CN112175934A - 一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料及其制备方法和应用，涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种微生物材料及其制备方法和应用。是要解决现有直接投加耐盐脱氮菌剂的方法存在脱氮效果维持时间短的问题。该微生物材料由菌悬液、外加碳源和包埋剂制成。方法：步骤一：外加碳源的改性；步骤二：菌悬液的制备；步骤三：微生物材料的包埋制备。本发明微生物材料具有高效的耐盐脱氮能力，能够在盐胁迫条件下高效去除废水中氮素污染物。此外，本发明微生物材料含有丰富的外加碳源，可以弥补碳源不足问题，为盐胁迫环境中微生物提供生长所需的营养物质，促进***中反硝化细菌的生长和代谢。本发明应用于含盐水体的脱氮处理。

Description

一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种微生物材料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着我国工业规模的不断增大，工业用水量激增。同时，产生废水量也迅速增大，给当前的废水处理与回收利用技术带来了巨大的挑战。在排放的废水中，含盐废水成为不可忽视的一类，此类废水越来越受关注。其中，氮含量高的含盐污水常常造成水体的富营养化，对其中动植物的正常生存造成影响，威胁生态平衡。在许多国家，富营养化是水体污染的主要问题。因此，含盐污水的处理，特别是含盐污水的脱氮成为亟需解决的问题。
人工湿地作为一种低成本、高效节能、无二次污染的水处理技术，在净化水体方面得到了广泛的应用。但含盐废水不仅污染物成分复杂，而且含有大量可溶性无机盐，高盐度会抑制人工湿地中微生物的生长和代谢，导致人工湿地对废水中污染物的去除能力受到限制。在盐胁迫下，湿地中存在一些具有一定耐盐性的固有微生物能够存活并逐渐被驯化，成为人工湿地中的优势菌群，而其它耐盐性较低的微生物逐渐被淘汰。耐盐微生物在盐胁迫环境中具有复杂的耐盐机理，能在大范围的盐度环境中正常生长和代谢，对多种污染物具有高效降解能力。尽管在人工湿地中驯化出了固有耐盐微生物，但这些耐盐微生物在净化水体方面的贡献较低。即湿地中固有微生物脱氮效率低下，无法满足人工湿地中净化水体的需求。
利用外源微生物强化技术可以提高人工湿地在盐胁迫下的净化功能。而耐盐脱氮菌剂的直接投加仅能维持短期的强化效果，这主要由于外源微生物在人工湿地中无附着点，易随废水流失。
发明内容
本发明是要解决现有直接投加耐盐脱氮菌剂的方法存在脱氮效果维持时间短的问题，提供一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料及其制备方法。
本发明具有耐盐脱氮能力的微生物材料，由菌悬液、外加碳源和包埋剂制成。其中所述菌悬液中的菌株为别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2。
进一步的，所述别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2(GenBank accession no.MN396708)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019 年3月25日，保藏编号为CGMCC No：17433。
进一步的，所述外加碳源为经NaOH溶液改性后的玉米芯粉。
进一步的，所述包埋剂是由聚乙烯醇和海藻酸组成的，聚乙烯醇和海藻酸的质量比为 5:1。
本发明还提供上述耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：外加碳源的改性
选择玉米芯粉作为外加碳源，将玉米芯粉溶于NaOH溶液中，在温度为90～95℃的水浴锅内进行加热处理，加热处理同时进行不断搅拌；加热处理后，使用蒸馏水依次进行冲洗和浸泡，反复三次，第三次浸泡过程中调节pH至中性，然后再清洗一次；最后烘干，得到改性玉米芯粉；
步骤二：菌悬液的制备
对别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2进行富集培养，待培养基出现浑浊并产生气体后作为富集种子菌液；以5％(v/v)的接种量将富集种子菌液接种于反硝化培养基中，置于 30～32℃恒温密封静置培养5～7d；最后将培养液进行离心，得到浓缩的菌体细胞，用无菌水稀释混匀后，得到菌悬液；
步骤三：微生物材料的包埋制备
向步骤二得到的菌悬液中加入包埋剂和改性玉米芯粉，混合均匀，不断搅拌，调节pH为10，得到混合液；然后将混合液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，将凝胶颗粒于室温放置6～8h后，用无菌水冲洗2～3次，即得到微生物材料。
进一步的，步骤一中玉米芯粉和NaOH溶液的质量比为1:(29～31)。所述NaOH溶液的质量浓度为1％。
进一步的，步骤一中所述加热处理的时间为1～1.2h。
进一步的，步骤一中烘干的温度为70～75℃。
进一步的，步骤一中得到的改性玉米芯粉于室温下置于干燥皿中存放。
进一步的，步骤二中富集培养的条件为30～32℃恒温密封静置培养。
进一步的，步骤二中反硝化培养基的成分为：CH3COONa，5g/L；K2HPO4，1g/L；NaNO2，0.8g/L；CaCl2，0.03g/L；Na2CO3，1g/L；FeSO4·7H2O，0.06g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；pH＝10。
进一步的，步骤二中离心的转速为4000～6000rpm，离心时间为15～20min。
进一步的，步骤二中菌悬液的浓度为1.5～2g浓缩的菌体细胞/L，即每升菌悬液中含有1.5～2g离心得到的浓缩的菌体细胞。
进一步的，步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的质量比为3:1。
进一步的，步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的总质量与菌悬液的体积比为160g:1L。
进一步的，步骤三中滴加的具体方法为用射器针头将混合液滴加到质量浓度为4％的 CaCl2溶液中，边滴边摇晃。
上述耐盐脱氮能力的微生物材料在含盐水体脱氮中的应用。
进一步的，所述微生物材料在含盐水体中的投加量为50g/L。
进一步的，所述含盐水体的含盐条件为EC＝15mS/cm。
本发明的有益效果：
本发明提供一种微生物材料(菌粒)，由外加碳源与目标菌种联合固定化制成，可提高目标菌种的环境适应能力，避免菌体流失。本发明提供所制备的微生物材料在人工湿地中的实际投加应用，发现本发明微生物材料能够有效提高人工湿地在盐胁迫下对氮素污染物的去除能力。这类具有耐盐脱氮能力的微生物材料既具有高效耐盐脱氮菌的生理生化特性和代谢机理，又可为人工湿地中微生物的生长代谢提供外加碳源，能够较好的解决上述人工湿地在处理含盐废水中存在的难题。
本发明微生物材料具有高效的耐盐脱氮能力，能够在盐胁迫条件下高效去除废水中氮素污染物。此外，本发明微生物材料含有丰富的外加碳源，可以弥补碳源不足问题，为盐胁迫环境中微生物提供生长所需的营养物质，促进***中反硝化细菌的生长和代谢。本发明微生物材料制作成本低廉、操作简单、脱氮效果好。
本发明微生物材料在含盐废水(EC＝15mS/cm，NaCl浓度约为8g/L)中发挥重要作用，可高效去除废水中氮素污染物。其中，在5％(m/v)接种量下，含盐废水中氨氮、硝氮和总氮去除率分别为74.61％、97.65％和47.63％。
本发明微生物材料在盐胁迫下提高人工湿地脱氮能力。具体表现为，在添加本发明微生物材料30日后，人工湿地对含盐废水中总氮的去除率在90％以上，显著高于同期直接投加菌剂的处理组(80％左右)。
附图说明
图1为本发明微生物材料包埋法固定化后的形态；
图2为不同时间测定的氨氮浓度；
图3为不同时间测定的硝氮浓度；
图4为不同时间测定的总氮浓度。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式具有耐盐脱氮能力的微生物材料，由菌悬液、外加碳源和包埋剂制成。其中所述菌悬液中的菌株为别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2。
所述别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2(GenBank accession no.MN396708)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年3月25日，保藏编号为CGMCC No：17433。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述外加碳源为经NaOH 溶液改性后的玉米芯粉。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述包埋剂是由聚乙烯醇和海藻酸组成的，聚乙烯醇和海藻酸的质量比为5:1。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：外加碳源的改性
选择玉米芯粉作为外加碳源，将玉米芯粉溶于NaOH溶液中，在温度为90～95℃的水浴锅内进行加热处理，加热处理同时进行不断搅拌；加热处理后，使用蒸馏水依次进行冲洗和浸泡，反复三次，第三次浸泡过程中调节pH至中性，然后再清洗一次；最后烘干，得到改性玉米芯粉；
步骤二：菌悬液的制备
对别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2进行富集培养，待培养基出现浑浊并产生气体后作为富集种子菌液；以5％(v/v)的接种量将富集种子菌液接种于反硝化培养基中，置于 30～32℃恒温密封静置培养5～7d；最后将培养液进行离心，得到浓缩的菌体细胞，用无菌水稀释混匀后，得到菌悬液；
步骤三：微生物材料的包埋制备
向步骤二得到的菌悬液中加入包埋剂和改性玉米芯粉，混合均匀，不断搅拌，调节pH为10，得到混合液；然后将混合液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，将凝胶颗粒于室温放置6～8h后，用无菌水冲洗2～3次，即得到微生物材料。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中玉米芯粉和NaOH溶液的质量比为1:(29～31)。所述NaOH溶液的质量浓度为1％。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中所述加热处理的时间为1～1.2h。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中烘干的温度为 70～75℃。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤一中得到的改性玉米芯粉于室温下置于干燥皿中存放。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二中富集培养的条件为30～32℃恒温密封静置培养。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二中反硝化培养基的成分为：CH3COONa，5g/L；K2HPO4，1g/L；NaNO2，0.8g/L；CaCl2，0.03g/L；Na2CO3， 1g/L；FeSO4·7H2O，0.06g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；pH＝10。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二中离心的转速为4000～6000rpm，离心时间为15～20min。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤二中菌悬液的浓度为1.5～2g浓缩的菌体细胞/L，即每升菌悬液中含有1.5～2g离心得到的浓缩的菌体细胞。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的质量比为3:1。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的总质量与菌悬液的体积比为160g:1L。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中滴加的具体方法为用射器针头将混合液滴加到质量浓度为4％的CaCl2溶液中，边滴边摇晃。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤三中所述包埋剂是由聚乙烯醇和海藻酸按质量比5:1组成的。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式十七：本实施方式耐盐脱氮能力的微生物材料在含盐水体脱氮中的应用。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十七不同的是：所述微生物材料在含盐水体中的投加量为50g/L。其它与具体实施方式十七相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十七不同的是：所述含盐水体的含盐条件为EC＝15mS/cm。其它与具体实施方式十七相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：微生物材料的制备条件优化
本发明微生物材料采用菌悬液作为溶剂，目标菌种浓度为固定值，即1.5～2g/L。为此在选择最佳制备条件时，主要以外加碳源的COD释放量为衡量微生物材料的首要指标；同时，考察微生物材料的物理特征，主要包括固定化颗粒的成型状况、粘连状况、弹性、强度、稳定性等。设计正交试验，按照五因素四水平的正交表进行实验，其中选取的5 个因素分别为聚乙烯醇、海藻酸钠、改性玉米芯粉、pH和固定化时间，各因素对应的四个水平如表1所示。按照上述制备方法分别将16组不同因素及水平组合固定化而成的颗粒各取10g加入到装有200mL蒸馏水的250mL锥形瓶中，密封瓶口，置于室温下静置各处理组对应固定化时间，测定COD浓度。依据各项考察指标，采用极差法得出最佳制备条件，即聚乙烯醇100g/L，海藻酸钠20g/L，改性玉米芯粉40g/L，pH＝10，固定化时间为6h。制备后的微生物材料形态特征，如图1所示。
表1最佳固定化条件确定的正交实验设计表
Figure BDA0002718041160000061
实施例2：微生物材料的反硝化性能实验
本实施例耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：外加碳源的改性
选择玉米芯粉作为外加碳源，将玉米芯粉溶于NaOH溶液中，在温度为90℃的水浴锅内进行加热处理1～1.2h，加热处理同时进行不断搅拌；加热处理后，使用蒸馏水依次进行冲洗和浸泡，反复三次，第三次浸泡过程中调节pH至中性，然后再清洗一次；最后于70℃烘干，得到改性玉米芯粉；其中玉米芯粉和NaOH溶液的质量比为1:30；所述NaOH 溶液的质量浓度为1％；
步骤二：菌悬液的制备
对别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2进行富集培养，培养条件为30～32℃恒温密封静置培养，待培养基出现浑浊并产生气体后作为富集种子菌液；以5％(v/v)的接种量将富集种子菌液接种于反硝化培养基中，置于30～32℃恒温密封静置培养5～7d；最后将培养液进行离心，离心转速为5000rpm，离心时间为15min，得到浓缩的菌体细胞，用无菌水稀释混匀后，得到菌悬液，每升菌悬液中含有1.5～2g离心得到的浓缩的菌体细胞；其中反硝化培养基的成分为：CH3COONa，5g/L；K2HPO4，1g/L；NaNO2，0.8g/L；CaCl2， 0.03g/L；Na2CO3，1g/L；FeSO4·7H2O，0.06g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；pH＝10。
步骤三：微生物材料的包埋制备
向步骤二得到的菌悬液中加入包埋剂(由聚乙烯醇和海藻酸按质量比5:1组成)和改性玉米芯粉，混合均匀，不断搅拌，调节pH为10，得到混合液；然后将混合液滴加到 CaCl2溶液中，滴加的具体方法为用射器针头将混合液滴加到质量浓度为4％的CaCl2溶液中，边滴边摇晃，形成凝胶颗粒，将凝胶颗粒于室温放置6～8h后，用无菌水冲洗2～3次，即得到微生物材料。其中包埋剂和改性玉米芯粉的质量比为3:1。包埋剂和改性玉米芯粉的总质量与菌悬液的体积比为160g:1L。
分别称取0g、10g、30g、50g的本实施例制备的微生物材料加入装有1000mL人工模拟含盐废水(EC＝15mS/cm，NaCl浓度约为8g/L；氨氮、硝氮、磷酸盐和COD浓度分别约为10mg/L、5mg/L、3mg/L和10mg/L)的烧杯中，用保鲜膜封口，置于室温，每日定时收集水样，重点测定氨氮、硝氮和总氮的浓度。以未投加微生物材料的处理组作为空白对照，每组平行3个。结果如图2～4所示，
Figure BDA0002718041160000071
表示微生物材料在废水中的添加量为0％，
Figure BDA0002718041160000072
表示微生物材料在废水中的添加量为1％，
Figure BDA0002718041160000073
表示微生物材料在废水中的添加量为3％，
Figure BDA0002718041160000074
表示微生物材料在废水中的添加量为5％。随时间增长，各处理组中的氨氮、硝氮和总氮的去除率逐渐升高；微生物材料投加量为50g/L条件下，氨氮、硝氮和总氮的去除率最大，在第5d时，其去除率分别为74.61％、97.65％和47.63％，显著高于未投加微生物材料的处理组，表明本发明微生物材料具有高效的耐盐脱氮能力，能在含盐环境中高效去除废水中不同形态的氮素污染物。
实施例3：微生物材料在人工湿地中的实际应用
按50g/L的投加量，将实施例2制备的微生物材料与人工湿地模拟装置中底部3cm深的砾石进行充分混合。人工湿地采用垂直流方式进水，进水水质为人工模拟含盐废水(同上述实施例2)，于每日定时收集水样，重点测定氨氮、硝氮和总氮的浓度。投加微生物材料后，人工湿地模拟装置在盐胁迫条件下的脱氮能力得到了提高，氨氮、硝氮和总氮的去除率分别在93％、93％和90％以上。
以直接投加菌剂的处理组作为对照组。在添加微生物材料30日后，人工湿地对含盐废水中总氮的去除率在90％以上，显著高于同期直接投加菌剂的处理组(80％左右)。

Claims (10)

1.一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料，其特征在于该微生物材料由菌悬液、外加碳源和包埋剂制成；其中所述菌悬液中的菌株为别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2。
2.根据权利要求1所述的一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料，其特征在于所述外加碳源为经NaOH溶液改性后的玉米芯粉。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有耐盐脱氮能力的微生物材料，其特征在于所述包埋剂是由聚乙烯醇和海藻酸组成的，聚乙烯醇和海藻酸的质量比为5:1。
4.如权利要求1所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤一：选择玉米芯粉作为外加碳源，将玉米芯粉溶于NaOH溶液中，在温度为90～95℃的水浴锅内进行加热处理，加热处理同时进行不断搅拌；加热处理后，使用蒸馏水依次进行冲洗和浸泡，反复三次，第三次浸泡过程中调节pH至中性，然后再清洗一次；最后烘干，得到改性玉米芯粉；
步骤二：对别样希瓦氏菌Alishewanella sp.F2进行富集培养，待培养基出现浑浊并产生气体后作为富集种子菌液；以5％(v/v)的接种量将富集种子菌液接种于反硝化培养基中，置于30～32℃恒温密封静置培养5～7d；最后将培养液进行离心，得到浓缩的菌体细胞，用无菌水稀释混匀后，得到菌悬液；
步骤三：向步骤二得到的菌悬液中加入包埋剂和改性玉米芯粉，混合均匀，不断搅拌，调节pH为10，得到混合液；然后将混合液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，将凝胶颗粒于室温放置6～8h后，用无菌水冲洗2～3次，即得到微生物材料。
5.根据权利要求4所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，其特征在于步骤一中所述加热处理的时间为1～1.2h。
6.根据权利要求4所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，其特征在于步骤二每升菌悬液中含有1.5～2g离心得到的浓缩的菌体细胞。
7.根据权利要求4所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，其特征在于步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的质量比为3:1。
8.根据权利要求4所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料的制备方法，其特征在于步骤三中包埋剂和改性玉米芯粉的总质量与菌悬液的体积比为160g:1L。
9.如权利要求1所述的具有耐盐脱氮能力的微生物材料在含盐水体脱氮中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述微生物材料在含盐水体中的投加量为50g/L。
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