CN112126597A - 一种基于沼液培养螺旋藻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于沼液培养螺旋藻的方法，该方法以废弃生物质畜禽粪便即沼液为原料，对其稀释10倍沼液，并添加8%的Zarrouk培养液后，用于培养螺旋藻，所述螺旋藻生长情况好，螺旋藻对水体中的氮、磷等营养盐具有较好的吸收效果，对氨氮、硝态氮、亚硝态氮和活性磷的去除率可分别达到58%、83%、77.4%和53.12%。利用沼液培养螺旋藻，不仅能够节约成本，还能净化环境，此技术在生态环保方面具有极大的潜力。

Description

一种基于沼液培养螺旋藻的方法

技术领域

本发明属于废弃物再利用领域，具体涉及一种基于沼液培养螺旋藻的方法。

背景技术

沼液是畜禽粪便等有机物经过厌氧发酵后的高浓度有机废水，也是沼气厌氧发酵后的残留液体，含有大量氮、磷、有机物，其营养能力强，养分可利用率高，是多元、卫生的速效复合肥料，具有较高的应用价值。

我国作为农业大国，发展和应用沼气在我国占据很大一部分。在沼气池发酵残液的利用方面，在多个地区开展了很多研究和示范的点，比如将沼液用作肥料、用于饲料添加、浸种、生物农药和植物生长刺激素等。因此，广泛的、合理的利用沼气池残液是一个综合课题，这不但对农业生产有利，而且对生态环境的改善会有明显的积极作用。

沼气发酵是指有机质在厌氧条件下发生的一系列的生化化学反应。沼气发酵的残留物，主要含有矿物质、活性成分、营养物质等三大类物质。沼液作为一种有机肥，含有多种活性物质，营养成分含量最高，主要含有以下物质：一是微量元素，微量元素由残留液体沼气发酵后，他们大多是在能渗入子细胞，刺激种子发芽或植物生长提供微量营养素，生物活性物质的高活性离子的形式。二是微生物分泌的核酸，赤霉素，纤维素酶，单糖，不饱和脂肪酸，生长激素，抗生素等在植物生长的过程中有着促进植物发芽，植物生长和开花等调节发酵原料功能。三是营养素，在原料中的大分子物质通过微生物分解，营养元素如氮，磷，钾，被供给到植物，并且可以被植物直接地吸收和利用。

螺旋藻的营养类型可以分为自养、异养和兼养型三种。自养型就是利用光能和无机碳源进行光合作用从而使藻细胞自身合成有机物的过程，针对自养型型螺旋藻，在无光条件下，螺旋藻利用一种或多种有机物作为能源和碳源在黑暗中生长即进行异养繁殖，类似于细菌的发酵，生长速率快于自养条件下的小球藻，通常能获得较高的生物量。此外，螺旋藻既可在光照和利用有机碳源条件下进行兼养生长，其生长速度和藻密度较高。

螺旋藻生长状况受到多种环境因子的影响，包括营养、环境和生态因子，主要的影响因子有：pH，温度，光照周期和光照强度等。目前，培养螺旋藻成品培养基，以Zarrouk培养基，培养成本高，藻类生长情况一般。

CN105779352A公开了一种利用沼液养殖螺旋藻的方法，属于螺旋藻养殖技术领域。本发明在蓄水池四周搭建薄膜搭棚，覆盖蓄水池后，在蓄水池上方按照不锈钢筛网，并将凹凸棒土粉末以及土壤混合物铺设在不锈钢筛网上，利用阳光照射，使得薄膜保温，养殖液不断蒸腾对螺旋藻提供水分和养料，从而得到利用沼液养殖螺旋藻的方法。实例证明，本发明方法独特新颖，养殖简易，无需特殊设备，不仅整个养殖过程无污染，从根本解决了螺旋藻的重金属超标以及化学物质残留问题，而且使得螺旋藻的产率达到95％以上，可大规模推广应用。虽然该发明专利利用禽畜场的沼液为营养来源，但是预处理复杂，而且凹凸棒土属于稀有资源,对环境友好度低，不适合大规模产业化推广。

CN103275900A公开了一种城市生活废弃物厌氧处理后沼液的资源化方法，属于环境保护技术领域。将生活废弃物经分选后对选出的生物质破碎、制浆，然后进行厌氧发酵，发酵后排出沼液，再将沼液制作成培养液，注入各个螺旋藻养殖大棚中的养殖池；同时将采集到的当地碱湖中的优质藻种，做分离纯化，对纯种藻种进行扩种，随后在一个养殖池内进行培养、扩繁，再将扩繁后的藻种接入其它养殖池进行生产养殖，然后将养殖好的优质螺旋藻进行采收，最后将制作分离出来的藻泥通过喷雾干燥后制作成成品藻粉。用沼液代替化学培养液养殖出的螺旋藻为有机藻类，实现了螺旋藻产品的“绿色化”。解决了沼液处理的高建设费用和高成本问题，使螺旋藻养殖成本降低了50％。

CN107460128A公开了一种利用沼液养殖微藻的方法，将微藻接种在人工培养基中，待微藻的比生长速率开始下降时进行采收，然后分批次添加沼液，待微藻的生长速率降至首次添加沼液前生长速率的60～70％，进行采收；再次分批次添加沼液，待微藻的生长速率降至首次添加沼液前生长速率的50～60％，进行采收；第三次分批次添加沼液，待微藻的生长速率降至首次添加沼液前生长速率的50％以下，进行采收后结束养殖。本发明提出了一种合理的利用沼液实现养殖微藻的详细操作方法，提高微藻的产量，降低微藻养殖成本，最大程度地提高微藻养殖与其它工艺结合的增益效果。

综合CN103275900A和CN107460128A这两件专利可知，该两件现有技术发酵后的沼液有害成分没有测定,且没有进行脱色和脱臭处理,培养出来的螺旋藻不仅形状差，而且培养出来的螺旋藻达不到食品安全等级要求,不适合产业化。如何利用沼液，培养螺旋藻，成本低，且产率高的方法，是值得研究的课题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于沼液培养螺旋藻的方法，该方法以废弃生物质畜禽粪便即沼液为原料，优化处理达标后，用于培养螺旋藻，所述螺旋藻生长情况好，沼液中有害成分降低，起到良好的净化效果。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：

一种基于沼液培养螺旋藻的方法，包括以下步骤：

步骤1，选取沼液，并进行预处理得上清液，备用，所得上清液的OD430低于0.4，重金属含量达到GB5084-2005符合农田灌溉水质的标准；

步骤2，选取螺旋藻，培养至OD560为0.9-10，备用；

步骤3，将上清液稀释8-20倍，并向稀释后的上清液中加入Zarrouk培养基，搅拌均匀后，得优化培养基备用；

步骤4，向优化培养基中加入螺旋藻藻液，光照培养，即可。

作为改进的是，所述沼液的预处理的步骤如下：首先，将取来的5倍浓缩鸡粪即沼液静置沉淀，取上清液；其次，购于射阳普鲁泰克废活性炭再生公司的不同规格的活性炭来将活性炭置于纯水中过夜后，隔天晒干使用；再次，然后依次用不同规格(430、830、1240规格)的活性炭对上清液进行脱臭和脱色处理，以1.2ml/min的流速进行2次过滤；最后，用紫外线杀菌器进行灭菌，即得适用的沼液按照体积取螺旋藻的藻液于上清液中，即可。

作为改进的是，步骤3中Zarrouk培养基的体积分数为8％。

作为改进的是，步骤4中光照培养条件为温度26±1℃，光照强度8000lux，光周期L:D(光:暗)＝12:12，每天早晨8:00、中午12:30、晚上18:30定时摇瓶。

作为改进的是，步骤4中螺旋藻藻液与优化培养基的的体积比为1:3。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种基于沼液培养螺旋藻的方法，利用生活中常见的沼液为主要营养源来培养螺旋藻，并对沼液中营养物质等离子的进行检测，对其进行优化培养基，再利用添加沼液的培养基进行螺旋藻培养工艺的优化与放大，从而达到净化水质，提高螺旋藻生产经济效率。

(1)用沼液培养螺旋藻的过程实际上也就是螺旋藻净化沼液的过程，沼液中不能够直接培养螺旋藻，需要对沼液进行稀释预处理，浓度最合适的是10％；

(2)在稀释10倍的沼液中添加不同比例Zarrouk培养液后，补充了螺旋藻生长所需营养因子，螺旋藻均呈现出较好的生长趋势。选择添加8％比例的Zarrouk培养液后，螺旋藻对水体中的氮、磷等元素具有较好的吸收效果，对NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N和P的清除率分别达到58.58％、83.03％、77.4％和53.12％；

(3)沼液可以代替zarrouk作为营养盐培养螺旋藻。

附图说明

图1为螺旋藻在不同稀释倍数沼液中的生长情况；

图2为螺旋藻在含有不同比例Zarrouk的沼液中的生长情况。

具体实施方式

钝顶螺旋藻东台赐百年生物科技有限公司提供。

本发明所用的培养基(Zarrouk)是东台赐百年生物科技有限公司的钝顶螺旋藻配方。于121℃灭菌20min冷却至室温后使用，具体配方如下表1所示：

表1zarrouk培养基

成分	成产配方(g/L)
		NaHCO<sub>3</sub>	10.00
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.40
		K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	0.00
NaNO<sub>3</sub>	1.20
		NaCl	1.00
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.20
		Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O	0.02
FeSO4·7H2O	0.01

实施例1沼液预处理

取5倍浓缩鸡粪(蛋鸡)沼液在2019年1月采集于海安普豪生物能源有限公司。

首先，将取来的5倍浓缩鸡粪即沼液静置沉淀，取上清液；

其次，购于射阳普鲁泰克废活性炭再生公司的不同规格的活性炭来将活性炭置于纯水中过夜后，隔天晒干使用；

再次，然后依次用不同规格(430、830、1240规格)的活性炭对上清液进行脱臭和脱色处理，以1.2ml/min的流速进行2次过滤；

最后，用紫外线杀菌器进行灭菌，并进行成分分析，OD430低于0.4，且汞、铬、砷、铅等重金属含量达到GB5084-2005(农田灌溉水质标准)即得适用的沼液。

实施例2螺旋藻在不同稀释倍数沼液中的生长情况

藻类一般通过光合作用从外界吸收N、P等无机盐来制造有机物，而这些无机盐对藻类的生长是不可缺少的。但是营养元素的含量并非越多越好，根据谢尔福德耐性定律，生物在生长过程中对各种因子均存在耐性范围，如果培养液中某一种必需元素超过一定量，会对藻类产生毒害作用，影响藻类的生长繁殖，严重者会导致藻类大量死亡。

取实施例1中过滤后的沼液，离心，稀释上清液(稀释8、10、20倍)，150ml沼液。从中选取等同的钝顶螺旋藻藻液(50ml)，和沼液混合培养(1:3)，每组设置3个平行，每一个培养基测两次OD。在光照培养箱中控制培养条件温度26±1℃，光强8000lux，光周期L：D(光：暗)＝12:12，每天早晨8:00、中午12:30、晚上18:30定时摇动，观察螺旋藻生长状况。培养10天，每个瓶内隔天天测560nm下的OD值2次(用OD值代表生物量)，做出生长曲线，以研究不同稀释倍数沼液中的钝顶螺旋藻的生长状况，从中确定最适宜钝顶螺旋藻生长的沼液稀释倍数，来确定钝顶螺旋藻的耐受范围。

钝顶螺旋藻在稀释比例为8倍、10倍、20倍的5倍浓缩蛋鸡鸡粪沼液中的生长情况见图1和表2所示。螺旋藻在这些浓度沼液中可以正常生长，在稀释10倍的沼液中生长效果最好，其次是稀释倍数为20倍的沼液，在8倍稀释沼液中生长较差，3种浓度中的OD₅₆₀均在第2天后表现出差异显著(P<0.05)。螺旋藻刚接入3个不同浓度沼液中时，其生长迟缓；第3天到第4天，细胞增殖速率加快，钝顶螺旋藻生长进入对数期。其中，在稀释10倍沼液中第4天OD₅₆₀值达到峰值。3种浓度沼液中生长的螺旋藻都分别在第4天显示出最高生长率。从第5天开始，藻类生长降缓，生长趋势下降，螺旋藻的生长进入平稳期。综合螺旋藻在稀释沼液中的生长情况，经济条件，未来投入使用等条件考虑，选取稀释10倍浓度。

表2钝顶螺旋藻在不同稀释倍数下沼液中的生长情况

注：小写字母上标不同表示同列之间差异显著(p<0.05)

大写字母上标不同表示同行之间差异显著(p<0.05)

这说明稀释倍率对螺旋藻的生长有明显抑制效应，一方面可能是沼液中有机物浓度高，不易被螺旋藻吸收，藻液由绿色渐变为黄色，导致螺旋藻死亡；另一方面可能是在高浓度的沼液中，培养液颜色深，透光性减弱，在自养培养方式下，使其远离了光饱和点，抑制了自养生长的进行。螺旋藻在刚接入沼液时，处于生长缓慢期，藻内不断完善体内酶***和细胞成分，合成生长所必须的酶，当培养至第四天时，藻类进入对数生长期，细胞代谢能力强，螺旋藻生长在第六天达到峰值，随后进入平缓期，生长曲线呈下降趋势，细胞***速度降低，生长缓慢，沼液中的营养物质被大量消耗。

实施例3添加Zarrouk培养基后螺旋藻的生长情况

根据实施例1和实施例2可知，对选取的沼液预处理后，再稀释1倍，备用。添加不同比例的Zarrouk培养液后钝顶螺旋藻的生长状况结果见图2。在稀释10倍的沼液中添加2％、4％、6％、8％和10％的Zarrouk培养液后，钝顶螺旋藻均呈现出较好的生长，而且生长效果与Zarrouk培养液的添加比例呈正相关。在6天内，钝顶螺旋藻具有较好的生长速率。其中6％、8％和10％浓度的生长效果要相对更好，2％和4％浓度的生长效果相对较差。由表3可知，2％和4％浓度中的OD₅₆₀值仅在第2、4天表现出差异显著(P<0.05)，在其他天数中差异不显著。4％与6％浓度中的OD₅₆₀值差异显著(P<0.05)，说明6％浓度的效果明显优于4％。6％与8％在第2、6天差异显著，在其他天数中不显著，8％与10％浓度中的OD₅₆₀差异不显著(P＞0.05)综合考虑成本及生长情况选择8％的添加比例较好。

表3钝顶螺旋藻在含有不同比例Zarrouk的沼液中的生长情况

注：同列之间小写字母上标不同为差异显著(P<0.05)，同行之间大写字母上标不同为差异显著(P<0.05)。

实施例4沼液培养钝顶螺旋藻后，沼液中NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N、P含量测定

选取50ml钝顶螺旋藻分别接种到2个250ml锥形瓶中，一个瓶中装有150ml稀释10倍的沼液，另一个瓶中装有150ml添加了8％Zarrouk后的稀释10倍的沼液，两者进行对照，各设置3个平行组。

将所有锥形瓶置于智能光照培养箱中进行培养，藻种培养条件为：温度26±1℃，光照强度8000lux，光周期L:D(光:暗)＝12:12，每天早晨8:00、中午12:30、晚上18:30定时摇瓶。整个培养周期10天，隔天取30ml含有钝顶螺旋藻的沼液，采用Eppendorf5804R台式高速大容量离心机在18℃，10000rmp条件下离心30min后取上清液，分别用纳氏试剂法、锌-镉还原法、重氮-偶氮光度法、钼蓝法测氨氮(NH₄ ⁺-N)、硝态氮(NO₃-N)、亚硝态氮(NO₂-N)和活性磷(P)的含量。使用紫外风光光度计及配套比色皿隔天测量水体中NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N和P的吸光值，以纯水作为参比调零，根据各指标标准曲线计算含量。

采用excel 2019处理NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N和P的标准曲线数据并绘图。横坐标为浓度ρ(mg/L)，纵坐标为系列标准溶液的校正吸光度A'。

A'＝b'{ρ}(mg/L)

由于实验的偶然误差，得到的回归方程一般会不通过原点，存在一个截距a:

A'＝a+b'{ρ}(mg/L)

计算水中各指标含量：

每个处理设3个平行，结果取平均值。原始数据采用excel 2019进行统计分析。3个平行组数据的平均值±标准误(Means±SE)作为最终数据；使用SPSS12.0统计分析软件，利用单因素方差分析对所有数据进行分析，P＜0.05表示差异显著。具体结果如下表4和表5所示。

表4沼液中NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N、P含量的变化

注：同列之间上标不同为差异显著(P<0.05)

由表4可知，沼液中NO₃-N、NO₂-N和P在前4天含量呈降低趋势，NH₄ ⁺-N的含量随培养天数减少。NH₄ ⁺-N的含量在第0、2和第4天差异显著(P<0.05)，NO₃-N、NO₂-N和P的含量均在第2、4天差异显著(P<0.05)。

表5添加8％Zarrouk后NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N、P含量的变化

注：同列之间上标不同为差异显著(P<0.05)

由表5可知，在沼液中添加8％的Zarrouk培养液后，水体中NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N和P含量均下降，经过9天的培养，钝顶螺旋藻对NH₄ ⁺-N、NO₃-N、NO₂-N和P的去除率分别达到58.58％、83.03％、77.4％和53.12％。

综上所述，经过处理后的沼液完全可以替代大部分的成品螺旋藻培养基，在规模化生产中，节约成本，提供经济藻类又开拓了一条途径。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于沼液培养螺旋藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，选取沼液，并进行预处理得上清液，备用，所得上清液的OD430低于0.4，重金属含量达到GB5084-2005符合农田灌溉水质的标准；

步骤2，选取螺旋藻，培养至OD560为0.9-10，备用；

步骤3，将上清液稀释8-20倍，并向稀释后的上清液中加入Zarrouk培养基，搅拌均匀后，得优化培养基备用；

步骤4，向优化培养基中加入螺旋藻藻液，光照培养，即可。

2.根据权利要求1所述的一种基于沼液培养螺旋藻的方法，其特征在于，所述沼液的预处理的步骤如下：首先，将取来的5倍浓缩鸡粪即沼液静置沉淀，取上清液；其次，购于射阳普鲁泰克废活性炭再生公司的不同规格的活性炭来将活性炭置于纯水中过夜后，隔天晒干使用；再次，然后依次用不同规格的活性炭对上清液进行脱臭和脱色处理，以1.2 ml/min的流速进行2次过滤；最后，用紫外线杀菌器进行灭菌，即得适用的沼液按照体积取螺旋藻的藻液于上清液中，即可。

3.根据权利要求1所述的一种基于沼液培养螺旋藻的方法，其特征在于，步骤3中Zarrouk培养基的体积分数为8%。

4.根据权利要求1所述的一种基于沼液培养螺旋藻的方法，其特征在于，步骤4中光照培养条件为温度26±1℃，光照强度8000 lux，光周期L:D(光:暗)=12:12，每天早晨8:00、中午12:30、晚上18:30定时摇瓶。

5.根据权利要求1所述的一种基于沼液培养螺旋藻的方法，其特征在于，步骤4中螺旋藻藻液与优化培养基的的体积比为1:3。

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