前定容体积，mL；

V2：加入混合标准溶液的粪便样品上机前定容体积，mL。

由此可见，本发明的方法对7种结合态***的加标回收率在70.5％-115.9％之间，相对标准偏差均低于5％。加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。

表1.牛粪样品中结合态***的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率

采用3种不同的提取溶剂(①甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)，即甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液的体积比为1:1的甲醇与pH＝5的柠檬酸缓冲溶液；②甲醇:EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(V:V＝1:1)，即甲醇:EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的体积比为1:1的甲醇与EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的混合溶液；③甲醇:丙酮(V:V＝1:3)，即甲醇:丙酮的体积比为1:3的甲醇与丙酮的混合溶液)，分别按上述方法进行试验，测得畜禽粪便中7种结合态***的加标回收率，见图1。从图1可看出，采用甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)作提取溶剂，回收率最高，效果最好。因此，在对畜禽粪便中结合态***的实际检测中，可选用甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)作提取溶剂。

实施例2-3：实际粪便样品中***含量测定

7种结合态***物质在不同粪便样品中的浓度的测定

采集上海某牛场的三种不同种类牛的牛粪，先采用本发明步骤一的方法(微波萃取、液-液萃取)进行样品预处理，再采用本发明步骤二的固相萃取方法进行富集净化前处理，之后采用本发明步骤三的液质联用检测方法对样品的实际浓度进行检测分析，以此考察本发明的方法对不同种类粪便样品的适用性。

具体按以下步骤实施：

(1)结合态***的提取：微波萃取

将采集的三种牛粪分别冷冻干燥、粉碎并过0.25mm筛。每种粪便准确称取1.00g样品于100mL微波萃取管内。每种粪便分别加入100ng的17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D₃)，17β-***硫酸钠-D₄(E2-3S-D₄)这两种指示回收率的内标物，与粪便样品充分混合均匀后，放置在通风橱干燥30min。

再加入50mL甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液(V:V＝1:1)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为95℃，萃取功率为800W，萃取时间梯度设置为：温度爬升10min、保持60min、降温20min。萃取结束后过滤，收集提取液，用蒸馏水稀释至500mL，调节pH值至3。

(2)固相萃取(SPE)：富集净化过程

使用Reeko Fotector Plus全自动固相萃取仪、Oasis HLB固相萃取柱、NH₂Cartridges柱对结合态***富集净化。固相萃取程序如下：对Oasis HLB固相萃取柱，甲基叔丁基醚活化(5mL/min，6mL)，甲醇活化(5mL/min，6mL)，H₂O活化(5mL/min，6mL)，大体积上样(5mL/min，500mL)；上样结束后，依次用体积浓度为8％的甲醇-水溶液淋洗(5mL/min,6mL)，pH＝3的水淋洗(5mL/min,6mL)，体积比为2:10:88的氨水-甲醇-水淋洗(5mL/min,6mL)；之后，将萃取柱置于真空状态下干燥5min；甲醇洗脱(5mL/min,10mL)；对NH₂Cartridges柱，甲醇活化(5mL/min，6mL)，上样(4mL/min，10mL)，收集上样液，用氮气吹干，得到残渣；用体积浓度为80％的甲醇溶解、定容至1mL，超声5min后，经0.22μmPTFE针式滤器过滤，然后，将溶液样品转移至棕色进样瓶中，待测。

(3)高效液相色谱串联质谱仪定量检测粪便中7种结合态***的含量

采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中7种结合态***的含量(浓度)；所述的7种结合态***是指雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-***17-硫酸钾盐(E2-S-K)、BETA-***3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)、雌酮3-硫酸钠(E1-3S)。

检测条件如下：

选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱，对7种目标结合态***类物质进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSIIC18柱型号75mm×2mm，1.0μm。

实际检测得到三种粪便中7种结合态***物质含量如表2所示。实验结果表明，本方法可以应用于畜禽粪便中结合态***含量的测定，具有良好的适用性。

表2.三种粪便中7种结合态***的检测含量

注：数据为平均值±标准偏差(n＝3)。

Claims

1.一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测中粪便中7种结合态***的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)结合态***的提取：微波萃取

称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；

所述的指示回收率的内标物为17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸、17β-***硫酸钠-D₄；

(2)富集净化：固相萃取

采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测经步骤(2)处理得到的进样瓶内的待测样品中从畜禽粪便中富集到的7种结合态***的含量；所述的7种结合态***分别为：雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐、17β-***17-硫酸钾盐、BETA-***3-硫酸钠盐、17β-***3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐、雌酮3-硫酸钠、17β-***17-β-D葡糖苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的17β-***D₃ 3-β-D-葡糖苷酸、17β-***硫酸钠-D₄这两种内标物指示回收率。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取溶剂，是甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液体积比为1:1的甲醇与pH＝5的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取粪便中的结合态***；畜禽粪便样品过滤所用的筛网为孔径0.25mm的筛网；微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜孔径为0.45μm、0.47μm或0.7μm；稀释后的样品pH值调至3-4。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和超纯水用量为5-10mL；活化氨基柱所用的甲醇用量为3-6mL；淋洗固相萃取柱所用的淋洗液依次为低浓度甲醇水溶液、超纯水、体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水各5-10mL；真空干燥的时间在20-30min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，富集所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；净化所用的氨基柱为Waters公司NH₂ Cartridges柱，它具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过弱阴离子交换或极性吸附达到保留作用；样品过柱流速不超过5mL/min；活化固相萃取柱的流速不超过5mL/min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂溶解、定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样小瓶；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂为甲醇或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈-水溶液。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱，对7种结合态***进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号75mm×2mm，1.0μm。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min^-1；流动相A为体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。