CN112190767B - 一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料及其制备方法。该材料以pMBA‑AuNCs团簇作为基本构成单元，然后酸化溶液得到配体末端羧基完全质子化的pMBA‑AuNCs团簇甲醇溶液；加入IVB族四价离子的盐溶液，得到混合溶液；最后向混合溶液中加入Cu2+溶液得到纳米抗菌涂层材料。本发明提供的一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料调控团簇表面配体的性质，表面配体与金属离子通过配位作用在金属内植物表面自组装形成三维周期性网状薄膜结构，并表现出了优异的体内外抗生物膜活性，提出预防生物膜与控制感染一体化治疗理念，为临床治疗内植物相关感染提供新的思路。

Description

一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及金属内植物抗菌涂层领域，尤其涉及一种基于纳米金团簇的纳米 抗菌涂层材料及其制备方法。
背景技术
生物膜(biofilm)为细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)所包裹形成的微生物细胞聚集体。微生 物在材料表面附着并形成生物膜是一个复杂的动态过程，涉及多种生理机制，受 多重因素影响。大量研究表明细菌的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关，亦 与致病菌在体内形成生物膜有关。生物被膜使细菌对抗生素的耐药性比浮游菌增 加10-1000倍。临床上生物膜可形成于各种医学内植物上，具有极强的耐药性及 免疫逃避性，是造成临床性感染的主要原因之一。
纯钛(Ti)及钛合金因其本身所具有的优异的生物安全性和机械性能，在骨 科、整形外科和牙科领域作为金属植入物应用广泛，其表面生物膜的形成是导致 植入物感染的重要原因，一旦形成生物膜，膜内的细菌表现出对抗生素和宿主防 御的高度抵抗力，也就是高耐药性。例如，骨科植入物相关骨感染主要致病菌为 金黄色葡萄球菌(金葡菌)、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等，其中金葡菌占50％ 以上，耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)较 为常见。抑制这些金属内置材料表面的细菌成膜对于保证人体健康具有重要的临 床需求，目前针对金属植入物感染较为理想的解决方法是使金属内植物表面具有 抗菌功能，从而抑制或减少生物被膜的形成。常用的方法是在金属内植物表面进 行改性成为抗菌涂层。临床上的抗菌涂层主要为释药涂层，在涂层上载入抗菌剂， 通过其释放杀灭周围细菌。抗菌剂包括：①有机抗菌剂如抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)、抗生素、防腐剂等；②无机抗菌剂有银(Ag)、铜(Cu)、 锌(Zn)、铋(Bi)、氯(Cl)、碘(I)、氟(F)等。
上述的主动释药抗菌涂层抗菌力强，但难以控制药物的释放速度和量，其初 期突释效应会使局部浓度较高，产生细胞毒性，且难以维持长期抗菌活性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于纳米金团簇的纳米 抗菌涂层材料及其制备方法，以pMBA-AuNCs团簇作为基本构成单元，通过与 多种功能性金属离子原位自组装形成具有三维网状结构的纳米金属氧化物材料 (MM-MONs)，将有助于阐明弱的非共价相互作用在整体协调特性中的作用。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料的制备 方法，包括如下步骤：
步骤一，用新鲜配置的HAuCl4与对巯基苯甲酸(pMBA)溶液先后加入到超 纯水中，搅拌得到白色Au(I)-pMBA络合物；
步骤二，加入NaOH溶液使白色Au(I)-pMBA络合物溶解，然后加入NaBH4溶液，室温继续搅拌2-4h后，超滤管收集浓缩得到pMBA-AuNCs团簇水溶液；
步骤三，取上述pMBA-AuNCs团簇水溶液于离心管中，加入HCl使配体的 pMBA分子完全质子化，pMBA-AuNCs团簇将从水溶液析出，离心收集并去除 上清液中的多余的HCl和NaCl，并用超纯水清洗两次，室温干燥后加入甲醇溶 解，得到配体末端羧基完全质子化的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液；
步骤四，向步骤三得到的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液中加入IVB族四价离 子的盐溶液，然后超声波处理5-10min得到混合溶液；
步骤五，向混合溶液中加入Cu2+的盐溶液，然后超声波处理5-10min得到 pMBA-AuNCs团簇与金属离子甲醇混合溶液，即该纳米抗菌涂层材料。
进一步地，上述HAuCl4与pMBA的摩尔比为1:2。
进一步地，步骤四中的IVB族四价离子为Ti4+、Zr4+或Hf4+。
进一步地，pMBA-AuNCs团簇与IVB族四价离子的摩尔比为1:10。
进一步地，上述盐溶液为盐酸盐溶液。
进一步地，上述IVB族四价离子与Cu2+的比例为1：(1～2)。
进一步地，步骤四和步骤五中的超声处理时间为5min。
本发明的第二方面是提供上述制备方法制备的基于纳米金团簇的纳米抗菌 涂层材料。
本发明的第三方面提供了上述纳米抗菌涂层材料在制备抗菌纳米涂层中的 应用。
本发明的第四方面提供了采用上述纳米抗菌涂层材料制备抗菌纳米涂层的 方法，将纳米抗菌涂层材料均匀滴加到干燥的钛片上，室温干燥后形成抗菌纳米 涂层。
进一步地，钛片在使用前采用强酸氧化法处理表面：抛光处理后的钛片经置 于30％的H2O2和H2SO4体积比为1:1的混合溶液中，氧化处理10-15min，表面 形成富含羟基的TiO2薄层；最后用大量清水清洗，放入无水乙醇中备用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料调控团簇表面配体 的性质，表面配体与金属离子通过配位作用在金属内植物表面自组装形成三维周 期性网状薄膜结构，并表现出了优异的体内外抗生物膜活性，提出预防生物膜与 控制感染一体化治疗理念，为临床治疗内植物相关感染提供新的思路。
附图说明
图1为本发明一实施例中制备纳米抗菌涂层的流程图；
图2为本发明一实施例中pMBA-AuNCs团簇的电镜扫描图；
图3为本发明一实施例中制备纳米抗菌涂层的性能表征测定结果；其中：图 a为各种纳米抗菌涂层的表面形貌图；图b为获得了完全质子化的GNCS、 Ti-MONS、Zr-MONS和Hf-MONS薄膜的高分辨率O1sXPS谱以及相应的高分 辨率Ti2p、Zr3d和Hf4fXPS谱；图c为在铜网TEM网格中形成的Zr-Cu MONS 薄膜的O、S、Au、Zr、Cu的HAADF-STEM图像和EDX元素做图；
图4为本发明一实施例中Zr-Cu MONs涂层的体外抗菌实验结果；其中：图 a为不同浓度铜离子构建的Zr-Cu MONs体外抗MRSA粘附情况；图b为不同浓 度铜离子构建的Zr-CuMONs体外与MRSA共培养对其生长影响情况；图c、d 为不同浓度铜离子构建的Zr-Cu MONs体外抗MRSA粘附代表性CFU计数涂板 及SEM结果图；
图5为本发明一实施例中Ti-Cu MONs涂层的体外抗菌实验结果；其中：图a为琼脂平板上细菌菌落的代表性照片；图b为涂有Ti-Cu Mons膜并接种MRSA 细菌悬液的植入物的统计直方图；图c为不同Ti/Cu共混比的Ti-Cu MONS涂层 对MRSA增殖的影响；
图6为本发明一实施例中Hf-Cu MONs涂层的体外抗菌实验结果；其中：图 a为琼脂平板上细菌菌落的代表性照片；图b为涂有Hf-Cu Mons膜并接种MRSA 细菌悬液的植入物的统计直方图；图c为不同Hf/Cu共混比的Hf-Cu MONS涂 层对MRSA增殖的影响；
图7为本发明一实施例中Zr-Cu MONs涂层的体内抗菌实验结果；其中：图 a显示MRSA在大鼠皮下内植物感染模型中植入体表面及组织残留细菌减少的 示意图；图b显示放置在大鼠体内的钛片图，比例尺＝20毫米；图c显示不同植 入物表面CFU计数的统计结果；图d显示植入体周围组织CFU计数的相应统计 结果；图e显示植入物周围组织的H&E染色，比例尺＝150μm；图f显示无涂层 组和不同Cu/Zr比例涂层组大鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)H&E染色切 片，比例尺＝200μm；***表示与未涂膜组比较p<0.001。
具体实施方式
本发明提供的一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料以pMBA-AuNCs团 簇作为基本构成单元，通过与多种功能性金属离子原位自组装形成三维网状结 构，将有助于阐明弱的非共价相互作用在整体协调特性中的作用。参与构建薄膜 的第一种类型金属离子(四价离子Zr4+、Ti4+、Hf4+)与团簇可以形成稳定的化学 配位作用，第二种类型金属离子(Cu2+)具有溶出抗菌性，但与团簇的配位作用 较弱，将两种类型的金属离子共同参与团簇的配位，有利于合理利用两者的优点， 开发出兼具化学稳定性和抗菌离子溶出性的薄膜涂层，不仅降低了细胞毒性，也 不易产生耐药性。
该基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，用新鲜配置的HAuCl4与对巯基苯甲酸(pMBA)溶液先后加入到超 纯水中，搅拌得到白色Au(I)-pMBA络合物；
步骤二，加入NaOH溶液使白色Au(I)-pMBA络合物溶解，然后加入NaBH4溶液，室温继续搅拌2-4h后，超滤管收集浓缩得到pMBA-AuNCs团簇水溶液；
步骤三，取上述pMBA-AuNCs团簇水溶液于离心管中，加入HCl使配体的 pMBA分子完全质子化，pMBA-AuNCs团簇将从水溶液析出，离心收集并去除 上清液中的多余的HCl和NaCl，并用超纯水清洗两次，室温干燥后加入甲醇溶 解，得到配体末端羧基完全质子化的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液(GNCS)；
步骤四，向步骤三得到的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液中加入IVB族四价离 子的盐溶液，然后超声处理5-10min得到混合溶液；
步骤五，向混合溶液中加入Cu2+的盐溶液，然后超声处理5-10min得到 pMBA-AuNCs团簇与金属离子甲醇混合溶液，即该纳米抗菌涂层材料 MM-MONs。
在本发明一优选的实施例中，上述HAuCl4与pMBA的摩尔比为1:2。
在本发明一优选的实施例中，步骤四中的IVB族四价离子为Ti4+、Zr4+或Hf4+。
在本发明一优选的实施例中，pMBA-AuNCs团簇与IVB族四价离子的摩尔 比为1:10。
在本发明一优选的实施例中，上述盐溶液为盐酸盐溶液。
在本发明一优选的实施例中，上述IVB族四价离子与Cu2+的比例为1：(1～2)； 更优选地为1:2。准确而言，在一定比例范围内，Cu2+的比值越大，该材料制备 的涂层抗菌效果更好。
在本发明一优选的实施例中，步骤四和步骤五中的超声处理时间为5min。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
参考图1，本实施例提供一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层，其制备方法 包括如下步骤：
(1)钛片的处理
选取直径1cm、厚度为0.5mm的钛合金圆片作为金属植入物的代表，在水 环境下，利用碳化硅水砂纸(320,400,600,800,1000或1200目)抛光钛片表面 至无明显划痕，依次放入丙酮、无水乙醇和去离子水中用超声波清洗机各清洗10min，最后浸泡于无水乙醇中备用。然后，钛片的表面采用强酸氧化法处理， 具体步骤为：抛光处理后的钛片经置于H2O2(30％)/H2SO4体积比为1:1的混合 溶液中，氧化处理10-15min，表面形成富含羟基的TiO2薄层。最后用大量清水 清洗，放入无水乙醇中备用。
(2)配体羧基完全质子化的pMBA-AuNCs团簇的制备
步骤一，将新鲜配置的1.25mL HAuCl4(20mM)与5mL对巯基苯甲酸(10 mM)溶液先后加入到10mL超纯水中，搅拌5min。随后加入1.5mL 1M NaOH 溶液使白色Au(I)-pMBA络合物溶解，然后加入0.5mL新鲜配置的112mM NaBH4溶液,室温继续搅拌3h。反应完成后，超滤管收集浓缩材料pMBA-AuNCs 团簇，其pMBA配体末端羧基处于质子化(-COOH)和去质子化(-COO-)共存 的状态。
步骤二，取上述pMBA-AuNCs团簇水溶液5mL(2mg/mL)于离心管中， 加入约5mL 1MHCl，配体的pMBA分子完全质子化，pMBA-AuNCs团簇将从 水溶液析出，离心收集并去除上清液中的多余的HCl和NaCl，并用超纯水清洗 两次，最后室温干燥后加入甲醇溶解，得到配体末端羧基完全质子化的 pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液(GNCS)(其电镜扫描图如图2所示)。
(3)pMBA-AuNCs团簇与金属离子甲醇混合溶液的制备
步骤一，取上步骤准备的2mg/mL的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液1mL于离 心管中，分别加入一定量的甲醇配制的TiCl4、ZrCl4和HfCl4溶液，pMBA-AuNCs 团簇与Ti4+、Zr4+、Hf4+的摩尔比均分别为1:10，将上述混合溶液超声处理5min 备用。
步骤二，向超声处理后的混合溶液中加入CuCl2溶液，然后超声处理5min 便制备得M-Cu MONs溶液。
(4)抗菌纳米涂层的制备
用移液器分别吸取0.15mL M-Cu MONs溶液均匀滴加到处理后的干燥的钛 片上(drop-casting)，室温干燥，形成肉眼可见的均匀薄膜，获得pMBA-AuNCs 团簇与金属离子通过配位键形成的纳米涂层改性的钛片。薄膜的浓度可以通过调 节溶液的浓度和滴加的液体量调节。
验证实施例1
本实施例对基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层的性能进行研究，为方便涂层性 质的表征，采用表面同样富含羟基的硅片代替钛片制备薄膜涂层，然后进行测试。 具体的实验步骤和结果如下：
1.将GNCS-Ti、GNCS-Zr和GNCS-Hf悬浮液沉积在硅片表面(5mm×5 mm)，PMBA：M4+＝1：1，分别形成Ti-、Zr-和Hf-MON，制备了用于SEM表征 的样品。用扫描电镜(SEM，TescanMAIA3)在5kV的加速电压下对薄膜的表 面形貌进行了研究，结果如图3a所示，形成的涂层形貌规整，厚度在100-200nm 之间。
2.X射线光电子能谱利用配备单色Al Kα(1486.6eV)源的Krato Axis Ultra DLD仪器对GNCs膜和Ti、Zr或Hf-MONs膜的化学状态进行了X射线光电子能谱 研究。用C1S在284.8eV处对光谱进行了标定。将悬浮液沉积在硅片表面(5mm×5 mm)，pMBA：M4+：Cu2+＝1：1：1，制备样品，在超纯水中透析1d去除未配位 的金属离子，结果如图3b所示。
3.透射电子显微镜研究了MM-MONS薄膜的高角环状暗场(HAADF)扫描 透射电子显微镜(STEM)图像，用FEI Talos F200X G2 S/TEM在200kV工作。 利用集成的Super-XEDS探测器对MM-MONS薄膜的元素图谱进行了研究。将 GNCs、MCl4(M＝Ti、Zr、Hf)和CuCl2在乙醇中的混合物(约4μL)沉积到涂 有碳膜的铜网TEM网格(Cu，300目)上，使其在空气中蒸发，形成MM-MONS 薄膜，用于HAADF-STEM测量和元素图谱，结果如图3c所示。
验证实施例2
本实施例以MRSA作为模式菌株，对纳米涂层的体外抗菌性能进行研究， 具体的试验方法和结果如下：
(1)细菌培养
挑取绵羊血琼脂(SBA)平板上的MRSA单克隆菌落浸泡在5mL新鲜的胰蛋 白酶大豆肉汤(TSB)培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养至对数生长期 中期。然后将得到的菌悬液在TSB(pH 7.4)中根据悬浮液在600nm处的光密度 (OD600)稀释到1～2×106CFU/mL备用。
(2)涂层表面形成MRSA生物膜能力评价
将未经处理的钛片(对照组)和实施例1中制备的3种类型纳米薄膜抗菌涂 层钛片(实验组)置于24孔板中，每组5个复孔，含有涂层的为正面朝上，用 微量加样器吸取1mL上步骤MRSA菌液加入24孔板中，置于37℃恒温箱中培 养24h，随后用PBS轻柔漂洗钛片三次，去除未黏附细菌，然后置于离心管中超 声震荡1min，使黏附于钛片上的细菌分散于PBS溶液中，稀释100倍后取100μL 涂于培养板上，放入37℃恒温箱中培养24h，菌落计数并拍照。
钛片涂层表面形成的MRSA生物膜通过抗菌率和黏附率进行评价：抗菌率 ＝(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数×100％；黏附率＝实验组菌落 数/对照组菌落数×100％。
(3)涂层表面MRSA生物膜SEM观察
实验组和对照组的M-Cu MONs钛片与细菌共培养方法同上步骤，培养6小 时后，用移液器吸弃培养液并用PBS轻柔漂洗钛片三次，各加入2mL2.5％戊二 醛于4℃固定过夜，再依次用PBS溶液轻柔漂洗，乙醇梯度脱水(30％、50％、 70％、80％、90％、100％、100％)，每次15min，最后进行真空干燥、喷金、 扫描电镜观察，结果如图4-6所示。
由图4-6可知，制备的M-Cu MONs钛片具有良好的抗菌性能，且M4+与Cu2+在一定的比例范围内，Cu2+的含量越高，抑菌能力越好。
验证实施例3
本实施例采用大鼠皮下内植物相关感染动物模型对实施例1提供的纳米涂 层的体内抗菌性能进行研究。
其中，大鼠皮下内植物相关感染模型研究由上海交通大学附属第六人民医院 动物研究委员会批准。采用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(200±10g)用于植 入物相关感染模型，所有大鼠饲养于SPF环境中。具体的试验方法和结果如下：
用3％戊巴比妥钠溶液(1mL/kg)麻醉后，用剃刀将大鼠背部毛发脱去，然 后在无菌条件下用手术刀在背部制作直径1cm的全层皮肤切口，立即将覆盖有 Zr-Cu MONs涂层的钛片植入每只大鼠的背部皮下(如图7b)。植入后，将70μL 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌混悬液(1×107CFU/mL)接种于植入物表面。之后， 将皮肤逐层缝合。造模日期定为第0天，整个实验时间为1周，在第1、3和7 天，将植入物和植入物周围组织进行细菌计数。同时固定并包埋植入物周围部分 组织和重要器官(心、肝、脾、肺、肾)进行H&E染色，结果如图7所示。
由图7c-7f可知，制备的Zr-Cu MONs钛片具有良好的抗菌性能，且Zr4+与Cu2+在一定的比例范围内，Cu2+的含量越高，抑菌能力越好。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不 限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的 等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围 下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，用新鲜配置的HAuCl4与pMBA溶液先后加入到超纯水中，搅拌得到白色Au(I)-pMBA络合物；
步骤二，加入NaOH溶液使所述白色Au(I)-pMBA络合物溶解，然后加入NaBH4溶液，室温继续搅拌2-4h后，超滤管收集浓缩得到pMBA-AuNCs团簇水溶液；
步骤三，取所述pMBA-AuNCs团簇水溶液于离心管中，加入HCl使配体的pMBA分子完全质子化，pMBA-AuNCs团簇将从水溶液析出，离心收集并去除上清液中的多余的HCl和NaCl，并用超纯水清洗两次，室温干燥后加入甲醇溶解，得到配体末端羧基完全质子化的pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液；
步骤四，向步骤三得到的所述pMBA-AuNCs团簇甲醇溶液中加入IVB族四价离子的盐溶液，然后超声处理5-10min得到混合溶液；
步骤五，向混合溶液中加入Cu2+的盐溶液，然后超声处理5-10min得到pMBA-AuNCs团簇与金属离子甲醇混合溶液，即所述纳米抗菌涂层材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中所述的IVB族四价离子为Ti4 +、Zr4+或Hf4+。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中所述pMBA-AuNCs团簇与IVB族四价离子的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述盐溶液为盐酸盐溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述IVB族四价离子与Cu2+的比例为1：(1～2)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四和步骤五中的超声处理时间为5min。
7.一种如权利要求1-6任一项所述制备方法制备的基于纳米金团簇的纳米抗菌涂层材料。
8.如权利要求7所述的纳米抗菌涂层材料在制备抗菌纳米涂层中的应用。
9.一种采用如权利要求7所述的纳米抗菌涂层材料制备抗菌纳米涂层的方法，其特征在于，将所述纳米抗菌涂层材料均匀滴加到干燥的钛片上，室温干燥后形成抗菌纳米涂层。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述钛片在使用前采用强酸氧化法处理表面：抛光处理后的钛片经置于30％的H2O2和H2SO4体积比为1:1的混合溶液中，氧化处理10-15min，表面形成富含羟基的TiO2薄层；最后用大量清水清洗，放入无水乙醇中备用。
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