CN112111594A - 一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用 - Google Patents

一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用 Download PDF

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赵志
肖麓
杜德志
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Abstract

本发明提供了一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用，所述InDel分子标记包括N21和N30。N21和N30分子标记与甘蓝油菜多室基因Bnml1连锁，通过普通的PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。若以待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对进行PCR扩增反应，若N21扩增产物的长度为236bp，N30扩增产物的长度为144bp，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。

Description

一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引 物组和应用
技术领域
本发明涉及分子辅助育种技术领域，尤其涉及一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用。
背景技术
油菜是我国第一大油料作物。随着我国食用油需求的日益增长，目前我国食用油自给率不足。因此，发展油菜产业对于保障我国食用油安全意义重大，利用分子辅助育种等技术手段培育新品种和合理配套的栽培方法是目前提高油菜产量的有效途径。
油菜单株产量的构成因素包括全株有效角果数、每角果粒数和千粒重。研究表明，多室油菜由于增加了每果粒数，从而提高了单株的产量。因此，多室性状的研究对油菜产量性状的改良具有重要的意义。
多室性状在白菜型油菜和芥菜型油菜中的遗传规律较为简单，在白菜型油菜中多室性状由一对基因控制，在芥菜型油菜中多室性状受两对基因控制，且二室性状对多室为完全显性。目前已经完成白菜型油菜和芥菜型油菜多室基因的定位，并通过图位克隆的方法克隆了多室基因。但在甘蓝型油菜中多室基因的定位以及与基因连锁的分子标记未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括N21和N30；所述N21位于ChrA03的18005958～18006193bp；所述N30位于ChrA03的22842092～22842239bp；所述N21和N30的位点是以甘蓝型油菜Darmor v4.1为参考基因组。
本发明还提供了一种扩增上述方案所述InDel分子标记的引物组，包括扩增N21的引物对N21-F和N21-R以及扩增N30的引物对N30-F和N30-R；所述N21-F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述N21-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述N30-F的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述N30-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述方案所述InDel分子标记或者所述引物组在油菜分子辅助育种中的应用。
本发明还提供了上述方案所述InDel分子标记或者所述引物组在鉴定甘蓝型油菜多室性状中的应用。
优选的，所述甘蓝型油菜包括甘蓝型多室油菜1332。
优选的，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA；
2)以所述待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对分别进行PCR扩增反应，分别得到N21扩增产物和N30扩增产物；
3)利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测所述N21扩增产物和N30扩增产物；若N21扩增产物的长度为236bp，N30扩增产物的长度为144bp，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
优选的，步骤1)中所述甘蓝型油菜叶片为苗期的甘蓝型油菜叶片。
优选的，所述扩增N21的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，包括以下组分：模板1μL、dNTPs 0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer1μL、N21-F 0.5μL、N21-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL；
所述扩增N30的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，包括以下组分：模板1μL、dNTPs 0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer 1μL、N30-F 0.5μL、N30-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃、10min；94℃、10s，55℃、30s，72℃、45s，34个循环；72℃、10min；4℃、30min。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括N21和N30。N21和N30分子标记与甘蓝油菜多室基因Bnml1连锁，通过普通的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。若以待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对进行PCR扩增反应，若同时扩增出长度为236bp和144bp的片段，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
附图说明
图1为分子标记N21在BC1群体1345～1376中的扩增结果；
图2为分子标记N30在BC1群体1345～1376中的扩增结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记，所述N21位于ChrA03的18005958～18006193bp，二室亲本较多室亲本在18006041～18006046bp的位置缺失了6bp，缺失的具体序列为GCTGCA；所述N30位于ChrA03的22842092～22842239bp，多室亲本较二室亲本在22842205～22842208bp的位置缺失了4bp，具体序列为CTTT。在本发明中，所述N21和N30的位点是以甘蓝型油菜Darmor v4.1为参考基因组。
本发明中，N21和N30分子标记与甘蓝油菜多室基因Bnml1连锁，通过普通的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。N21在甘蓝型多室油菜中的扩增片段为236bp，N30在甘蓝型多室油菜中的扩增片段为144bp。若以待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对进行PCR扩增反应，若同时扩增出长度为236bp和144bp的片段，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
本发明还提供了一种扩增上述方案所述InDel分子标记的引物组，包括扩增N21的引物对N21-F和N21-R以及扩增N30的引物对N30-F和N30-R；所述N21-F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：aacaaccaggttctgcagca；所述N21-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：tcactcacccgattgttgct；所述N30-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ttggtttcgcccctgttgat；所述N30-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：gggtggatggcagtttcttt。
本发明还提供了上述方案所述InDel分子标记或者所述引物组在油菜分子辅助育种中的应用。
本发明还提供了上述方案所述InDel分子标记或者所述引物组在鉴定甘蓝型油菜多室性状中的应用。
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：
1)苗期提取待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA；
2)以所述待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对分别进行PCR扩增反应，分别得到N21扩增产物和N30扩增产物：
3)利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测所述N21扩增产物和N30扩增产物；若N21扩增产物的长度为236bp，N30扩增产物的长度为144bp，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
本发明对所述提取待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规植物的基因组DNA的方法即可。
得到待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA后，本发明以所述待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对分别进行PCR扩增反应，分别得到N21扩增产物和N30扩增产物；利用所述扩增N21的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，优选的包括以下组分：模板1μL、dNTPs 0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer 1μL、N21-F 0.5μL、N21-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL；利用所述扩增N30的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，优选的包括以下组分：模板1μL、dNTPs 0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer 1μL、N30-F 0.5μL、N30-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL。
得到PCR扩增产物后，本发明利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测所述N21扩增产物和N30扩增产物；若N21扩增产物的长度为236bp，N30扩增产物的长度为144bp，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
在本发明中，N21在多室油菜中的扩增序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为(5’-3’)：
Figure BDA0002737917950000041
N30在多室油菜中的扩增序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为(5’-3’)：
Figure BDA0002737917950000051
在本发明中，N21在二室亲本中的扩增序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为(5’-3’)：
Figure BDA0002737917950000052
N30在二室亲本中的扩增序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为(5’-3’)：
Figure BDA0002737917950000053
本发明的资助项目包括：
1.春油菜区转基因油菜新品种培育子课题(2018ZX0802-0001-009)；
2.青海省“高端创新人才千人计划”。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)利用甘蓝型二室油菜青油14号为母本，以甘蓝型多室油菜1332为父本杂交得到F1，再以甘蓝型多室油菜为轮回亲本得到BC1群体。甘蓝型多室油菜除具有多室角果特性外，其余性状与普通甘蓝型油菜(角果性状为二室的油菜)一致。
(2)调查BC1群体单株的多室角果率。在青熟期统计每个单株的总角果数和多室角果数，计算单株的多室角果率。将单株的多室角果率从小到大排序后选出多室角果率最高和最低的单株各23株。
多室角果率＝(多室角果数/总角果数)*100％
(3)BSA分析
(a)DNA提取：用CTAB法提取亲本青油14号、甘蓝型多室油菜1332、以及选取的多室角果率最高和最低的单株共46株，还有二室亲本一株，多室亲本一株，总共48株。
(b)将多室角果率最低的23株单株DNA等量混合构建二室混池，将多室角果率高的23株单株DNA等量混合构建多室混池。
(c)文库构建与测序：将用于测序的亲本样品及分离群体极端单株混池进行质检，检测合格的样本用于PE文库的构建，每个样本DNA建一个PE文库。将基因组DNA随机打断至300～500bp的片段，连接测序接头。在测序芯片上制备DNA簇(DNA cluster)后在IlluminaHiSeq测序仪上进行PE150测序。
(d)变异检测：利用Cutadapt和Trimmomatic软件对下机的原始数据进行质控，得到的高质量clean data与参考基因组(Darmor v4.1)进行比对，进行变异检测。通过BWA软件、Samtools软件及Picard工具中的SortSam处理得到最终可以用于variant calling的BAM文件。最后使用GATK的HaplotypeCaller模块进行SNP和InDel的变异检测，获得的SNP和InDel变异在各个染色体上的分布如表1所示。
表1可用SNP及InDel在各个染色体上的分布
Figure BDA0002737917950000071
注：Chr为染色体编号，Length为染色体长度，SNPs为SNP的数量和密度，InDels为InDel的数量和密度。
(e)候选区间的确定。
基于筛选后获得的SNP/InDel标记，为了排除不可靠标记的影响，首先对SNP-index进行了筛选，使用的条件是：两个亲本的测序深度均大于8、两个池测序深度均大于10、两个池的SNP-index值不能同时大于0.8或者同时小于0.2、亲本间存在多态性(SNP-index值差异大于0.8)。基于筛选后的标记，使用QTLseqr软件分别计算了Δ(SNP-index)和G’，滑动窗口大小设为2Mb。分别在98.5％和99.99％的置信水平下确定Δ(SNP-index)和G’的阈值，选择阈值以上的区域作为与性状关联的区域，取两种算法下重合的区域确定为最终的候选区间。
(4)InDel标记的开发
根据重测序结果，选择目标区间内的InDel引物，在亲本及极端基因池中进行多态性的检测，获得15对具有多态性的InDel标记。
(5)局部遗传连锁图谱的构建
利用筛选到的InDel多态性引物对BC1群体中表型极端的单株进行检测，对每个标记的结果进行统计。利用JionMap 4.0构建遗传连锁图谱，通过Kosambi函数将重组率转化为遗传距离，绘制遗传图谱，最终将Bnml1限定在N21和N30之间。
实施例2
1)在与上述不同株系的BC1中调查多室角果率后将多室角果率从小到大排序，排序后选取极端的二室单株和多室单株各20株。
2)依据CTAB法提取这40个单株的DNA。
3)利用N21和N30标记PCR扩增后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
4)结合N21和N30标记可对极端的二室和多室单株进行区分，其中A代表N21标记二室亲本基因型，B代表N21标记多室亲本基因型，H代表N21标记杂合型，b代表N21标记多室纯合基因型，C代表N30标记二室亲本基因型，D代表N30标记多室亲本基因型，E代表N30标记杂合型，d代表N30标记多室纯合基因型。分子标记的结果显示，多室角果率范围在0％～8.42％的N21和N30标记的扩增结果均为杂合基因型，多室角果率范围77.25％～98.41％单株N21和N30标记的扩增结果均为与多室亲本一致的隐性纯合基因型，因此N21和N30标记可区分BC1群体中的极端二室和多室性状。结合两个分子标记的结果可区分极端二室和多室单株。若同时扩增出长度为236bp和144bp的片段，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状；若同时出现长度为230bp和148bp的片段，则说明待测甘蓝型油菜为极端二室性状。
结果参见表2、图1和图2。
表2 BC1群体中的极端单株多室角果率与N21和N30标记基因分型的结果
Figure BDA0002737917950000091
Figure BDA0002737917950000101
由表2可以看出N21标记在二室亲本和多室亲本中扩增出的条带长度分别为230bp和236bp，在BC1群体的极端二室材料中扩增出的条带包括230bp和236bp两条条带，在极端多室材料中仅扩增出236bp条带。N30标记在二室亲本和多室亲本中扩增出的条带长度分别为148bp和144bp，在BC1群体的极端二室材料中扩增出的条带包括148bp和144bp两条条带，在极端多室材料中仅扩增出144bp条带。
图1和图2中，1、2孔为二室亲本青油14号的扩增带型，3、4孔为多室亲本1332的扩增带型，5～24孔为表型表现为极端二室的单株的扩增带型，其多室角果率见表2，25～44孔为表型表现为极端多室的单株的扩增带型，其多室角果率见表2。图1和图2的扩增结果显示N21和N30作为共显性标记，可以区分显性纯合、杂合以及隐性纯合的基因型。N21和N30对极端二室单株的扫描结果均为杂合基因型，对极端多室单株的扫描结果为隐性纯合，因此结合N21和N30两个分子标记扫描的结果与BC1群体中极端二室和多室的表型有着很好的对应关系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青海省农林科学院
<120> 一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记及其引物组和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacaaccagg ttctgcagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcactcaccc gattgttgct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggtttcgc ccctgttgat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggtggatgg cagtttcttt 20
<210> 5
<211> 236
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 5
aacaaccagg ttctgcagca gcgtgtcctc cagttagcac cacgggatcc gttatggcca 60
cttcagatcc agcgaaagcc atggctgcag cagcagcagg caataactta aaaggaggag 120
ggaagacgca gcaacatcag ctgggacctc ctgggttcgg gctcccgtat gttcacgcgg 180
ttccctgtgc agttcaagtt aaacctgtag atcagaagca acaatcgggt gagtga 236
<210> 6
<211> 144
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 6
ttggtttcgc ccctgttgat aacagtacga aatatcgcta aagtcttacc cttttgtgat 60
tgctaatcaa attaattaaa atgaacaaaa aaggaattca aaccaaagta aacttttggt 120
cgaaaaagaa actgccatcc accc 144
<210> 7
<211> 230
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 7
aacaaccagg ttctgcagca gcgtgtcctc cagttagcac cacgggatcc gttatggcca 60
cttcagatcc agcgaaagcc atggcagcag caggcaataa cttaaaagga ggagggaaga 120
cgcagcaaca tcagctggga cctcctgggt tcgggctccc gtatgttcac gcggttccct 180
gtgcagttca agttaaacct gtagatcaga agcaacaatc gggtgagtga 230
<210> 8
<211> 148
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 8
ttggtttcgc ccctgttgat aacagtacaa aatatcgcta aagtcttacc cttttgtgat 60
tgctaatcat attaattaaa atgaacaaaa aaggaactca aaccaaagta aacctttttt 120
tggtcgaaaa agaaactgcc atccaccc 148

Claims (9)

1.一种用于鉴定甘蓝型油菜多室性状的InDel分子标记，所述InDel分子标记包括N21和N30；所述N21位于ChrA03的18005958～18006193bp；所述N30位于ChrA03的22842092～22842239bp；所述N21和N30的位点是以甘蓝型油菜Darmor v4.1为参考基因组。
2.一种扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物组，包括扩增N21的引物对N21-F和N21-R以及扩增N30的引物对N30-F和N30-R；所述N21-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述N21-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述N30-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述N30-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1所述InDel分子标记或者权利要求2所述引物组在甘蓝型油菜分子辅助育种中的应用。
4.权利要求1所述InDel分子标记或者权利要求2所述引物组在鉴定甘蓝型油菜多室性状中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述甘蓝型油菜包括甘蓝型多室油菜1332。
6.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA；
2)以所述待测甘蓝型油菜叶片的基因组DNA为模板，利用扩增N21的引物对和扩增N30的引物对分别进行PCR扩增反应，分别得到N21扩增产物和N30扩增产物；
3)利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测所述N21扩增产物和N30扩增产物；若N21扩增产物的长度为236bp，N30扩增产物的长度为144bp，则表示待测甘蓝型油菜为极端多室性状。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述甘蓝型油菜叶片为苗期的甘蓝型油菜叶片。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述扩增N21的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，包括以下组分：模板1μL、dNTPs0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer 1μL、N21-F 0.5μL、N21-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL；
所述扩增N30的引物对进行的PCR扩增反应以10μL计，包括以下组分：模板1μL、dNTPs0.8μL、taq酶0.1μL、10×buffer 1μL、N30-F 0.5μL、N30-R 0.5μL和ddH2O 6.1μL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃、10min；94℃、10s，55℃、30s，72℃、45s，34个循环；72℃、10min；4℃、30min。
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