CN112121009B - 一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂至少包括聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子、辅料、注射用水；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的浓度为5‑15mg/mL；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的pH值为4‑4.4。本发明提供的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子新制剂，避免使用聚山梨酯作为稳定剂，在人体内不会引起血压降低、心率加快、溶血等副作用。通过精氨酸替代聚山梨酯，对蛋白质结构起到稳定作用，显著降低了蛋白质聚集体的形成，对聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的稳定性作用得到显著的提升。

Description

一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
背景技术
近年来，国内外生物药物行业的发展水平和速度均有大幅提高，越来越多的生物药应用于人类各类疾病，重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granuLocytecoLony-stimuLating factor，rhG-CSF)能够应用于癌症化疗等原因导致中性粒细胞减少症，由于蛋白药物的自身特性，rhG-CSF具有短效性、易受体内酶解作用等缺点。
聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子是重组人粒细胞刺激因子与单甲氧基聚乙二醇共价缀合物，由重组人粒细胞刺激因子N端甲硫氨酸的氨基与单醇共价结合。聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子用于非髓性恶性肿瘤患者在接受会发生有临床意义发热性中性粒细胞减少的抑制骨髓的抗肿瘤药治疗时，降低因发热性中性粒细胞减少而引起的感染发生率。
目前国内外各种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子中常用的缓冲体系为醋酸-醋酸钠缓冲液，同时常添加聚山梨酯作为蛋白质稳定剂。聚山梨酯可帮助稳定蛋白质结构起到助溶作用，可以减少蛋白质聚集形成，增加制剂的稳定性。但是聚山梨酯在人体内可引起血压降低、心率加快、溶血等副作用。
发明内容
为了避免使用聚山梨酯作为稳定剂带来的副作用，本发明第一个方面提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂至少包括聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子、辅料、注射用水；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的浓度为5-15mg/mL；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的pH值为4-4.4。
作为一种优选的技术方案，所述辅料选自蛋白质稳定剂、渗透压调节剂、缓冲剂、冻存保护剂中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述蛋白质稳定剂选自蔗糖、海藻糖、氨基酸、聚乙二醇、乙醇、甘露醇、甘油、乙二醇、聚山梨酯中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸中的一种或多种。
作为一种优选的技术方案，所述渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、山梨醇、硫酸钾中的一种或几种。
作为一种优选的技术方案，所述山梨醇的浓度为40-60mg/mL。
作为一种优选的技术方案，所述缓冲剂选自邻苯二甲酸、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸、乙酸钠、甘氨酸、2-吗啉代乙磺酸中的至少两种。
作为一种优选的技术方案，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂在35-39℃试验后蛋白质含量为9.5-10.5mg/mL、蛋白质纯度大于98％。
作为一种优选的技术方案，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂在35-39℃试验后10μm及10μm以上的不溶性微粒数小于200个/mL，25μm以上的不溶性微粒数小于30个/mL。
本发明第二个方面提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法，包括如下步骤：将辅料加入注射用水，搅拌至混合均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
有益效果：本发明提供的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子新制剂，避免使用聚山梨酯作为稳定剂，在人体内不会引起血压降低、心率加快、溶血等副作用。通过精氨酸替代聚山梨酯，对蛋白质结构起到稳定作用，显著降低了蛋白质聚集体的形成，且柠檬酸缓冲液和渗透压调节剂共同作用，对聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的稳定性作用得到显著的提升。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“2至3”和“3至4”、“4至5”和“3至5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂至少包括聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子、辅料、注射用水；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的浓度为5-15mg/mL；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的pH值为4-4.4。
聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子
本发明中，所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)，是重组人粒细胞刺激因子与单甲氧基聚乙二醇共价缀合物，由重组人粒细胞刺激因子N端甲硫氨酸的氨基与单醇共价结合。单甲氧基聚乙二醇的分子量约为20kD，聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的平均分子量为39kD。聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子用于非髓性恶性肿瘤患者在接受会发生有临床意义发热性中性粒细胞减少的抑制骨髓的抗肿瘤药治疗时降低因发热性中性粒细胞减少而引起的感染发生率。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的平均分子量为39kD，所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子自制。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法，包括如下步骤：
(1)rhG-CSF反应溶液(40mL，浓度为3mg/mL)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有120mM维生素B6，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇醛(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌；
(2)反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0mL/min流速进行梯度洗脱。
本发明中，所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子只适用于非骨髓性癌症患者在接受易引起临床上显著的发热性中性粒细胞减少症发生的骨髓抑制性抗癌药物治疗，不用于造血干细胞移植的外周血祖细胞的动员。聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG-rhG-CSF)的作用机理是粒细胞刺激因子与造血细胞的表面受体结合后作用于造血细胞，从而刺激增殖、分化、定型与成熟细胞功能活化。与rhG-CSF相比，PEG-rhG-CSF能降低血浆清除率，延长半衰期。
聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子也具有不良反应：骨骼肌肉痛；便秘、恶心、呕吐、腹泻、纳差；乏力、发热、头晕、失眠、心率及心律紊乱；与所有治疗性蛋白一样，PEG-rhG-CSF具有潜在的免疫原性。
本发明通过向聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子中加入特定的辅料，不仅可以改变药物的给药途径和作用方式，使用一药物多种不同的治疗目的，还可增强主药的稳定性，并延长药品的有效期，使聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子容易被人体吸收，增强和(或)扩大聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的作用和疗效，更重要的是减少聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的不良反应。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的浓度为10mg/mL。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的pH值为4.2。
本发明人发现，当本发明采用精氨酸等辅料，替代聚山梨酯，避免使用聚山梨酯作为稳定剂，在人体内可不会引起血压降低、心率加快、溶血等副作用。
辅料
在一种实施方式中，所述辅料选自蛋白质稳定剂、渗透压调节剂、缓冲剂、冻存保护剂中的一种或多种。
(蛋白质稳定剂)
本发明中，所述蛋白质稳定剂是可以减慢蛋白质反应，保持化学平衡，降低表面张力，防止光、热分解或氧化分解等作用。所述蛋白质稳定剂由优质乳化剂和胶体复合而成，可用于蛋白类药物的生产，起到稳定、改善蛋白类药物品质，使蛋白类药物具有长久的稳定性，提高蛋白类药物的保存时间。防止加工过程中蛋白类药物分层现象，能使蛋白质不沉淀。
在一种实施方式中，所述蛋白质稳定剂选自蔗糖、海藻糖、氨基酸、聚乙二醇、乙醇、甘露醇、甘油、乙二醇、聚山梨酯中的一种或多种；优选的，所述蛋白质稳定剂为氨基酸。
要保持蛋白质的活性，主要就是保持蛋白质的空间结构的稳定。影响蛋白质活性的因素主要有溶液的pH值、盐分和糖分的浓度、微生物的作用及空气的氧化等。
氨基酸是很好的抗氧化剂，但随着保存时间的延长，聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂中的氨基酸等有机物易受到空气、水中微生物的降解。
本发明中，所述氨基酸是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物，化学式是RCHNH2COOH。羧酸碳原子上的氢原子被氨基取代后形成的化合物。氨基酸分子中含有氨基和羧基两种官能团。与羟基酸类似，氨基酸可按照氨基连在碳链上的不同位置而分为α-，β-，γ-...w-氨基酸，但经蛋白质水解后得到的氨基酸都是α-氨基酸，而且仅有二十几种，它们是构成蛋白质的基本单位。氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。
在一种实施方式中，所述氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸中的一种或多种；优选的，所述氨基酸为精氨酸。
本发明中，所述精氨酸(Arginine)，化学式为C6H14N4O2，分子量为174.20，是氨基酸类化合物。本品在人体内参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成，使人体内产生的氨经鸟氨酸循环转变成无毒的尿素，由尿中排出，从而降低血氨浓度。本品有较高浓度的氢离子，有助于纠正肝性脑病时的酸碱平衡。与组氨酸，赖氨酸共同为碱性氨基酸。化学式C6H14N4O2，CAS号74-79-3。
白色斜方晶系(二水物)晶体或白色结晶性粉末，熔点244℃(分解)，经水重结晶后，于105℃失去结晶水，其水溶性呈强碱性，可从空气中吸收二氧化碳，溶于水(15％，21℃)，不溶于***，微溶于乙醇。
本发明中，精氨酸通过促使尿素的生成和***，有助于将血液中的氨转变为尿素而***出去，可有效提高免疫力、促进免疫***分泌自然杀伤细胞、吞噬细胞、白血球内烯素(interLeukin-1)等内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染。加上精氨酸是鸟氨酸(L-ornithine)及脯氨酸(L-proLine)的前趋物，脯氨酸是构成胶原蛋白的重要元素。精氨酸的加入，可以替代聚山梨酯，对蛋白质结构起到稳定作用，在人体内不会引起血压降低、心率加快、溶血等副作用，精氨酸安全性更高。
在一种实施方式中，所述精氨酸的含量为0.8-1mg/mL；优选的，所述精氨酸的含量为0.87mg/mL。
本发明人在研究过程中发现，本发明中，当精氨酸的含量为0.8-1mg/mL，对蛋白质结构的稳定性和对病人的安全性均是最好的，这是由于精氨酸过低，其对蛋白的稳定性作用太弱，但当其含量达到3.48mg/mL时，其易吸收空气中的二氧化碳，影响聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的活性，且其有较高浓度的氢离子，会影响非髓性恶性肿瘤患者发热性中性粒细胞的生存环境，精氨酸的含量达到1.74mg/mL时，虽然对蛋白质的稳定作用可以提高，但会降低非髓性恶性肿瘤患者发热性中性粒细胞，增加感染发生率。
(渗透压调节剂)
在一种实施方式中，所述渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、山梨醇、硫酸钾中的一种或几种；优选的，所述渗透压调节剂为山梨醇。
本发明中，所述山梨醇，别名山梨糖醇，英文名SorbitoL、D-GLucitoL、SorboL、D-SorbitoL。分子式是C6H14O6，分子量为182.17。为白色吸湿性粉末或晶状粉末、片状或颗粒，无臭。依结晶条件不同，熔点在88～102℃范围内变化，相对密度约1.49。易溶于水(1g溶于约0.45mL水中)，微溶于乙醇和乙酸。有清凉的甜味，甜度约为蔗糖的一半，热值与蔗糖相近。食品工业中多为69～71％含量的山梨糖醇液。毒性试验显示，内服过量会引起腹泻和消化紊乱。化学结构式为：
Figure BDA0002699723360000061
本发明中，所述山梨醇为D-山梨醇，CAS号9028-21-1。
本申请人在研究过程中发现，向聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂中加入D-山梨醇，其分子中含有六个羟基，有吸湿、保水作用，与聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的亲和性好，且其分子支链结构，其分子位阻较大，能提高对蛋白质分子的阻隔作用，减少蛋白质聚集形成，增加制剂的稳定性；且D-山梨醇与精氨酸、柠檬酸缓冲液存在的氢键间作用，提高游离精氨酸的稳定性，避免精氨酸与空气中二氧化碳反应，进而提高蛋白纯度，减少不溶性微粒。
在一种实施方式中，所述山梨醇的含量为40-60mg/mL；优选的，所述山梨醇的含量为47.5-52.5mg/mL；更优选的，所述山梨醇的含量为50mg/mL。
本申请人在进一步研究过程中发现，D-山梨醇的加入不仅使聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂为无色透明液体、减少10μm及10μm以上的不溶性微粒数和25μm以上的不溶性微粒数。本申请人意外的发现，当山梨醇的含量为47.5-52.5mg/mL，非髓性恶性肿瘤患者发热性中性粒细胞内外即不会出现吸水膨胀，也不会出现失水收缩等，能保持非髓性恶性肿瘤患者发热性中性粒细胞内外的水平衡，避免注射聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子新制剂带来的各种不良反应。
(缓冲剂)
在一种实施方式中，所述缓冲剂选自邻苯二甲酸、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸、乙酸钠、甘氨酸、2-吗啉代乙磺酸中的至少两种；优选的，所述缓冲剂为柠檬酸和柠檬酸钠。
本申请人在研究过程中发现，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系代替醋酸-醋酸钠缓冲体系，可以实现更好的缓冲效果，且对蛋白质的稳定作用更好。发明人猜测的原因可能使由于柠檬酸具有支链结构且具有三个羧基，柠檬酸与D-山梨醇、精氨酸间相互作用更强，对蛋白质分子的阻隔作用也较强，且其安全性更高。
在一种实施方式中，所述柠檬酸、柠檬酸钠的含量分别为1.8-2.5mg/mL、2.5-3.5mg/mL；优选的，所述柠檬酸、柠檬酸钠的含量分别为2.10mg/mL、2.94mg/mL。
本申请人在进一步的研究过程中发现，当柠檬酸不高于1.05mg/mL、柠檬酸钠的含量不高于1.47mg/mL时，其缓冲能力弱，会导致聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂有白色浑浊，而当柠檬酸、柠檬酸钠的含量过高时，尤其是柠檬酸钠的含量过高时，会导致离子强度过高，影响蛋白质的稳定性。
本发明中，所述冻存保护剂包括但不限于聚乙二醇、1,2-丙二醇、白蛋白、氯化钠。
在一种优选的实施方式中，所述辅料包括蛋白质稳定剂、渗透压调节剂、缓冲剂。
注射用水
本发明中，所述注射用水指符合中国药典注射用水项下规定的水。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂在35-39℃试验后蛋白质含量为9.5-10.5mg/mL、蛋白质纯度大于98％。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂在35-39℃试验后10μm及10μm以上的不溶性微粒数小于200个/mL，25μm以上的不溶性微粒数小于30个/mL。
本发明第二个方面提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法，包括如下步骤：将辅料加入注射用水，搅拌至混合均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸1.05mg、柠檬酸钠1.47mg、D-山梨醇50mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法，包括如下步骤：
(1)rhG-CSF反应溶液(40mL，浓度为3mg/mL)，内含100mM磷酸钠，pH5.0，还含有120mM维生素B6，将其充分搅拌冷冻(4℃)后，加入5倍蛋白质量的甲氧聚乙二醇醛(平均分子量为20kDa)。反应混合物在相同温度下持续搅拌；
(2)反应过程中蛋白质的修饰率用RP-HPLC来对其监测，RP-HPLC使用的是C18 250×4.6mm 5μm柱(phenomenex)，用0.1％三氟乙酸水溶液，0.1％三氟乙酸乙腈，以1.0mL/min流速进行梯度洗脱。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法为：将柠檬酸、柠檬酸钠、D-山梨醇、精氨酸加入注射用水，搅拌至混合均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
实施例2
实施例2提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇50mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例3
实施例3提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸3.15mg、柠檬酸钠4.41mg、D-山梨醇50mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例4
实施例4提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸4.2mg、柠檬酸钠5.88mg、D-山梨醇50mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例5
实施例5提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇0mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例6
实施例6提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇100mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例7
实施例7提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇200mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例8
实施例8提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇50mg、精氨酸0mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例9
实施例9提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇50mg、精氨酸1.74mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例10
实施例10提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇50mg、精氨酸3.48mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法同实施例1。
实施例11
实施例11提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、柠檬酸2.1mg、柠檬酸钠2.94mg、D-山梨醇50mg、聚山梨酯20 0.04mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法为：将柠檬酸、柠檬酸钠、D-山梨醇、聚山梨酯20加入注射用水，搅拌至混合均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
实施例12
实施例12提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、醋酸钠0.245mg、冰醋酸调节pH为4.0、D-山梨醇50mg、精氨酸0.87mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法为：将醋酸钠、D-山梨醇、精氨酸加入注射用水，搅拌至混合均匀，加冰醋酸调节pH为4.0，搅拌均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
实施例13
实施例13提供了一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂，其组成为：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子10mg、醋酸钠0.245mg、冰醋酸调节pH为4.0、D-山梨醇50mg、聚山梨酯20 0.04mg、注射用水加至1mL；
所述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的制备方法同实施例1。
所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂的制备方法为：将醋酸钠、D-山梨醇、聚山梨酯20加入注射用水，搅拌至混合均匀，加冰醋酸调节pH为4.0，搅拌均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂。
性能测试
一、选择实施例1-13所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂测试其外观、pH值、蛋白含量、蛋白纯度，测试结果见表3。
1.外观：
在避光室内或暗处，手持供试品容器瓶颈部于遮光板边缘处，轻轻旋转和翻转容器，使药液中可能存在的可见异物悬浮(注意不使药液产生气泡)，在明视距离(指供试品至人眼的清晰观察距离，通常为25cm)，分别在黑色和白色背景下，用目检视，检查时限为20秒。每次检查拿取2支供试品。供试品溶液中有大量气泡产生影响观察时，需静置足够时间至气泡消失后检查。检查无色供试品溶液时，被观察供试品放置处的光照度应为1000～1500Lx；检查透明塑料容器或有色供试品溶液时，被观察供试品放置处的光照度应为2000～3000Lx。
2.pH值：
测试前，确定校准标准液组选项为本次校准使用的校准标准液组，根据供试品溶液pH值选择合适的校准液，采用三点校准对pH计进行校准；校准完毕，取供试品检测，读取结果。
注意事项：
每次更换标准缓冲液或供试品溶液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸干，也可用所换的标准缓冲液或供试品溶液洗涤；
在测定高pH值的供试品和标准缓冲液时，应注意碱误差的问题，必要时选用适当的玻璃电极测定。
3.蛋白质含量：
3.1实验准备
仪器：高效液相色谱仪、电子天平、超声波清洗机、涡旋混合器、pH计色谱柱：L＝0.25m，Φ＝4.6mm；固定相：C18丁基键合相硅胶(5μm)
稀释液(10mmoL/L醋酸钠缓冲液)：称取醋酸钠0.136g，加80mL超纯水溶解混匀后，用冰醋酸调节pH值至4.0，加水定容至100mL，混匀备用；
流动相：流动相A(0.1％三氟乙酸水溶液)：量取1mL三氟乙酸加入1000mL超纯水中混匀，超声10-15分钟，备用；流动相B(0.1％三氟乙酸乙腈溶液)：量取1mL三氟乙酸加入1000mL乙腈中混匀，超声10-15分钟，备用；
色谱条件：柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：214nm；进样量15μg，进样体积不小于10μL；
样品处理：
标准品处理：用10mmoL/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)调节蛋白浓度，使得进样量在15μg；
供试品处理：用10mmoL/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)调节蛋白浓度，使得进样量在15μg；
3.2操作程序：
打开电脑及液相色谱***，自检完毕后调出工作站软件；
排除管道中及泵前气体；
打开排液阀，调整流动相A为100％，流速至5mL/min，洗出管道中残留溶液，然后调整流动相B为100％流速至1mL/min，关闭排液阀，冲洗检测器及进样管道中的残留溶液，然后将流速调至0.1mL/min并在该流速下装柱；
逐步调节流动相B为40％，流速至1.0mL/min，平衡色谱柱至基线平衡；
设置梯度洗脱程序(见表1)：
表1
T(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 1.0 60 40
25 1.0 20 80
30 1.0 0 100
31 1.0 60 40
37 1.0 60 40
进标准品溶液，记录色谱图，重复进样3次；
进供试品溶液，记录色谱图，重复进样3次(中间品进样1次)，计算公式：含量(％)＝(A样×P对×N样)/(N对×A对×标示量)，其中，A样：供试品溶液主成分峰面积；N样：供试品溶液稀释倍数；A对：对照品溶液主成分峰面积；P对：对照品溶液含量；N对：对照品溶液稀释倍数；标示量：供试品标示量。
4.蛋白质纯度：
4.1实验准备：
仪器：高效液相色谱仪、电子天平、超声波清洗机、涡旋混合器、pH计；
色谱柱：L＝0.25m，Φ＝4.6mm；固定相：Jupiter C18丁基键合相硅胶(5um)；
稀释液(10mmoL醋酸钠缓冲液)：称取醋酸钠0.136g，加80mL超纯水溶解混匀后，用冰醋酸调节pH值至4.0，加水定容至100mL，混匀备用；
检测液：用稀释液将待检样品稀释至约0.5mg/mL；
流动相：
流动相A(0.1％三氟乙酸水溶液)：量取1mL三氟乙酸加入1000mL超纯水中混匀，超声10-15分钟，备用；
流动相B(0.1％三氟乙酸乙腈溶液)：量取1mL三氟乙酸加入1000mL乙腈中混匀，超声10-15分钟，备用；
色谱条件：柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：214nm；进样体积：修饰液进样50uL、反应终止液进样100uL，将原液、成品供试品溶液稀释至0.5mg/mL进样50uL；
4.2操作程序
打开电脑及液相色谱***，自检完毕后调出工作站软件；
排除管道中及泵前气体；
打开排液阀，调整流动相A为100％，流速至5mL/min，洗出管道中残留溶液，然后调整流动相B为100％流速至1mL/min，关闭排液阀，冲洗检测器及进样管道中的残留溶液，然后将流速调至0.1mL/min并在该流速下装柱；
逐步调节流动相B为5％，流速至1.0mL/min，平衡色谱柱至基线平衡；
设置梯度洗脱程序(见表2)：
表2
Figure BDA0002699723360000141
Figure BDA0002699723360000151
按洗脱梯度进行空白稀释液运行一次；
进检测液，记录色谱图。
表3
Figure BDA0002699723360000152
二、选择实施例2和实施例5-7所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂测试其渗透压，测试结果见表4。
5.渗透压：
采用测量溶液的冰点下降来间接测定其摩尔渗透压浓度，在理想的稀溶液中，冰点下降符合ΔTf＝Kf×m的关系，式中，ΔTf为冰点下降，Kf为冰点下降常数(当水为溶剂时为1.86)，m为重量摩尔浓度。而渗透压符合Po＝Ko×m的关系，式中，Po为渗透压，Ko为渗透压常数，m为溶液的重量摩尔浓度。由于两式中的浓度等同，故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压；
5.1准备工作
渗透压摩尔浓度标准液：
100mOsmoL/kg，200mOsmoL/kg，300mOsmoL/kg，400mOsmoL/kg。
供试品溶液：
供试品溶液如为液体，通常可直接测定；
供试品若其渗透压摩尔浓度大于700mOsmoL/kg或为浓溶液，可用适宜的溶剂(通常为注射用水)稀释至测定范围内；
供试品若为固体(如注射用无菌粉末)，可采用药用标签或说明书中的规定溶剂溶解并稀释至测定范围内；
需要特别注意的是，溶液经稀释后，粒子间的相互作用与原溶液有所不同，一般不能简单的将稀释后的测定值乘以稀释倍数来计算原溶液的渗透压摩尔浓度。例如甘露醇注射液、氨基酸注射液等高渗溶液和注射用无菌粉末可用适宜的溶剂(如注射用水)溶解、稀释后测定，并用各品种项下规定的具体的溶解或稀释方法；
仪器设备：冰点渗透压仪、微量移液器(20μL、100μL、200μL、1mL)、微量离心管；
5.2操作程序：
仪器校准：选择仪器校准程序，然后用干净的测定管取100μL超纯水，固定在传感器上，按“确认”键校准；
选择量程：在仪器选择仪器量程选项中选择测定样品所需的量程；
校准仪器量程：选择校准仪器量程程序，然后用干净的测定管取100μL标准溶液进行校准。校准时应选择两种标准溶液(供试品溶液的渗透压摩尔浓度应介于两者之间)校正仪器。每个量程应校准4次，存入后三次的平均值；
样品测定：选择测定摩尔浓度选项，用干净的测定管取100μL样品进行测定，每个样品测定两次；
测定结果处理：选择数据统计分析选项可以对测定的数据进行查询、打印。
表4
Figure BDA0002699723360000161
Figure BDA0002699723360000171
三、选择实施例2和实施例8-13所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子新制剂测试其不溶性微粒，测试结果见表5。
6.不溶性微粒
当液体中的微粒通过一窄小的检测区时，与液体流向垂直的入射光，由于被微粒阻挡而减弱，因此由传感器输出的信号降低，这种信号变化与微粒的截面积大小相关；
6.1准备工作：
不溶性微粒检测仪：包括取样器、传感器和数据处理器三部分；测量粒径范围为2-100μm，检测微粒浓度为0-10000个/mL；
试验环境及检测：
试验操作环境应不得引入外来微粒，测定前的操作应在层流净化台中进行；玻璃仪器及其他用品均应清洁、无微粒；所用的微粒检查用水，使用前须经不大于1.0μm的微孔滤膜滤过；
取微粒检查用水50mL，用光阻法检测，连续测定3次，每次取样量不低于5mL，读取后两次的测定结果，要求每10mL中含10μm及10μm以上的不溶性微粒应在10粒以下，含25μm及25μm以上的不溶性微粒应在2粒以下。否则表明微粒检查用水、玻璃仪器或试验环境不适于进行微粒检查，应重新处理，检测符合规定后方可进行供试品检查；
仪器的校正与检定：所用仪器应至少每6个月校正一次；
取样体积的准确性：待仪器稳定后，取多于取样体积的微粒检查用水置于取样杯中，称定重量，通过取样器由取样杯中量取一定体积的微粒检查用水后，再次称定重量。以两次称定的重量之差计算取样体积。连续测定3次，每次测得体积与量取体积的示值之差应在±5％以内。测定体积的平均值与量取体积的示值之差应在±3％以内。也可采用其他适宜的方法校正，结果应符合上述规定；
微粒计数的准确性：取相对标准偏差不大于5％，平均粒径为10μm的标准粒子，制成每1mL中含1000～1500微粒数的悬浮液，静置2分钟脱气或超声处理(80-120w)30秒脱气，开启搅拌器，缓慢搅拌使其均匀(避免气泡产生)，依法测定3次，记录5μm通道的累计计数，第一次数据不计，后两次测定结果的平均值与已知粒子数之差应在±20％以内；
传感器的分辨率：取相对标准偏差不大于5％、平均粒径为10μm的标准粒子(均值粒径的标准差应不大于1μm)，制成每1mL中含1000～1500微粒数的悬浮液，静置2分钟脱气或超声处理(80-120w)30秒脱气，开启搅拌器，缓慢搅拌使其均匀(避免气泡产生)，依法测定8μm、10μm和12μm三个通道的粒子数，计算8μm与10μm两个通道的差值计数和10μm与12μm两个通道的差值计数，上述两个差值计数与10μm通道的累计计数之比都不得小于68％。若校正结果不符合规定，应重新调试仪器后再进行校正，符合规定后使用；
如所使用仪器附有自检软件，可进行自检；
6.2操作程序
标示装量为25mL或25mL以上的静脉用注射液或注射用浓溶液，除另有规定外，取供试品4个，分别按下法测定：用水将容器外壁洗净，小心翻转20次，使溶液混合均匀，立即小心启容器，先倒出部分供试品溶液冲洗开启口及取样杯，再将供试品溶液倒人取样杯中，静置2分钟或适当时间脱气泡，置于取样器上(或将供试品容器直接置于取样器上)。开启搅拌，使溶液混匀(避免气泡产生)，每个供试品依法测定3次，每次取样应不少于5mL，记录数据，弃第一次测定数据，取后续测定数据的平均值作为测定结果；
标示装量为25mL以下的静脉用注射液或注射用浓溶液，除另有规定外，取供试品4个，分别按下法测定：用水将容器外壁洗净，小心翻转20次，使溶液混合均匀，静置2分钟或适当时间脱气泡，小心开启容器，直接将供试品容器置于取样器上，开启搅拌或以手缓缓转动，使溶液混匀(避免产生气泡)，由仪器直接抽取适量溶液(以不吸入气泡为限)，测定并记录数据，弃第一次测定数据，取后续测定数据的平均值作为测定结果；
如注射用浓溶液如黏度太大，不便直接测定时，可经适当稀释后，依法测定；
也可采用适宜的方法，在洁净工作台小心合并至少4个供试品的内容物(使总体积不少于25mL)，置于取样杯中，静置2分钟或适当时间脱气泡，置于取样器上。开启搅拌，使溶液混匀(避免气泡产生)，依法测定至少4次，每次取样应不少于5mL。弃第一次测定数据，取后续3次测定数据的平均值作为测定结果，根据取样体积与每个容器的标示装置体积，计算每个容器所含的微粒数。
表5
Figure BDA0002699723360000191
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (2)

1.一种聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子制剂，其特征在于，所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子制剂由聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子、蛋白质稳定剂、渗透压调节剂、缓冲剂、注射用水组成；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子的浓度为5-15mg/mL；所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子制剂的pH值为4-4.4；
所述蛋白质稳定剂为精氨酸，所述精氨酸的含量为0.8-1mg/mL；
所述渗透压调节剂为D-山梨醇，所述D-山梨醇的浓度为40-60mg/mL；
所述缓冲剂为柠檬酸和柠檬酸钠。
2.一种根据权利要求1所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将蛋白质稳定剂、渗透压调节剂、缓冲剂加入注射用水，搅拌至混合均匀，再加入聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子，搅拌至混合均匀；再进行除菌、过滤，灌装，即得所述聚乙二醇修饰重组人粒细胞刺激因子制剂。
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