CN112175605A - 一种近红外荧光磁性Fe NCs双模探针及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种近红外荧光磁性Fe NCs双模探针及其合成方法与应用。该磁性Fe NCs双模探针中铁元素的价态为0价，其粒径为5 nm，其中稳定剂谷胱甘肽和铁离子的摩尔比为1:0.3073所制得的铁纳米簇具有出色的近红外荧光发射能力，可以有效避免样品中生物自体荧光的干扰，可用于在复杂检测体系中对药物分子硫普罗宁的高灵敏检测。此外，该探针还具有较强的顺磁性质，在外加磁场的作用下能够产生明亮的T1加权影像信号，并随着探针浓度的升高而逐渐加强，在磁共振成像方面也具有广阔的应用前景。
Description
本发明得到国家自然科学基金面上项目（No.21375095）、天津市自然科学基金青年项目（No.17JCQNJC05800），天津师范大学“无机-有机杂化功能材料化学***重点实验室”、“天津市功能分子结构与性能重点实验室”开放基金项目和天津师范大学“未来千人计划”项目（WLQR201914）的支持。
技术领域
本发明属于化学合成和生物分析检测技术领域，涉及一种具有近红外荧光发射能力的磁性铁纳米簇及其简单、绿色、快速的合成方法。
背景技术
金属纳米簇（Metal Nanoclusters，NCs）作为一种近些年来新兴的纳米发光材料，其接近费米波长的粒径不仅使其具有优异的荧光性质，还表现出高水溶性、高分散性和荧光可调节性等分子才具备的性质。同有机荧光染料、半导体量子点、稀土上转换荧光材料等传统发光材料相对比，金属纳米簇在保持纳米荧光探针优良的荧光性能和传感性能的同时，还具有更加细小的粒径和更加优良的生物相容性，使得其在生物医学、环境科学等相关领域应用广泛，并成为当前国内外分析检测技术领域备受关注的热点研发方向。根据金属纳米簇荧光探针的制备原料不同，可以将其分为贵金属纳米簇和普通过渡金属纳米簇两类。其中，贵金属纳米簇主要有金纳米簇（Au NCs）、银纳米簇（Ag NCs）和铂纳米簇（PtNCs），这些贵金属纳米簇荧光探针因发展历史较长，故与之相关的制备技术和工艺相对成熟，制备与应用难度较低，但是其无一例外需要使用金、银等昂贵的贵金属作为制备原料，使得其制备与使用成本较高，导致贵金属纳米簇荧光探针迄今为止只限于在基础科学研究和实验室分析中开展少量的应用，大大限制了其在临床检测和工业分析等实际生产中的大规模应用。
为了较好地解决贵金属纳米簇荧光探针在实际应用中“高成本、难普及”这一难题，近年来科技工作者先后开发了铜纳米簇（Cu NCs）和铁纳米簇（Fe NCs）这两种普通过渡金属纳米簇荧光探针。由于上述两种过渡金属纳米簇制备原料廉价易得，制备过程无需加热且反应时间较短，故较于传统的贵金属纳米簇荧光探针其制备与使用成本相大大降低，非常有利于在实际生产应用中大规模推广，具有广阔的应用前景。
在过渡金属纳米簇荧光探针中，相较于近年来已被广泛报道的Cu NCs荧光探针，荧光Fe NCs还有着许多独特的优点。首先，就原材料而言，铁的价格明显低于铜的价格，故Fe NCs探针的成本较Cu NCs探针低得多，在分析检测等实际生产应用中更加具有成本优势。其次，Fe NCs较Cu NCs拥有更长的荧光发射波长，更有利于避免在生物样品中被生物自体荧光干扰，提高分析检测的灵敏度和准确度。更重要的一点是，无论贵金属纳米簇还是CuNCs都仅具有荧光发射性能而不具有任何磁性能，这些纳米簇只能用作荧光探针而不能作为荧光/磁共振双模探针来使用，无法实现荧光信号和磁共振信号的同时输出。如果要基于上述金属纳米簇制备荧光/磁共振双模态纳米探针则必须额外偶联其它具有磁信号响应的纳米粒子（如Fe3O4等），不仅增加了额外的制备流程，而且推高了制备成本。然而，铁元素是具有磁性的，以铁元素为基质制备的Fe NCs不仅具有向光发射性能，而且具有磁性能。若将其发展为荧光/磁共振双模态传感探针，可将两种信号的同时输出，实现一材两用，节约应用成本。因此，相较于贵金属纳米簇探针和Cu NCs探针而言，Fe NCs探针无疑具有巨大的技术进步。
当前，在国内外的技术文献中对荧光Fe NCs探针鲜有报道，这是因为铁元素属于氢前金属，在溶液中将其由阳离子还原为0价的Fe NCs较金银铜等氢后金属元素困难，制得的Fe NCs也非常容易再次被氧化，使得产品难以在常规条件下保存。目前，国际上报道出来的有关制备荧光Fe NCs的文献仅有3篇，分别为：N.Goswamiet.al.,Nanoscale, 2014, 6,1848-1854; N.Hashemiet.al., Microchim.Acta, 2018, 185, 60; A.Joseet. al.,Colloid Surface B, 2018, 165, 371-380。因为Fe NCs制备非常困难，为了避免制得的FeNCs再次被氧化，上述三篇文献无一例外均采用血红蛋白（Hb）为铁源和制备模板，他们利用哌啶将血红蛋白中的铁离子提取到血红蛋白的表面，再以相应的还原剂将铁离子还原为铁原子，从而制得发射黄色至橙色（发射波长为580-600 nm）的Fe NCs荧光探针。该制备方法存在诸多弊端：首先，无论是贵金属纳米簇还是Cu NCs，纳米簇中金属元素均来自于金属无机盐原料，而该方法制得的Fe NCs中，铁元素来自于血液制品——血红蛋白。众所周知，金属无机盐的价格远远低于血液制品的价格，该方法采用血红蛋白作为制备Fe NCs的主要原料无疑推高了Fe NCs的制备与应用成本。其次，金属纳米簇的荧光发射能力来自于金属原子中受激电子的跃迁，模板分子上生长结合的金属原子越多，受激发而产生跃迁的电子数目就越多，相应地，纳米簇的荧光发射能力也就越强。一般来说，在荧光金属纳米簇的一个模板分子表面会生长10-100个金属原子。而该制备方法中血红蛋白既是铁源又是制备模板，一个血红蛋白分子中仅含有一个铁离子，若以该方法制备Fe NCs，则一个模板分子表面仅能生长一个金属原子，大大制约了该Fe NCs探针的发光效率。同时，该制备方法并不能直接在血红蛋白内部还原铁离子，需要先使用哌啶将铁离子从血红蛋白内部提取至其表面才能进行还原。哌啶是有毒试剂，又属于易制毒化学品，受到严格的管控，采用哌啶作为制备Fe NCs的必备试剂将面临极大的安全和经济风险，不利于在实际生产中大规模推广。
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种快速、高效、绿色、低成本的近红外荧光磁性Fe NCs（Fe NCs）双模态探针的制备方法。本方法使用还原型谷胱甘肽（GSH）作为制备模板和保护剂，以氯化亚铁无机盐作为铁源，在水溶液中以硼氢化钠为还原剂将+2价的亚铁离子还原为0价的铁原子，从而制成一种同时具备近红外荧光发射性能和顺磁性能的Fe NCs。本方法采用的制备模板GSH是一种是广泛存在于动、植物中的生物活性小分子（三肽），来源广泛价格低廉，其中富含的巯基基团可以结合多个铁原子，保证了所制得的FeNCs的荧光发射效率。本方法以硼氢化钠代替了传统金属纳米簇合成方法中常用的水合肼还原剂，也无需哌啶等有毒试剂，制备过程绿色、环保、高效，用时仅15分钟。最终形成的FeNCs性能稳定，保存时间长，且具有极好的磁共振响应性能，可以实现荧光和磁共振双模态信号的同时输出，具有明显的技术进步性和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种水溶性无毒Fe NCs的简便水相室温合成方法，采用该法制备的Fe NCs在具备优异的近红外荧光发射能力的同时，亦具备优良的顺磁性质，可同时具有荧光和磁共振（MRI）两种检测信号的响应能力，即所谓“双模态”信号响应能力，在药物分子检测和MRI成像应用等方面具有很好的应用前景。
为实现上述目的，本发明公开了一种近红外荧光磁性Fe NCs双模探针，其特征在于：该磁性Fe NCs双模探针中铁元素的价态为0价，其粒径为5 nm，其中稳定剂谷胱甘肽（GSH）和铁离子的摩尔比为1:0.3073；
该Fe NCs探针具有近红外荧光发射能力，其最大激发波长位于515 nm，最大发射波长位于702 nm；且该Fe NCs探针在具有荧光性质的同时具有明显的顺磁性质。
本发明进一步公开了所述近红外荧光磁性Fe NCs双模探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）称取0.1000g还原型谷胱甘肽（GSH）溶于15mL高纯水中；
（2）称取四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）0.1988g，溶于10mL高纯水中，形成0.1M氯化亚铁水溶液，移取1mL上述液体，加入至GSH溶液中，充分搅拌20min；
（3）搅拌条件下加入硼氢化钠0.0190g，充分反应15 min，溶液颜色由无色变为浅黄色，即得到同时具有磁性和近红外荧光发射能力的Fe NCs探针溶液。
本发明更进一步公开了近红外荧光磁性Fe NCs双模探针在用于药物分子硫普罗宁高灵敏检测方面的应用，其方法在于：取一定体积的Fe NCs探针溶液、硫普罗宁标准溶液和高纯水制成检测体系，采用含有不同浓度硫普罗宁标准溶液的检测体系测定目标物硫普罗宁对Fe NCs探针荧光信号的猝灭量（ΔF），并以此为纵坐标，硫普罗宁标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，依该标准曲线测定样品中硫普罗宁的浓度，该方法对硫普罗宁的检测线性范围为0.1-0.6 M；检出限为：3.7mM。
本发明同时也公开了近红外荧光磁性Fe NCs双模探针在磁共振成像（MRI）方面的应用，其方法在于：取不同浓度的该Fe NCs探针溶液，在临床医用MRI成像***中T1模式下进行加权成像，随着该Fe NCs探针浓度的增加，其T1加权模式MRI信号不断增强，MRI影像越来越明亮，该探针可有效增强水的T1加权MRI影像。
本发明更加详细的描述如下：
一种近红外荧光磁性Fe NCs双模态检测探针，其特征在于：组成该Fe NCs探针的保护剂谷胱甘肽（GSH）和Fe原子（以铁源FeCl2·4H2O计算）的摩尔比为1：0.3073；该Fe NCs探针的粒径约为5 nm左右，其可于可见光的激发下在近红外光区发射荧光，其最大激发波长位于515 nm，最大发射波长位于702 nm，且具有明显的T1加权模式磁共振（MRI）信号响应（即随着探针浓度的增加，其MRI影像变亮）。
本发明所述近红外荧光磁性Fe NCs双模探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）称取0.1000gGSH溶于15mL高纯水中；
（2）称取0.1988 gFeCl2·4H2O，溶于10mL高纯水中，形成浓度为0.1M的FeCl2溶液，移取1mL上述液体，加入至上述GSH溶液中，充分搅拌20min；
（3）搅拌条件下加入硼氢化钠0.0190g，充分反应15 min，溶液颜色由无色变为浅黄色，即得到近红外荧光磁性Fe NCs探针溶液。
本发明更进一步公开了近红外荧光磁性Fe NCs双模态探针在高灵敏检测药物分子硫普罗宁方面的应用。具体为取一定体积的Fe NCs探针溶液、硫普罗宁标准溶液和高纯水制成检测体系，采用含有不同浓度硫普罗宁标准溶液的检测体系测定目标物硫普罗宁对Fe NCs探针荧光信号的猝灭量（ΔF），并以此为纵坐标，硫普罗宁标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，依该标准曲线测定样品中硫普罗宁的浓度。
上述检测方法中，得到线性方程为ΔF=415.50648x+27.89188，ΔF=F0-F，F0等于不加入硫普罗宁时的荧光强度，F为加入硫普罗宁后的荧光强度，x为硫普罗宁浓度。
上述检测方法中，检测的线性范围为0.1-0.6M，检出限为3.7mM。
上述检测方法中，高纯水3.55mL、Fe NCs分散体系0.25mL和硫普罗宁溶液0.20mL。
上述检测方法中，在向高纯水和Fe NCs分散体系中加入硫普罗宁溶液90min后检测其荧光强度。
本发明又进一步公开了近红外荧光磁性Fe NCs双模态探针在磁共振成像（MRI）方面的应用。具体为取不同浓度的该Fe NCs探针溶液，在临床医用MRI成像***中T1模式下进行加权成像，随着该Fe NCs探针浓度的增加，其T1加权模式MRI信号不断增强，MRI影像越来越明亮。
本发明一个典型的例子：
一种近红外荧光磁性Fe NCs双模探针的合成方法：
步骤1：将GSH和FeCl2·4H2O分别溶于高纯水中制得储备母液；其中将0.1000 g GSH溶于15 mL高纯水中；0.1988 g FeCl2·4H2O溶于10 mL高纯水中。
步骤2：将FeCl2储备液逐滴加入GSH溶液中，于室温下充分搅拌；具体移取1 mL步骤1中配得的FeCl2溶液，逐滴加入至GSH溶液中，充分搅拌20 min。
步骤3：步骤2中得到的反应体系中加入0.0190 g硼氢化钠，充分反应15 min，待反应溶液颜色由无色变为浅黄色，即得到Fe NCs探针溶液；
步骤4：将步骤3得到的Fe NCs探针溶液于8000 r/min转速下离心，以无水乙醇和高纯水洗涤三次后于60 ºC真空环境下干燥12 h，即得到Fe NCs固体产品。
本发明另一个典型的例子：
步骤1：称取1.6319 g硫普罗宁，溶于10 mL高纯水中，配成1 M的硫普罗宁高标溶液，保存待用。
步骤2：准确移取不同体积的步骤1中制好的硫普罗宁高标溶液于10 mL比色管中，用高纯水将其稀释，配制成浓度依次为0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.6 M的硫普罗宁标准溶液，保存待用。
步骤3：分别准确移取0.20mL步骤2中配好的各浓度硫普罗宁标准溶液至5个5 mL离心管中，再向每个离心管中加入0.25mL Fe NCs探针溶液和3.55mL高纯水，混匀，于90min后测定各离心管中混合溶液的荧光强度。
步骤4：另取0.25 mL Fe NCs溶液于5 mL离心管中，加入3.75 mL高纯水，混匀，静止90 min后测定其荧光强度并记为F0，计算步骤3中各检测溶液荧光强度与F0的差值，记为ΔF，并以ΔF为纵坐标，硫普罗宁标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程为ΔF=415.50648x+27.89188，ΔF=F0-F，F0等于不加入硫普罗宁时的荧光强度，F为加入硫普罗宁后的荧光强度，x为硫普罗宁浓度。
本发明再一个典型的例子
步骤1：移取不同体积的Fe NCs探针溶液，加入高纯水分别稀释至0.0045 M、0.00225M、0.001125 M和0.0009 M，保存待用。
步骤2：准确移取2 mL步骤1中制好的待测液和纯水（作对照用），分别移入检测板的不同孔位中，在临床医用MRI成像***中T1模式下进行加权成像，观测各孔位中样品的影像明暗程度。
本发明公开的近红外荧光磁性Fe NCs双模探针及其合成方法与现有技术相比，所具有的有益效果在于：
（1）本发明所制备的Fe NCs具有稳定的光学性质，合成材料粒径小，荧光性能好等优点，其合成方法简单、快速，合成过程中不需要加热、调节pH、功能化修饰等复杂的过程。
（2）该Fe NCs探针荧光发射波长在702 nm，位于近红外光区，其荧光发射峰形良好，荧光强度高，并具有良好的顺磁性。
（3）该Fe NCs的制备方法新颖，不易受到pH、温度等其他原因干扰。采用硼氢化钠作为还原剂，对于环境友好，不会产生有害环境的副产物，且反应速度快，最快15 min即可反应完成，保存方法简单，荧光和磁共振性质稳定。
附图说明
图1 为Fe NCs探针的透射电镜（TEM）图，说明了该Fe NCs粒径较小且尺寸均一；
图2 为Fe NCs探针的荧光激发光谱和发射光谱图，表明其最大激发波长为515nm，最大发射波长为702 nm；
图3为Fe NCs探针检测硫普罗宁的标准曲线图；
图4为纯水和不同浓度的Fe NCs探针水溶液的T1加权MRI影像，表明该探针具有顺磁性质和MRI响应能力并能增强水的MRI信号。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：GSH购自上海源叶生物科技有限公司；硼氢化钠购自天津光复精细化工研究所；FeCl2·4H2O购自北京伊诺凯科技有限公司。聚还原性谷胱甘肽，硼氢化钠，四水合氯化亚铁有市售。
实施例1
该近红外荧光磁性Fe NCs的制备在室温条件下按照如下步骤进行：
（1）称取0.1000g的GSH溶于15mL高纯水中；
（2）称取0.1988g的FeCl2·4H2O，溶于10mL高纯水中，形成浓度为0.1M的FeCl2水溶液，移取上述溶液1mL加入到配好的GSH溶液中，充分搅拌20min；
（3）在搅拌条件下向上述反应混合溶液中加入硼氢化钠固体0.0190g，再于搅拌下充分反应15 min，反应溶液颜色由无色变为浅黄色，得到最终的产品溶液。
实施例2
（1）Fe NCs的制备方法参照实施例1；
（2）Fe NCs的透射电子显微镜（TEM）表征：
将制备好的Fe NCs分散到高纯水中，均匀滴涂于专用铜网上，晾干，制得观测样品，利用场发射透射电子显微镜观测Fe NCs的形貌。如图1所示，该Fe NCs形貌近似球形且分散均匀，粒径较小（约为5 nm）且分布均一。
实施例3
（1）Fe NCs的制备方法参照实施例1；
（2）Fe NCs的荧光激发光谱和发射光谱的测定：
将制备好的Fe NCs分散到高纯水中，利用荧光分光光度计对该Fe NCs样品的荧光激发光谱和发射光谱进行测定，如图2所示，该Fe NCs的最大激发波长为515 nm，在此最大激发波长的激发下，其荧光发射波长为702nm，位于近红外光区，说明该Fe NCs具有良好的近红外荧光发射能力。
实施例4
（1）Fe NCs的制备方法参照实施例1；
（2）Fe NCs探针在药物分子硫普罗宁检测方面的应用：
分别取2支空离心管，编号（1）、（2），分别移取高纯水3.55mL至离心管中，再移取250μL的Fe NCs探针溶液加入到上述离心管中，混合均匀后，继续向
号离心管中加入200μL高纯水作为空白对照组，向②号离心管中加入200μL的硫普罗宁溶液，反应90min，使得荧光发生猝灭并用荧光光度计检测荧光发射强度，即可实现对硫普罗宁溶液的检测。
实施例5
（1）Fe NCs的制备方法参照实施例1；
（2）Fe NCs探针在药物分子硫普罗宁检测方面的应用：
向5 mL离心管中加入3.55mL高纯水，移取250μL的Fe NCs探针溶液加入到上述离心管中，混合均匀后，分别加入200μL不同浓度的硫普罗宁溶液，反应90min后检测其荧光发射强度，平行测定三次。根据不同浓度硫普罗宁对Fe NCs探针荧光的猝灭程度，得到荧光猝灭量（ΔF）与硫普罗宁溶液浓度之间的线性关系（如图3所示），并以此作为依据对硫普罗宁进行定量检测，检测的线性范围为0.1-0.6 M，检测限为3.7mM。
实施例6
（1）Fe NCs的制备方法参照实施例1；
（2）Fe NCs的顺磁性表征及其在T1加权MRI成像方面的应用：
将制备好的Fe NCs探针干燥、称量，重新溶于高纯水中，配制成浓度依次为0.0045 M、0.00225 M、0.001125 M和0.0009 M的探针标准溶液（编号依次为1-5），再移取2 mL该待测液和纯水（作对照用，编号为6），分别移入MRI影像检测板的不同孔位中，在临床医用MRI成像***中T1模式下进行加权成像，观测各孔位中样品的影像明暗程度。如图4所示，该FeNCs的T1加权磁共振影像随探针浓度的增加而明显变亮，表明该Fe NCs探针具有良好顺磁性质和T1加权MRI响应能力（若为铁磁性物质则会产生T2加权信号，即随着探针浓度的增加，MRI影像越来越暗）。此外，1-5号孔位中的Fe NCs探针溶液的MRI信号明显强于6号孔位中纯水的MRI信号，表明该Fe NCs探针能有效增强类似水这样无MRI信号响应性能的物质的MRI信号，在MRI成像方面有着广阔的应用前景。
Claims (4)
1.一种近红外荧光磁性Fe NCs双模探针，其特征在于：该磁性Fe NCs双模探针中铁元素的价态为0价，其粒径为5 nm，其中稳定剂谷胱甘肽和铁离子的摩尔比为1:0.3073。
2.权利要求1所述近红外荧光磁性Fe NCs双模探针的合成方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）称取0.1000g还原型谷胱甘肽（GSH）溶于15mL高纯水中；
（2）称取四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）0.1988g，溶于10mL高纯水中，形成0.1M氯化亚铁水溶液，移取1mL上述液体，加入至GSH溶液中，充分搅拌20min；
（3）搅拌条件下加入硼氢化钠0.0190g，充分反应15 min，溶液颜色由无色变为浅黄色，即得到同时具有磁性和近红外荧光发射能力的Fe NCs探针溶液。
3.权利要求1所述的近红外荧光磁性Fe NCs双模探针在用于药物硫普罗宁的高灵敏检测方面的应用。
4.权利要求1所述的近红外荧光磁性Fe NCs双模探针在磁共振成像（MRI）方面的应用。
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