CN112194695A - 氟达拉滨在制备预防和/或治疗plxna1高表达肿瘤药物中的应用 - Google Patents

氟达拉滨在制备预防和/或治疗plxna1高表达肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了式(I)氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤的药物中的应用，公开了用于制备治疗PLXNA1高表达肿瘤的药物新用途。在体外，抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖，选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤的克隆形成与迁移，选择性促进PLXNA1高表达肿瘤细胞的凋亡与DNA损伤。在体内，选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长。

Description

氟达拉滨在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及氟达拉滨在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤药物中的应用。
背景技术
***癌是老年男性常见的恶性肿瘤，在欧美地区发病率很高，其发病率位列男性恶性肿瘤的第2位，而致死率位列第6位。在我国，***癌发病率从1993年的1.71人/10万男性人口增加到2005年的7.9人/10万男性人口，2008年中国男性***癌发病率为11.00/10万，世界人口标化发病率为6.73/10万。我国***癌的发病率呈现明显持续增长趋势，***癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿系恶性肿瘤。***癌潜伏期较长，很难察觉，一旦发现一般已经发展为晚期***癌。去雄激素治疗是目前***肿瘤的标准治疗方法，且对于大多数***癌有明显疗效。但去雄激素治疗对肿瘤的控制一般仅能维持1.5到4.0年,几乎所有***癌患者最终均转为雄激素非依赖性***癌，进而发展为激素难治性***癌，目前处于无有效治疗药物的状态。
结直肠癌是在男性与女性中发病率与致死率均排名在前三位的癌症。肠癌通常起源于良性肿瘤(以息肉的形式)，随着时间的推移进而发生癌变。根据肿瘤的发展状况，肠癌被分为不同的时期。目前，对于结肠癌Ⅰ期与Ⅱ期的患者，手术治疗是主要的治疗方式。大约三分之二的结肠癌Ⅲ期患者(包括部分结肠癌Ⅱ期患者)，通常会采用手术切除结合化疗的方式来降低复发的风险。对于直肠癌Ⅰ期的患者来说，手术切除占主导地位，有大约三分之一的患者会辅助放化疗进行治疗。当病人处于直肠癌Ⅱ期或Ⅲ期时，化疗结合放疗是最主要的治疗方式。对于肿瘤细胞已形成扩散至肌肉层与浆膜层，并已扩散至临近器官与组织的结直肠癌Ⅳ期患者来说，化疗是最常被采用的治疗手段。近年来，针对转移性结直肠癌，越来越多的靶向药物也在治疗中得到应用。
胰腺癌是一种恶性程度高、诊断和治疗都很困难的恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率近年来明显上升，5年生存率低于5％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌在美国的男性发病率和死亡率分别位列第十位和第四位,女性发病率和死亡率分别位列第九位和第四位。我国胰腺癌的发病率和死亡率也日益上升，严重危害人们健康，而针对胰腺癌的研究正逐渐成为热点。胰腺癌早期不易诊断，发现时多为中晚期，肝脏、***转移率高，既往手术切除率仅为10％～20％。目前针对晚期胰腺癌的治疗方法十分有限，美国FDA批准的抗胰腺癌药物仅包括常规化疗药物：吉西他滨、FOLFIRINOX联合疗法、白蛋白结合型紫杉醇等，但以上药物只能将胰腺癌患者的生存期延长最多9个月。针对晚期胰腺癌，临床上仍处于常规药物有限和靶向药物缺乏的状态。
PLXNA1基因编码的神经丛蛋白A1(Plexin A1)是SEMA3A和SEMA6D(脑信号导向蛋白3A和6D)的受体。PlexinA1与Neuropilin-1/Neuropilin-2(NRP-1/2)结合后，在SEMA3A的刺激下，调节RHO GTP酶，通过调节R-RAS调控整合素、抑制PI3K-AKT信号通路，激活GSK-3β影响细胞骨架的形成，从而调控细胞运动和神经细胞的轴突导向或排斥。有研究者通过对数百例临床***癌患者进行了全基因组和全转录本的深度测序，结果发现在接近17％的肿瘤患者中存在着PLXNA1基因的扩增。功能和临床数据分析表明，PLXNA1的过表达会促进***癌的生长，并且可以作为***癌复发、转移和不良预后的独立预测因子，是一个潜在的***癌标志物和治疗靶标。
发明内容
本发明建立以PLXNA1为潜在标志物或靶标的药物筛选体系，对NMPA(中国国家药品监督管理局)/FDA(美国食品药品监督管理局)批准的抗癌药物库进行筛选，发现氟达拉滨具有选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤的活性。更深入的研究发现，在体外，氟达拉滨抑制PLXNA1高表达***癌、结直肠癌和胰腺癌细胞等的增殖，选择性抑制PLXNA1高表达***癌细胞的克隆形成与迁移，选择性促进PLXNA1高表达***癌、结直肠癌和胰腺癌细胞等的凋亡与DNA损伤；在体内，氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达***癌、结直肠癌和胰腺癌等的生长；机制上，高表达PLXNA1会促使进入体内的氟达拉滨更多地转化和生成为有效抗肿瘤成分三磷酸-氟达拉滨，进而诱导细胞的凋亡与DNA损伤，最终抑制肿瘤细胞的生长。本发明揭示了氟达拉滨体内外抑制PLXNA1高表达肿瘤的功能和机制，有望成为以PLXNA1为筛选标志物的潜在肿瘤个体化治疗药物，具有基础研究与临床应用的双重意义。
本发明的第一个目的是提供一种如式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，
Figure BDA0002122405100000021
式(I)所示的化合物是氟达拉滨，是一种阿糖腺苷的氟化核苷酸类似物，其分子式为C10H12FN5O4，分子量为285.237。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一个目的是提供式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤的药物中的应用。
其中，所述药物用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长、迁移、浸润、克隆、增殖，或促进PLXNA1高表达肿瘤的凋亡。
其中，所述药物在体外用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖，或在体内用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长。
其中，所述抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖是指体外抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞的克隆形成或迁移。
在一个实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外抑制PLXNA1高表达***癌细胞的增殖，并且毒性较低。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3，人***癌细胞PC3M，人***癌细胞C4-2b，人***癌细胞DU145和小鼠人***癌细胞RM-1。
在另一个实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外抑制PLXNA1高表达结直肠癌细胞的增殖，并且毒性较低。其中，所述结直肠癌细胞株指的是人结直肠癌细胞HCT116与人结直肠癌细胞HT29。
在其他实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外抑制PLXNA1高表达胰腺癌细胞的增殖，并且毒性较低。其中，所述结胰腺癌细胞株指的是人胰腺癌细胞PANC1与人胰腺癌细胞Capan2。
在另外的实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外抑制PLXNA1高表达***癌细胞的克隆形成。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3。
在其他实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外抑制PLXNA1高表达***癌细胞的迁移。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3。
本发明还提供了式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物在在制备体外促进PLXNA1高表达肿瘤细胞的凋亡或DNA损伤的药物中的应用。
在一个具体实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外促进PLXNA1高表达***癌、结直肠癌(下拨)和胰腺癌细胞的凋亡。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3，结直肠癌细胞株指的是人结直肠癌细胞HCT116，胰腺癌细胞株指的是人胰腺癌细胞PANC1。
在另一具体实施方案中，其中，所述抑制PLXNA1高表达***癌、结肠癌或胰腺癌的生长，是体外抑制PLXNA1高表达***细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞的克隆形成或迁移，其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3。
在一个实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外促进PLXNA1高表达***癌细胞的DNA损伤。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3。
本发明还提供了式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物在制备体外促进PLXNA1高表达肿瘤细胞凋亡与DNA损伤过程中关键基因的表达的药物中的应用。
在另一实施方案中，式(I)氟达拉滨在体外促进PLXNA1高表达***癌、结肠癌或胰腺癌细胞凋亡与DNA损伤过程中关键基因的表达。其中，所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3，所述细胞凋亡与DNA损伤过程中关键基因指的是γH2AX与PARP。
在上述任一实施方案中，式(I)氟达拉滨能在PLXNA1高表达***癌细胞，结直肠癌细胞和胰腺癌细胞中更多地被转化为抗肿瘤活性化合物。其中所述***癌细胞株指的是人***癌细胞PC3和小鼠***癌细胞RM-1，结直肠癌细胞株指的是人结直肠癌细胞HCT116，胰腺癌细胞株指的是人胰腺癌细胞PANC1，所述抗肿瘤活性化合物为三磷酸-氟达拉滨。
在另一实施方案中，式(I)氟达拉滨在体内能够抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长，并且毒性较低。
本发明还提供了式(I)所示的化合物或其磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物在肿瘤裸鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长中的应用。
在上述任一实施方案中，式(I)氟达拉滨在***癌、结直肠癌或胰腺癌等小鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长，其中所述***癌细胞为小鼠***癌细胞RM-1，结直肠癌细胞株指的是人结直肠癌细胞HCT116，胰腺癌细胞株指的是人胰腺癌细胞PANC1。
在上述任一实施方案中，式(I)氟达拉滨的磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物等同样具有与式(I)氟达拉滨相同的效果。
在上述任一实施方案中，式(I)氟达拉滨或其磷酸酯或药学上可接受的盐，或药物组合物在制备治疗PLXNA1高表达相关恶性肿瘤的药物中的应用。其中，所述抗PLXNA1高表达肿瘤是指抑制PLXNA1高表达的恶性肿瘤细胞的增殖、生长、迁移；所述抗PLXNA1高表达肿瘤是指体外促进PLXNA1高表达肿瘤的凋亡或DNA损伤；所述PLXNA1高表达相关恶性肿瘤包括PLXNA1高表达***癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
本发明还提供了一种预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤的方法，向有需要的个体中施于有效量的如式(I)所示的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或药物组合物。
本发明中，所述肿瘤包括PLXNA1高表达的***癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
技术效果：
本发明应用中，式(I)氟达拉滨在体外和体内具有如下作用：在体外，该药物抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖，抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞克隆形成与迁移，促进PLXNA1高表达肿瘤细胞的凋亡与DNA损伤。在体内，该药物抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长。
另外，本发明通过建立以PLXNA1为潜在标志物或靶标的药物筛选体系，对NMPA(中国国家药品监督管理局)/FDA(美国食品药品监督管理局)批准的抗癌药物库进行筛选，发现氟达拉滨具有选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤的活性。其中，所述PLXNA1高表达相关恶性肿瘤包括PLXNA1高表达***癌、结肠癌与胰腺癌等。
附图说明
图1氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞。
图2氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞的增殖。
图3氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞的克隆形成。
图4氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞的细胞迁移。
图5氟达拉滨选择性诱导PLXNA1高表达细胞的DNA损伤和凋亡。
图6更多氟达拉滨在PLXNA1高表达肿瘤中转化为三磷酸-氟达拉滨。
图7氟达拉滨在小鼠体内选择性抑制PLXNA1高表达***肿瘤生长。
图8氟达拉滨在小鼠体内选择性抑制PLXNA1高表达结直肠肿瘤生长。
图9氟达拉滨在小鼠体内选择性抑制PLXNA1高表达胰腺肿瘤生长。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：式(I)氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞。
技术方法：
1、细胞的培养
实验所用细胞均培养于37℃CO2恒温恒湿培养箱，实验前在显微镜下观察细胞的状态与生长情况，待细胞长满培养体系的90％左右时，进行细胞的传代培养。根据不同细胞类型选择对应的培养基，培养基均添加15％的胎牛血清与1％的青霉素&链霉素双抗。
2、实时荧光定量PCR
按照Trizol试剂盒标准程序提取细胞总RNA。经指定处理的细胞，预冷PBS洗涤后每孔加入Trizol，室温放置数分钟裂解细胞。收集细胞，加入三氯甲烷，颠倒数次，静置，4℃离心。转移上清并加入异丙醇，颠倒数次后室温放置沉淀RNA。随后，4℃离心去除上清，75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，加DEPC处理过的超纯水溶解。按照逆转录试剂盒标准程序反转RNA。每个样品逆转录1μg RNA，体系为：1μg RNA，5X逆转录Mix 2μl(含逆转录酶、随机引物等)，去RNA酶超纯水补齐至20μl。逆转录得到从DNA。荧光实时定量PCR试剂盒标准程序进行实验操作。将得到的cDNA稀释5倍，然后按照如下体系配制反应液：cDNA模板1ul，10×PCRbuffer 2.5ul，正向引物/反向引物各1μl，超纯水补齐至25μl。PCR程序为：94℃4min,94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环数设置为40。
3、慢病毒构建及敲低细胞构建
文献检索选定RNAi序列，PLXNA1-RNAi 1#GAGAAGTCGCTGACACTGT；PLXNA1-RNAi 2#CTGTGATCATCCAGCATGA；PLXNA1-RNAi 3#CGTGGATATGAGTGCCTCT。通过由GV248、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体组成的慢病毒包装体系，获得特异性敲低PLXNA1的病毒。RNAi阴性对照序列为TTCTCCGAACGT GTCACGT。将肿瘤细胞(包括PC3，PC3M，C4-2b，RM-1，HCT116，HT29，PANC1和Capan2)接种到12孔板中，细胞密度达到50％时，吸去原培养基，将2μL慢病毒液，20μL助病毒感染液，1mL新鲜培养基混合后加入细胞中。在培养基中加入1μg/mL嘌呤霉素筛选7天后，挑选单克隆细胞扩大培养。检测细胞中PLXNA1的敲低效率。
4、磺酰罗丹明B(SRB)法测定细胞增殖
取对数期贴壁细胞消化后根据其增殖速度以不同密度接至96孔板。24h后，加入不同浓度式(I)氟达拉滨，对照组加入等量的DMSO，各组设2个复孔。培养48h后，加预冷却的TCA(三氯乙酸，50％，w/V)孵育固定。流水冲洗5遍，风干后，每孔加入50μL SRB染液(4％，w/V)，室温孵育10min染色。1％醋酸洗去未结合染料并风干后，加入10mM Tris溶液100μL，震荡溶解结合的SRB染料。SPECTRA MAX 190酶标仪515nm波长下测定OD值。统计分析药物对于细胞增殖水平的影响。
5、MTS法测定细胞增殖
取对数期悬浮细胞根据其增殖速度以不同密度接至96孔板。24h后，加入不同浓度式(I)氟达拉滨，对照组加入等量的DMSO，各组设2个复孔。培养48h后，加入20μL MTS后室温孵育40min至120min，SPECTRA MAX 190酶标仪490nm波长下测定OD值。统计分析药物对于细胞增殖水平的影响。
实验结果:
如图1所示，本发明分别检测了***癌细胞(22RV1，DU145，PC3和LNCaP)，结肠癌细胞(HCT15，HCT116和HT29)，胰腺癌细胞(PANC28，PANC1，Capan-2，HPAC，BXPC-3和MIAPaca-2)，淋巴瘤细胞(SUDHL6，OCI-ly7，SUDHL4和Farage)，肾癌细胞(786-O，769-P，A498，KETR3，CAKI-1和ACHN)，膀胱癌细胞(T921，BIU-87，T24和J82)，胃癌(SCG-7901，AGS，BGC-823和GES-1)，卵巢癌细胞(MCAS，COV362，SKOV3，H08910PM和IGROV1)中PLXNA1的mRNA表达情况，并检测了式(I)氟达拉滨对其中部分细胞增殖的抑制情况。实验结果表明，式(I)氟达拉滨在***癌、结肠癌和胰腺癌中对PLXNA1高表达的肿瘤细胞具有更好的抑制活性。
如图2所示，本发明分别检测了式(I)氟达拉滨对PLXNA1正常高表达与PLXNA1敲低的***癌细胞(PC3shNC，PC3shPLXNA1；PC3MshNC，PC3MshPLXNA1；C4-2bshNC，C4-2bshPLXNA1；RM-1shNC，RM-1shPLXNA1)，结直肠癌细胞(HCT116shNC，HCT116shPLXNA1；HT29shNC，HT29shPLXNA1)，胰腺癌细胞(PANC1shNC，PANC1shPLXNA1；Capan2shNC，Capan2shPLXNA1)增殖的抑制作用。实验结果表明，式(I)氟达拉滨对PLXNA1自身高表达的***癌、结直肠癌和胰腺癌均有明显的抑制效果，而当PLXNA1被敲低后，均表现出了抑制曲线后移，半数抑制浓度(IC50)升高的情况。这一结果表明式(I)氟达拉滨在***癌、结肠癌和胰腺癌中对PLXNA1高表达的细胞具有更好的抑制活性。
实施例2：式(I)氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达细胞的克隆形成。
技术方法：
1、克隆形成实验
生长状态良好的细胞经消化、计数后，适量接种于6孔板。24h后，吸除原有培养基，加入含有不同浓度式(I)氟达拉滨的培养基，对照组加入等量的DMSO。培养一周后，用4％多聚甲醛溶液固定细胞，随后用0.2％结晶紫染液染色。流水洗除未结合的结晶紫染液，室温自然干燥。显微镜下拍照，计算细胞克隆形成数量。统计分析化合物对细胞克隆形成的影响。
实验结果：
如图3所示，式(I)氟达拉滨浓度梯度地抑制了PLXNA1高表达的PC3shNC细胞克隆形成，而当PLXNA1基因被敲低后，同等剂量的药物处理抑制克隆形成的效果明显减弱(图3A和3B)，而作为对照药物的吡柔比星对PC3shNC和PC3shPLXNA1克隆形成的抑制作用则无明显差异(图3C和3D)。此实验结果证明式(I)氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达细胞的克隆形成。
实施例3：式(I)氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达细胞的细胞迁移。
技术方法：
1、Transwell小室迁移实验
生长状态良好的细胞经消化、计数后，经含有不同浓度式(I)氟达拉滨无血清培养基稀释后，接种入放置于24孔板中的Transwell小室中。下室中加入含有对应浓度度式(I)氟达拉滨和10％血清的完全培养基。24小时后，4％多聚甲醛固定。擦去上室表面未迁移的细胞，2‰的结晶紫中染色。洗净晾干后拍照，统计细胞迁移数及比例。
实验结果：
如图4所示，式(I)氟达拉滨浓度梯度地抑制了PLXNA1高表达的PC3shNC细胞的纵向迁移，而当PLXNA1基因被敲低后，同等剂量的药物处理抑制迁移的效果明显减弱(图4A和4B)，而作为对照药物的吡柔比星对PC3shNC和PC3shPLXNA1迁移的抑制作用则无明显差异(图4C和4D)。此实验结果证明式(I)氟达拉滨对PLXNA1高表达的细胞具有更强的细胞迁移抑制效果。
实施例4：式(I)氟达拉滨选择性促进PLXNA1高表达***细胞的凋亡。
技术方法：
1、流式细胞凋亡实验
取对数期的细胞接种于六孔板中，待细胞贴壁后加入不用浓度的式(I)氟达拉滨。药物处理48h后，离心收集细胞，缓冲液重悬后加入Annexin V和PI染色。室温避光孵育后，补充缓冲液混匀后转移到流式管上机检测。Flowjo软件分析数据，并进行统计学分析。
实验结果：
如图5A，5B和5C的结果所示，式(I)氟达拉滨浓度梯度依赖地分别诱导PLXNA1高表达的PC3shNC,HCT116shNC和PANC1shNC的凋亡，最高浓度时晚期凋亡细胞比例分别达到了17.3％，7.18％和37.4％。而对于PLXNA1被敲低的细胞，最高浓度式(I)氟达拉滨诱导PC3shPLXNA1,HCT116sh PLXNA1和PANC1sh PLXNA1至晚期凋亡的细胞比例分别仅为7.63％，3.02％和23.0％。式(I)氟达拉滨对两类细胞诱导凋亡的情况存在明显差异，这表明了式(I)氟达拉滨选择性促进PLXNA1高表达***细胞的凋亡。
实施例5：式(I)氟达拉滨体外促进PLXNA1高表达***癌细胞的DNA损伤。
技术方法：
1、彗星电泳实验
取对数期的细胞接种于6孔板中，24h后加入不用浓度的式(I)氟达拉滨处理24h，离心收集细胞，用PBS将细胞稀释到10万/mL的悬液。将10万/mL的细胞悬浮液吸50μL和500μL融化的琼脂糖快速混匀滴加在载玻片，使其被均匀覆盖。将载玻片置于4℃冰箱中15min，使其凝固。接着放入裂解液中浸泡60min，使细胞充***解。取出玻片在碱液中洗20min，使细胞DNA发生解螺旋后在冰上21V电泳30min。拿出玻片用蒸馏水清洗2遍，每次5min。用烤片机风干30min，SYBR染色30min。在避光条件下玻片用蒸馏水清洗3遍，每次5min后封片并拍照。
实验结果：
彗星电泳实验是检测DNA损伤的一种经典实验。如图5E和5F的代表图像及统计数据所示，式(I)氟达拉滨处理明显导致了PLXNA1高表达的PC3shNC细胞的DNA损伤，具有更长的彗星拖尾。而当PLXNA1被敲低以后，这种诱导能力被明显减弱。此实验结果表明，式(I)氟达拉滨体外促进PLXNA1高表达***癌细胞的DNA损伤。。
实施例6：式(I)氟达拉滨选择性诱导PLXNA1高表达肿瘤细胞凋亡与DNA损伤关键蛋白的表达。
技术方法：
1、蛋白样品处理
将用药物处理好的细胞从培养箱中取出，显微镜下观察细胞生长密度，根据不同密度决定加入的细胞裂解液量。将培养板中的细胞培养基吸出，加入1mL PBS清洗一遍，将PBS完全吸去后加入RIPA细胞裂解液，包含添加氟化钠(NaF)，正钒酸钠(Na3VO4)，EDTA，EGTA，蛋白酶抑制剂与PMSF等。细胞均匀的刮下并收集到1.5mL离心管中置于冰上。每10min振荡一次，30min后，超声破碎10min，12000g离心15min，取上清至新的EP管中进行蛋白定量。
2、蛋白质免疫印迹实验
将配好的蛋白凝胶置于电泳槽内，加入1×Running Buffer，取出孔梳，每孔上样20-25μL，打开电源跑胶。取出SDS-PAGE胶，切掉多余的部分，放入转膜夹将蛋白从凝胶转印至NC膜。5％的脱脂奶粉室温封闭1小时后，对应抗体4℃孵育过夜。荧光二抗避光孵育1小时后，扫膜成像。
实验结果：
γH2AX表达的上调是DNA损伤的重要标志，PARP蛋白的切割是细胞凋亡的重要标志。如图5G的蛋白质免疫印迹实验结果所示，式(I)氟达拉滨浓度梯度地诱导了PLXNA1高表达的PC3shNC细胞γH2AX的上调，PARP的切割也随药物处理浓度的增加而增多。当PLXNA1被敲低以后，式(I)氟达拉滨对γH2AX表达的上调作用和PARP的切割诱导都明显减弱。此结果表明式(I)氟达拉滨选择性诱导PLXNA1高表达肿瘤细胞凋亡与DNA损伤关键蛋白的表达。
实施例7：式(I)氟达拉滨在PLXNA1高表达肿瘤中转化为三磷酸-氟达拉滨。
技术方法：
1、三磷酸氟达拉滨质谱检测
指定浓度式(I)氟达拉滨处理后的细胞样本，PBS清洗2次，高速离心后弃去上清。沉淀部分用200μl的1M高氯酸溶液重悬，在低温条件下静置15min，离心后取上清50μl加入50μl 1M碳酸氢钠，涡旋后高速离心，取50μl到进样小瓶中作为待测样本。HPLC-MS/MS条件为：流动相A：5mM乙酸铵水溶液，B：甲醇；色谱柱为：waters-C18(100mm×2.1mm,1.7μm)；进样器温度：4℃；进样量：20μL；流速：200μl/min。所采用的质谱仪器为Thermo ScientificTSQ VantageTM(Thermo FisherScientific,San Jose,CA,USA)三重四极杆质谱仪；离子化模式：正负离子模式下的电喷雾电离；喷雾电压：+3.5kV；-3.0kV；雾化温度：350℃；鞘气与辅助气为N2，鞘气压力：30psi；辅助气压力：20psi；毛细管温度：350℃；质谱检测采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)的方法。
实验结果：
三磷酸氟达拉滨是氟达拉滨的主要活性形式，其能直接掺入到DNA链，抑制DNA聚合酶，中止DNA链的延伸，导致DNA链的断裂，将细胞周期阻断在S期并诱导p53依赖途径的细胞凋亡。为此，本发明将***癌细胞(PC3shNC和PC3shPLXNA1)，结肠癌细胞(HCT116shNC和HCT116sh PLXNA1)和胰腺癌细胞(PANC1shNC和PANC1sh PLXNA1)分别暴露于20μM的氟达拉滨2.5小时，8小时和24小时后，收集细胞样品，并通过质谱检测三磷酸氟达拉滨的含量。如图6的实验结果表明，在PLXNA1高表达的PC3shNC，HCT116shNC和PANC1shNC细胞中有更多的氟达拉滨转化为三磷酸氟达拉滨。而当PLXNA1表达降低以后，对应细胞中对应时间点的细胞内三磷酸氟达拉滨含量明显减少。这一结果表明，更多氟达拉滨在PLXNA1高表达肿瘤中转化为三磷酸-氟达拉滨，进而发挥抗肿瘤活性。这是氟达拉滨选择性抑制PLXNA1高表达肿瘤的重要机制。
实施例8：式(I)氟达拉滨在***癌裸鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达***癌的生长。
技术方法：
1、C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型
扩增RM-1 shNC与RM-1 shPLXNA1***癌细胞，将培养好的细胞使用胰酶消化，离心后，弃去上清，PBS洗两遍计数。用PBS重悬细胞，调整细胞密度。提前使用剃毛刀将小鼠背部毛剔除干净。将1×106细胞注射到6～8周C57BL/6雄性小鼠背部皮下。每三天测量肿瘤的长和宽，按照公式：体积＝长×宽2×0.52计算肿瘤体积。待肿瘤长到100mm3左右时，随机分组，每周2次测量并记录小鼠体重以及肿瘤的长与宽。氟达拉滨给药剂量分别为25mg/kg/d，50mg/kg/d和100mg/kg/d。待实验结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，取皮下肿瘤及内脏器官，用于后续实验。
实验结果：
如图7A结果所示，当PLXNA1被敲低以后，RM-1在小鼠皮下所成肿瘤的生长速度减缓，当给予同等剂量同样天数的氟达拉滨后，RM-1shNC组的肿瘤表现出更好的响应，高剂量组肿瘤体积相较于对照组，明显减少，抑制率可达80％(图7B)。而RM-1shPLXNA1组肿瘤对氟达拉滨的响应较弱，即使高剂量组抑制率也仅为40％左右。在实验结束以后对剥离肿瘤的观察及称重，也表明氟达拉滨对PLXNA1高表达的RM-1具有更强的抑制作用(图7E，7F，7G和7H)。以上结果表明氟达拉滨在小鼠体内对PLXNA1高表达***肿瘤具有更强的抑制作用。
实施例9：式(I)氟达拉滨在***癌裸鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达结直肠肿瘤的生长。
技术方法：
1、Balb/c-nude小鼠皮下荷瘤模型
扩增结肠癌细胞HCT116shNC和HCT116shPLXNA1，胰酶消化细胞，离心后，弃去上清，PBS洗两遍，计数后，用PBS重悬细胞，调整细胞密度。将2×106细胞注射到6～8周Balb/cnude雄性小鼠背部皮下。测量肿瘤的长和宽，按照公式：体积＝长×宽2×0.52计算肿瘤体积。待肿瘤长到100mm3左右时，将小鼠随机分组，每周2次测量并记录小鼠体重以及肿瘤的长与宽。氟达拉滨给药剂量分别为25mg/kg/d，50mg/kg/d和100mg/kg/d。待实验结束后，颈椎脱臼法处死小鼠，取皮下肿瘤及内脏器官，用于后续实验。
实验结果：
与在***癌细胞皮下肿瘤模型中的结果一致，氟达拉滨在小鼠体内选择性抑制PLXNA1高表达结直肠肿瘤生长。如图8A，8B，8C和8D所示，PLXNA1基因的敲低也在一定程度上抑制了HCT116肿瘤细胞的小鼠皮下的生长。在PLXNA1高表达的HCT116shNC肿瘤模型中，氟达拉滨浓度梯度依赖地抑制肿瘤生长，高剂量下肿瘤的生长几乎得到完全的抑制。而在PLXNA1被敲低的HCT116shPLXNA1肿瘤中，同等最高剂量的氟达拉滨治疗也只有20％作用的肿瘤抑制率，且不具有统计学上的差异。实验结束后，将肿瘤剥离观察并称重统计，也同样证明氟达拉滨对PLXNA1高表达的结直肠肿瘤具有更强的抑制作用(图8E，8F，8G和8H)。
实施例10：式(I)氟达拉滨在***癌裸鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达胰腺癌的生长。
技术方法：
1、扩增胰腺癌细胞PANC1shNC和PANC1shPLXNA1，参照实施例7的方法构建Balb/c-nude小鼠皮下荷瘤模型并检测氟达拉滨抗肿瘤活性。
实验结果：
与实施例9和实施例10结果一致地，氟达拉滨在小鼠体内选择性抑制PLXNA1高表达的胰腺肿瘤的生长。图9A和图9B所示的结果可见，100mg/kg/d氟达拉滨给药治疗，对PLXNA1高表达肿瘤的抑制率可达80％以上，而对PLXNA1被敲低的PANC1shPLXNA1肿瘤，同剂量的抑制率仅为50％左右。分析实验结束后剥离肿瘤的称重数据，我们也发现氟达拉滨剂量依赖地减少了PLXNA1高表达PANC1shNC肿瘤的质量，分别存在显著和极显著差异。而对于PLXNA1表达被敲低的PANC1shPLXNA1肿瘤，氟达拉滨的显著抑制作用几乎不再存在(图9C，9D，9E和9F)。
上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司
<120> 氟达拉滨在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagaagtcgc tgacactgt 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgtgatcat ccagcatga 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtggatatg agtgcctct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (14)

1.氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述氟达拉滨的结构如式(I)所示：
Figure FDA0002122405090000011
2.一种药物组合物，其含有如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或根据权利要求2所述的药物组合物在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长、迁移、浸润、克隆、增殖，或促进PLXNA1高表达肿瘤的凋亡。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物在体外用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖，或在体内用于抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制PLXNA1高表达肿瘤的增殖是指体外抑制PLXNA1高表达肿瘤细胞的克隆形成或迁移。
7.如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或根据权利要求2所述的药物组合物在制备体外促进PLXNA1高表达肿瘤细胞的凋亡或DNA损伤的药物中的应用。
8.如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或根据权利要求2所述的药物组合物在制备体外促进PLXNA1高表达肿瘤细胞凋亡与DNA损伤过程中关键基因的表达的药物中的应用，其中，所述细胞凋亡与DNA损伤过程中的关键基因指的是γH2AX与PARP。
9.如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或根据权利要求2所述的药物组合物在肿瘤裸鼠皮下荷瘤模型中抑制PLXNA1高表达肿瘤的生长中的应用。
10.如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或根据权利要求2所述的药物组合物在制备预防和/或治疗PLXNA1高表达相关的恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗PLXNA1高表达肿瘤是指抑制PLXNA1高表达的恶性肿瘤细胞的增殖、生长、迁移；其中，所述恶性肿瘤包括PLXNA1高表达的***癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
12.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗PLXNA1高表达肿瘤是指体外促进PLXNA1高表达肿瘤的凋亡或DNA损伤；其中，所述恶性肿瘤包括PLXNA1高表达的***癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
13.如权利要求3-11之任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括PLXNA1高表达的***癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤。
14.一种预防和/或治疗PLXNA1高表达肿瘤的方法，其特征在于，向有需要的个体中施于有效量的如权利要求1所述的氟达拉滨或其磷酸酯或其药学上可接受的盐、或如权利要求2所述的药物组合物。
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