CN112107535B - 包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物，根据本发明的用于改善皮肤的组合物表现出缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障的效果，并包含与此有关的多数蛋白质，因此改善皮肤的效果优异，并且通过使用永生化的神经干细胞，即使对神经干细胞进行重复培养，培养液中有效因子的组成及浓度也会保持一定，因此可有效地用作具有均匀功效的功能性化妆品或药品的原料。

Description

包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组 合物
技术领域
本发明涉及包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物。
背景技术
已知干细胞在人体内通过促进血管生成、抗炎作用、免疫调节作用等受损组织的微环境调节来参与生物学作用。这种生物学作用是由于从干细胞中游离出促进受损组织的保护及再生的各种抗炎细胞因子、抑制细胞凋亡的物质、促进细胞存活的物质而引起的。这被称为旁分泌效应(paracrine effect)。
同时，韩国专利公开号第10-0848056号公开了一种使用作为间充质干细胞的源自脂肪的干细胞培养液来抑制黑色素合成的方法，韩国专利公开号第10-2009-0116659号公开了一种包含源自脐带血的间充质干细胞培养液的美白化妆品组合物，但对于源自外胚层的神经干细胞培养液的缓解皮肤伤口、改善皮肤皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、皮肤抗炎、皮肤抗氧化、皮肤保湿或增强皮肤屏障的效果，尚无公开。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于改善皮肤的化妆品组合物，其包含作为有效成分的神经干细胞培养液，所述神经干细胞培养液表现出缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障的效果。
本发明的另一个目的在于提供一种用于改善皮肤的医药外品组合物，其包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液。
本发明的又另一个目的在于提供一种用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、或治疗或预防自身免疫疾病的药物组合物，其包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液。
本发明的发明人进行了大量的努力以开发包含神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物，其结果确认到，来源于脑组织的神经干细胞的培养液表现出缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障的效果，并包含与此有关的多数蛋白质，从而完成了本发明。
技术方案
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种用于缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障的化妆品组合物，其包含作为有效成分的神经干细胞培养液。
在另一个方面，本发明提供一种用于改善皮肤的医药外品组合物，其包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液。
在又另一个方面，本发明提供一种用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、或治疗或预防自身免疫疾病的药物组合物，其包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液。
在又另一个方面，本发明提供一种包含神经干细胞培养液的化妆品、医药外品或药物组合物，所述神经干细胞培养液包含选自激活素RIA/ALK-2(Activin RIA/ALK-2)、脂联素1(Adiponectin-1)、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1(Chordin-like 1)、Csk、EDA-A2、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、内皮抑素(Endostatin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、半乳凝素3(Galectins-3)、生长分化因子-3(GDF-3)、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3)、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2(ICAM-2)、***结合蛋白2(IGFBP-2)、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1F6、IL-1F8、IL-7、IL-15R Alpha、IL-20R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP1)、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule 1，PECAM-1)、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1(Mothers against decapentaplegic homolog 1，Smad1)、Smad4、音猬因子(Sonic Hedgehog，Shh N端)、组织因子途径抑制物(Tissue factor pathwayinhibitor，TFPI)、TGF-β5、血小板反应蛋白1(thrombospondin-1)、酪氨酸激酶受体(Tyrosine-protein kinase receptor，Tie-2)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Metalloproteinase inhibitor，TIMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF-C中的一种或多种蛋白质。
在又另一方面，本发明提供一种通过对永生化的神经干细胞(immortalizedNeural Stem Cells，imNSC)进行培养而获得的用于上述记载用途的化妆品、医药外品或药物组合物。
有益效果
根据本发明的神经干细胞培养液表现出缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障的效果，因此可有效地应用于化妆品、医药外品及药品。此外，通过使用永生化的神经干细胞，即使对神经干细胞进行重复培养，培养液中有效因子的组成及浓度也会保持一定，因此可有效地用作具有均匀功效的功能性化妆品或药品的原料。
附图说明
图1a示出了根据本发明的一个实施例的神经干细胞的X40放大倍率及X100放大倍率的显微镜照片，图1b示出了神经干细胞的生长速度图表，图1c示出了神经干细胞在不同继代培养下成为二倍体的时刻的图表。
图2a示出了表示在根据本发明的一个实施例的神经干细胞中巢蛋白、PAX6和SOX2的表达量的流式细胞分析结果，图2b示出了有巢蛋白、PAX6和SOX2表达的神经干细胞的荧光显微镜照片。
图3示出了将根据本发明的一个实施例的神经干细胞的mRNA进行分离，并确认在不同继代培养(p8，p10，p12)下神经干细胞特异性基因标记是否表达的结果。
图4示出了将根据本发明的一个实施例的神经干细胞分别分化为神经细胞(neuron)、星形胶质细胞(astrocyte)及少突胶质细胞(oligodendrocyte)后，通过免疫荧光染色法来确认在分化的各细胞中特异性标记是否表达的显微镜照片。
图5a及图5b示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，表示人表皮细胞(HaCaT)及人真皮成纤维细胞(HS68)的细胞存活率的图表。
图6a至图6d示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，在人表皮细胞(HaCaT)及人真皮成纤维细胞(HS68)中表示伤口恢复的显微镜照片(6a，6c)和比较伤口恢复率的图表(6b，6d)。
图7a示出了用不同浓度的根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液对人真皮成纤维细胞(HS68)进行处理后，确认COL1A1是否表达的电泳照片，图7b示出了比较COL1A1含量的图表，图7c示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液和脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，确认COL3A1是否表达的电泳照片，图7d示出了比较COL3A1含量的图表。
图8示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，对人真皮成纤维细胞(HS68)中的PICP表达量进行比较的图表。
图9示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，对人真皮成纤维细胞(HS68)中的弹性蛋白酶抑制活性进行比较的图表。
图10a至图10d示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下的抑制黑色素合成的效果。图10a及图10b为仅用神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液进行处理的情况，图10c及图10b为用黑色素细胞刺激素进行处理后，用神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液进行处理的结果。
图11示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液或脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，对参与黑色素生物合成过程的主要酶，即酪氨酸酶(Tyrosinase)的活性率进行比较的图表。
图12a至图12d示出了用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)处理人真皮成纤维细胞(HS68)以诱导炎症反应，然后用根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液和脂肪干细胞培养液以不同浓度进行处理的结果。图12a是表示IL-6、IL-1β及COX-2是否表达的电泳照片，图12b是对COX-2的表达量进行比较的图表，图12c是对IL-1β的表达量进行比较的图表，图12d是对IL-6的表达量进行比较的图表。
图13示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，为了测量人真皮成纤维细胞(HS68)中的细胞内活性氧(ROS)的浓度变化而比较DCF-DA荧光值的图表。
图14示出了在根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液及脂肪干细胞培养液的不同处理浓度下，对人真皮成纤维细胞(HS68)中的Trolox(水溶性维生素E)当量抗氧化能力进行比较的结果。
图15a及15b示出了用根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液和视黄酸对人表皮细胞(HaCaT)进行处理的结果。图15a是表示兜甲蛋白、内披蛋白、HAS-2及HAS-3是否表达的电泳照片，图15b是对兜甲蛋白、内披蛋白、HAS-2及HAS-3的表达量进行比较的图表。
图16示出了从根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液中分泌出的蛋白质成分的分析结果。
图17示出了对从根据本发明的一个实施例的神经干细胞培养液分泌出的蛋白质的表达强度进行测量的图表。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及一种包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物，其中，所述改善皮肤为缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞可为永生化的神经干细胞。具体而言，所述神经干细胞可为，通过将L-Myc表达载体转导(transduction)至从经过10周至14周的死产胎儿脑组织中分离的成体神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)而获得的永生化的神经干细胞。
所述神经干细胞优选在组成及浓度明确的培养基中进行培养，在神经干细胞培养过程中进行离心分离及过滤，从而可获得所述培养液。
将所述神经干细胞进行永生化和培养后，分离的过程不限于本发明的方法，可通过本领域中通常使用的方法进行。所述神经干细胞培养液可通过在所述神经干细胞的继代培养的过程中，进行离心分离后过滤上清液而获得，所述神经干细胞可通过分离细胞后进行均质化(homogenzization)的工序而获得。
从根据本发明的神经干细胞培养液的分泌蛋白质组(secretome)分析结果确认到，其包含激活素RIA/ALK-2(Activin RIA/ALK-2)、脂联素1(Adiponectin-1)、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1(Chordin-like 1)、Csk、EDA-A2、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、内皮抑素(Endostatin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、半乳凝素3(Galectins-3)、生长分化因子-3(GDF-3)、GDF 5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican 3)、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2(ICAM-2)、***结合蛋白2(IGFBP-2)、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1F6、IL-1F8、IL-7、IL-15R Alpha、IL-20R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP1)、MFG-E8、MMP-20、NRG1Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1(Platelet Endothelial CellAdhesion Molecule 1，PECAM-1)、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1(Mothersagainst decapentaplegic homolog 1，Smad1)、Smad4、音猬因子(Sonic Hedgehog，Shh N端)、组织因子途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)、TGF-β5、血小板反应蛋白1(thrombospondin-1)、酪氨酸激酶受体(Tyrosine-protein kinase receptor，Tie-2)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Metalloproteinase inhibitor，TIMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF-C。
在本发明的一个方面，所述神经干细胞培养液可包含与皮肤再生及抗老化有关的蛋白质，即可包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、腱蛋白样蛋白1(Chordin-like 1)、Csk、EDA-A2、EGF、bFGF、GDF3、GDF5、GDF15、GLO-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-7、潜在型TGF-β结合蛋白1、MFG-E8、MMP-20、PDGF-AA、PECAM-1、Smad1、Smad4、音猬因子(Shh N端)、TGF-β5、血小板反应蛋白1、Tie-2、VEGF或VEGF-C。
在本发明的另一个方面，所述神经干细胞培养液可包含参与促进胶原蛋白合成及改善皱纹的蛋白质，即可包含MCP-1、TIMP-1、bFGF、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、Smad1、Smad4、TGF-β5或血小板反应蛋白1。
在本发明的又另一个方面，所述神经干细胞培养液可包含作为参与美白效果的蛋白质的TGF-β5。
在本发明的又另一个方面，所述神经干细胞培养液可包含抗炎效果及预防自身免疫疾病所需的蛋白质，即可包含Axl、GRO、血小板反应蛋白1或TGF-β5。
在本发明的一个示例性实施例中，当皮肤组织中出现伤口时，所述神经干细胞培养液可通过再生皮肤细胞来缓解并治疗伤口。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞培养液可增加胶原蛋白的合成并通过抑制弹性蛋白酶的活性来抑制弹性蛋白的降解，从而防止皮肤老化。具体而言，所述神经干细胞培养液在mRNA水平和/或蛋白质水平上，例如，通过增加I型前胶原C末端蛋白质的分泌量来增加胶原蛋白的合成，从而可改善皮肤皱纹、增强皮肤弹性及再生皮肤，以抑制皮肤老化。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞培养液具有皮肤美白效果。具体而言，所述神经干细胞培养液通过抑制皮肤内黑色素的合成和抑制酪氨酸酶的活性，来抑制酪氨酸转换为黑色素，从而可减少皮肤内黑色素的含量。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞培养液具有去除细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的抗氧化效果。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞培养液具有缓解炎症反应的抗炎效果。具体而言，在皮肤细胞或免疫细胞发生炎症反应的情况下，可通过减少环氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)的表达量来缓解炎症反应。
在本发明的一个示例性实施例中，所述神经干细胞培养液具有皮肤保湿及增强皮肤屏障的效果。具体而言，所述神经干细胞培养液通过增加兜甲蛋白及内披蛋白的表达量来促进分化为角质细胞，从而可增强皮肤屏障，并通过增加HAS-2及HAS-3的表达来促进作为保湿因子的透明质酸的合成，从而可改善皮肤保湿力。
在表皮细胞中占95％的角质形成细胞在基底层中进行增殖，并经过上部的棘层、颗粒层，最终分化为扁平形态的无核的角质细胞。在这种分化过程中，通过在表皮的颗粒层和角质层中表达作为分化促进因子的兜甲蛋白(Loricirin)、在表皮的颗粒层和棘层上部中表达作为分化促进因子的内披蛋白(involucrin)等，使角质内角蛋白微纤维凝聚，从而形成角质细胞膜，由此有助于增强皮肤的屏障。
此外，兜甲蛋白和内披蛋白等在皮肤中形成天然保湿因子，从而对皮肤保湿起到重要的作用，除了天然保湿因子之外，皮肤还通过如透明质酸(HA)等的各种保湿因子来发挥皮肤保湿的功能。HA主要由角质形成细胞及成纤维细胞的透明质酸合成酶(Hyaluronicacid synthase，HAS)合成，并积累于细胞外基质。
所述组合物根据需要可制备成本领域中常用的化妆品剂型。
所述化妆品组合物例如可制备为溶液、悬浊液、乳浊液、糊剂、凝胶剂、霜剂、乳液、粉末、香皂、含有表面活性剂的洁面剂、油、粉末粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底及喷雾剂等，但不限于此。具体地，可制备为柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、喷雾或粉末的剂型。此外，当所述化妆品组合物的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂时，可包含选自动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶(tragacanth)、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌及它们的混合物中的载体成分。
此外，当所述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液时，可包含选自溶剂、溶剂化剂、乳化剂及它们的混合物中的载体成分。其实例包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、山梨糖醇酐脂肪酸酯及它们的混合物等。
此外，当所述化妆品组合物的剂型为悬浊液时，可包含选自如水、乙醇或丙二醇的液态稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨醇酐酯的悬浊剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄芪胶及它们的混合物中的载体成分。
基于所述化妆品组合物的总重量，所述载体成分的含量可为约1重量％至约99.99重量％，优选为约80重量％至约90重量％。
在另一个方面，本发明涉及一种包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液的用于改善皮肤的医药外品组合物，其中，所述改善皮肤为缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎或抗氧化。
所述神经干细胞培养液如上所述。
在本发明中，“医药外品”是指以治疗、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目的所使用的纤维、橡胶制品或与其类似的产品，对人体的作用微弱或不直接作用于人体、不是器具或机械的产品和与其类似的产品，作为用于预防感染的以杀菌、杀虫及与其类似的用途所使用的制剂中的一种，以诊断、治疗、减轻、处置或预防人或动物的疾病为目的所使用的产品中不是器具、机械或装置的产品，以及以对人或动物的结构和功能产生药理学影响为目的所使用的产品中不是器具、机械或装置的产品，包括皮肤外用剂及个人卫生用品。
在将根据本发明的组合物以改善皮肤等为目的包含于医药外品的情况下，可通过直接包含所述组合物来使用，或可与其他医药外品成分一同使用，可根据通常的方法适当使用。可根据使用目的来适当地决定有效成分的混合量。
在又另一个方面，本发明涉及一种用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、或治疗或预防自身免疫疾病的药物组合物，其包含作为有效成分的所述神经干细胞培养液。
所述神经干细胞培养液如上所述。
基于所述药物组合物的总重量，作为有效成分的所述神经干细胞培养液的含量可为约0.1重量％至约90重量％，具体可为约0.5重量％至约75重量％，更具体可为约1重量％至约50重量％。
所述药物组合物可包含根据常规方法配制成制剂的常规且无毒的药学上可接受的添加剂。例如，所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述药物组合物可施用于皮肤。所述药物组合物的剂型可为皮肤外用剂剂型。所述皮肤外用剂不受特别的限制，例如可制备成软膏剂、乳液剂、喷雾剂、贴剂、霜剂、散剂、悬浮剂、贴剂或凝胶剂的形式来使用。
在又一个方面，本发明提供一种神经干细胞培养液在制备用于改善皮肤的化妆品中的用途。
在又一个方面，本发明提供一种神经干细胞培养液在制备用于改善皮肤的医药外品中的用途。
在又一个方面，本发明提供一种神经干细胞培养液在制备用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、治疗或预防异位性皮肤炎或自身免疫疾病的药物中的用途。
实施例
下面将参照以下实施例更详细地描述上述内容。然而，下述实施例仅用于描述本发明，本发明的范围不限于此。
制备实施例1.脂肪干细胞培养液的制备
将从Promocell(Cat#C-12978)购买的脂肪干细胞进行3次或4次的继代培养后，添加DMEM/Low(Hyclone公司)、10％的FBS、10ng/mL的bFGF(basic Fibroblast GrowthFactors，碱性成纤维细胞生长因子)，并进一步进行培养。当汇合度(confluency)达到70％至80％时，将培养基替换为不含酚红的低糖DMEM(phenol-red free Low DMEM)，并在48小时的培养过程中获得脂肪干细胞培养液。
制备实施例2.神经干细胞及神经干细胞培养液的制备
将L-Myc表达载体[pMXs-hu-L-Myc]转导(transduction)至从10周至14周的胎儿脑组织中提取的神经干细胞(NSC)(LM-NSC008，City of Hope研究所)中，并通过选择(selection)过程来制备永生化的神经干细胞(immortalized neural stem cell，imNSC)(Okita等人，2013)。
制备包含不含苯酚的DMEM/F12(Gibco公司)、2％的补充剂(还原型谷胱甘肽(Glutathione reduced)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)、人全铁转铁蛋白(Holo-Transferin)、L-肉碱(L-Carnitine)、D+-半乳糖(D+-galactose)、腐胺(Putrescine)、亚油酸(Linoleic acid)、亚麻酸(Linolenic acid)、维生素A醋酸酯(Retinol acetate)、DL-α生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚醋酸酯(DL-alpha tocopherolacetate))、20ng/mL的bFGF和20ng/mL的EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子)的培养基后，使用该培养基培养永生化的神经干细胞。在将其进行继代培养的过程中获得培养液，培养后去除非粘附性细胞，以获得神经干细胞。此外，对获得的培养液进行离心分离，用0.22μm过滤器对上清液进行过滤，以获得神经干细胞培养液。
实验实施例1.神经干细胞的特性分析
实验实施例1.1.观察神经干细胞的生长速度
用显微镜X40倍率及X100倍率，对制备实施例2中获得的神经干细胞进行观察。然后，测量神经干细胞的细胞生长速度及在不同继代培养下成为二倍体的时刻，并用图表表示。图1a是显微镜照片，图1b是细胞生长速度图表，图1c是表示细胞成为二倍体的时刻的图表。
实验实施例1.2.确认神经干细胞特异性基因标记的表达
利用流式细胞分析法及实时聚合酶链式反应法(qRT-PCR)来确认制备实施例2中获得的神经干细胞的基因表达模式。
实验实施例1.2.1.利用流式细胞分析法确认基因表达
当制备实施例2中获得的神经干细胞的汇合度达到80％至90％时，除去培养基，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)进行洗涤。然后，用
Figure BDA0002548584630000091
分离细胞，用PBS洗涤细胞。对细胞数进行计数以制成1×106cells/mL后，利用4％的p-甲醛在4℃下对细胞进行20分钟的固定。将固定结束的细胞用PBS进行洗涤，然后用稀释有0.01％的Triton X-100(表面活性剂)的PBS进行处理以使抗体渗透，在室温下进行10分钟的透化(permeabilization)过程，然后用PBS进行洗涤。
然后，向细胞中添加FACS缓冲液，以使NESTIN-PE、PAX6-PE、SOX2-PE抗体反应后，利用荧光流式细胞分析仪(FACS)来确认神经干细胞特异性表达标记巢蛋白(Nestin)、PAX6及SOX2的表达。图2a是表示巢蛋白、PAX6和SOX2的表达量的图表，图2b是有巢蛋白、PAX6和SOX2表达的神经干细胞的荧光显微镜照片。
其结果，确认到制备实施例2中获得的细胞明显地表达了巢蛋白、PAX6及SOX2。
实验实施例1.2.2.利用qRT-PCR确认基因的表达
通过使用苯酚/氯仿，从制备实施例2中获得的神经干细胞中提取RNA。将提取的RNA进行逆转录以合成cDNA。在Applide Biosystems 700序列***(美国加利福尼亚州福斯特市)上执行qRT-PCR，以分析cDNA的基因表达水平。此时，合成的cDNA是利用如下表1所示的各个特异性引物组执行的。qPCR以95℃下10分钟、95℃下15秒、56℃下1分钟的循环重复进行30次。通过β-肌动蛋白数值将mRNA的水平进行标准化，并进行比较。其结果如图3所示。
【表1】
Figure BDA0002548584630000101
其结果确认到，在所述神经干细胞中，明显地表达了SOX1、SOX2、PAX6及巢蛋白。
由此可知，由于表达了作为神经干细胞特异性基因标记的SOX1、SOX2、PAX6和巢蛋白，因此在制备实施例2中获得的细胞具有神经干细胞的特性。
实验实施例2.确认神经干细胞的分化能力
将制备实施例2中获得的神经干细胞分别分化为神经细胞(neuron)、星形胶质细胞(astrocyte)及少突胶质细胞(oligodendrocyte)后，进行如下的免疫荧光染色法，以确认每种细胞内分化相关蛋白的表达。
首先，利用4％的p-甲醛，将维持于4孔腔室载玻片的神经干细胞在37℃下固定20分钟，然后用含有钙离子和镁离子的PBS进行2次的洗涤。之后，用稀释有0.1％的Triton X-100(表面活性剂)的PBS进行10分钟的处理，然后用PBS再次进行洗涤。为了防止因非特异性抗体的附着而被检测出非特异性抗体，将牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)在0.1％的Triton X-100/PBS中稀释至5％，然后添加到样品中并进行1小时的反应。
根据细胞所加入的第一抗体的种类不同，根据蛋白质的目标抗体及稀释量如下表2所示。加入第一抗体后，在4℃的振荡器中进行16小时的反应。根据第一抗体的宿主(host)和波长来选择并使用第二抗体，具体使用了Goat anti-mouse IgG-conjugated Alexa 488(abcam公司，cat.no.ab150113，稀释1000倍)、Anti-Mouse FITC(eBioscience公司，cat.no.ab150113，稀释1000倍)。
此外，利用DAPI(稀释1,000倍)对核进行染色。利用荧光显微镜拍摄完成染色的样品。神经细胞的核是通过用DAPI(蓝色)、神经细胞的表达因子MAP2(绿色)、星形胶质细胞的表达因子GFAP(绿色)、少突胶质细胞的表达因子O1(绿色)来表示。其结果如图4所示。
【表2】
分化细胞 第一抗体 第二抗体
神经细胞(neuron) 抗MAP2 山羊抗小鼠IgG Alexa 488
星形胶质细胞(astrocyte) 抗GFAP 山羊抗小鼠IgG Alexa 488
少突胶质细胞(oligodendrocyte) 抗O1 抗小鼠FITC
其结果确认到，在由神经干细胞分化的神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞中分别表达了MAP2、GFAP及O1。
由此可知，制备实施例2中获得的神经干细胞具有分化成神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。
实验实施例3.神经干细胞培养液的细胞毒性及细胞增殖效果的评估
利用人表皮细胞(HaCaT)及人真皮成纤维细胞(HS68)进行如下实验，以确认制备实施例2中获得的神经干细胞培养液的细胞毒性及细胞增殖效果。
将HaCaT及HS68分别以每孔1Х103
Figure BDA0002548584630000121
为单位分株于96孔板，并进行24小时的培养后，用阴性对照组(N.C；无处理组)、作为比较对照组的浓度为10％、25％、50％、100％的脂肪干细胞培养液、以及作为实验组的浓度为10％、25％、50％、100％的神经干细胞培养液进行处理。
用培养液进行处理后，利用CCK8(Dojindo公司，CK04-13)试剂，在第1天、第2天及第3天的相同时间测量450nm处的吸光度，确认细胞活性的变化。人表皮细胞的存活率如图5a所示，人真皮成纤维细胞的存活率如图5b所示。
其结果确认到，用神经干细胞培养液处理人表皮细胞及人真皮成纤维细胞的情况下，大部分表现出优异的存活率。
实验实施例4.确认神经干细胞培养液的缓解皮肤伤口的效果
将人表皮细胞(HaCaT)以每孔3Х105cells、人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔2Х105cells为单位分株于24孔板，并培养至汇合度达到100％。利用1000P白色尖端(whitetip)刮擦孔的正中间以形成伤口(wound)后，用阴性对照组(N.C)、脂肪干细胞培养液(比较对照组；浓度为10％、25％、50％、100％)及神经干细胞培养液(实验组；浓度为10％、25％、50％、100％)进行处理。
在培养液处理的当时及经过24小时后，分别对人表皮细胞和人真皮成纤维细胞的伤口面积进行测量，以确认恢复率。此时，一同示出了用结晶紫(crystalviolet)试剂对经过24小时后的细胞进行染色的显微镜照片。图6a和图6b是表示人表皮细胞(HaCaT)的伤口恢复率的显微镜照片及图表，图6c和图6d是表示人真皮成纤维细胞(HS68)的伤口恢复率的显微镜照片及图表。
其结果确认到，与阴性对照组及脂肪干细胞培养液相比，在用神经干细胞培养液处理人表皮细胞及人真皮成纤维细胞的情况下，伤口恢复迅速。
实验实施例5.确认神经干细胞培养液的胶原蛋白合成效果
实验实施例5.1.利用RT-PCR分析胶原蛋白基因的表达与否
将人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔1.0Х105cells的量分株于6孔板中，并进行24小时的培养。添加阴性对照组(N.C)、脂肪干细胞培养液(比较对照组；浓度为10％、25％、50％、100％)及神经干细胞培养液(实验组；浓度为10％、25％、50％、100％)，并进行24小时的培养后，利用下表3中记载的各个特异性引物组，按照实验实施例1.2.2.中所述的方法实施qRT-PCR，以测量胶原蛋白基因(COL1A1及COL3A1)的表达与否及表达量。
【表3】
Figure BDA0002548584630000131
图7a和图7b是表示COL1A1是否表达的电泳照片及测量其表达量的图表，图7c和图7d是表示COL3A1是否表达的电泳照片及测量其表达量的图表。
其结果确认到，与阴性对照组及脂肪干细胞处理的情况相比，在用神经干细胞培养液进行处理的情况下，胶原蛋白基因COL1A1及COL3A1的表达量增加。
实验实施例5.2.利用ELISA评估促进胶原蛋白合成的能力
将人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔1.0Х105cells的量分株于6孔板中，并进行24小时的培养。添加阴性对照组(N.C)、阳性对照组(TGF-β)、脂肪干细胞培养液(比较对照组；浓度为10％、25％、50％、100％)及神经干细胞培养液(实验组：浓度为10％、25％、50％、100％)，并进行48小时的培养后，对培养基进行离心分离，以获得上清液。通过利用I型前胶原羧基端肽(Procollagen Type I C-peptide，PICP)EIA试剂盒(Takara公司,Cat.#MK101)来分析前胶原的合成程度，以确认促进胶原蛋白合成的能力。其结果如图8所示。
其结果，与阴性对照组及脂肪干细胞培养液(比较对照组；10％、25％、50％、100％)处理的情况相比，在用神经干细胞进行处理的情况下，PICP的表达量高，且PICP的表达量也高于现有已知的阳性对照组。
由此可知，神经干细胞培养液具有改善皮肤皱纹及增加皮肤弹性的效果。
实验实施例6.确认神经干细胞培养液的抑制弹性蛋白酶活性的效果
通过弹性蛋白酶活性抑制分析法(Elastase inhibition assay)来测量根据神经干细胞培养液处理的弹性蛋白酶活性抑制程度。
具体地，将人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔1.0Х105cells的量分株于6孔板中，并进行24小时的培养。之后，添加50μl的0.6unit/mL猪胰弹性蛋白酶(Porcine Pancreaticelastase，PPE；在0.2M的Tris缓冲液，pH8.0中)、50μl的各个样品、100μl的1mg/mL N-Succ-(Ala)3-nitroanilide(SANA；DMSO)，并在10分钟内测定410nm处的吸光度。此时，将未处理组作为阴性对照组(N.C)，各个样品分别将膦酰二肽钠(Phosphoramidon disodium salt，PPDS；2.5mM)作为阳性对照组、将脂肪干细胞(浓度为10％、25％、50％、100％)作为比较对照组、将神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)作为实验组。其结果如图9所示。
如图9所示，与阴性对照组和脂肪干细胞培养液处理的比较对照组相比，在用神经干细胞培养液进行处理的情况下，弹性蛋白酶的抑制活性会以浓度依赖性地方式增加。
由此可知，神经干细胞培养液抑制弹性蛋白的降解，从而具有增加皮肤弹性的效果。
实验实施例7.确认神经干细胞培养液的皮肤美白效果
实验实施例7.1.神经干细胞培养液抑制黑色素合成的效果
将啮齿类B16F10黑素瘤细胞以每孔1.0Х105cells的量分株于6孔板中，次日用PBS进行洗涤以除去非粘附性细胞，然后用阴性对照组(N.C)、10Mm具有抑制细胞内黑色素生成效果的熊果苷(Albutin)作为阳性对照组、用脂肪干细胞培养液(ASC；浓度为10％、25％、50％、100％)作为比较对照组、以及用神经干细胞培养液(NSC；浓度为10％、25％、50％、100％)作为实验组进行处理。经48小时后，用PBS进行洗涤细胞，并用胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)获得细胞。
之后，每孔添加1ml的1N NaOH+50％DMSO溶液，在95℃下将细胞进行溶解后，利用酶标仪(micro plate reader)在405nm下对黑色素的吸光度进行测定，以测定黑色素的分泌量及细胞内含量。图10a示出了在用脂肪干细胞培养液或神经干细胞培养液处理时，黑素瘤细胞内是否合成黑色素的照片，图10b示出了表示黑色素含量的图表。
此外，用100nM的黑色素细胞刺激素(α-MSH)进行处理后，按照与上述方法相同的方法测定黑色素的分泌量及细胞内含量。图10c示出了在用α-MSH进行处理后，再用脂肪干细胞培养液或神经干细胞培养液进行处理时，黑素瘤细胞内是否合成黑色素的照片，图10d示出了表示黑色素含量的图表。
其结果确认到，在用神经干细胞培养液进行处理的情况下，与浓度成比例地表现出抑制黑色素合成的效果，并且抑制黑色素合成的效果更优于阴性对照组及脂肪干细胞培养液进行处理的情况。
实验实施例7.2.神经干细胞培养液抑制酪氨酸酶活性的效果
向96孔板中添加220μl的0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8，0.1％PMSF)和20μl的神经干细胞培养液，依次添加50μl的1.5mM酪氨酸(Tyrosine)、20μl的酪氨酸酶(Tyrosinase)并进行反应后，利用酶标仪测定492nm处的吸光度。此时，将未处理组作为阴性对照组(N.C)，用1mM的熊果苷作为阳性对照组、用脂肪干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)作为比较对照组、以及用神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)作为实验组进行处理。其结果如图11所示。
其结果确认到，与阴性对照组及脂肪干细胞培养液处理的比较对照组相比，在用神经干细胞培养液处理的情况下，抑制酪氨酸酶活性的效果更加优异。
由此可知，神经干细胞培养液抑制黑色素的合成及抑制酪氨酸酶的活性，从而具有皮肤美白效果。
实验实施例8.确认神经干细胞培养液的抗炎效果
将人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔2.5Х105cells的量分株于6孔板中，并培养至汇合度达到80％，然后替换为不含血清的培养基。经过24小时后，用诱发炎症反应的脂多糖(LPS；20μg/mL)、阴性对照组(N.C)、作为比较对照组的脂肪干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)及作为实验组的神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)进行处理。
在24小时后，从细胞中分离RNA以合成cDNA，按照实验实施例1.2.2.中记载的方法执行qRT-PCR，以确认COX-2、IL-1β及IL-6的表达量。图12a是表示IL-6、IL-1β及COX-2是否表达的电泳照片，图12b至12d是表示COX-2、IL-1β及IL-6的表达量的图表。
与阴性对照组及脂肪干细胞处理的情况相比，在用神经干细胞培养液进行处理的情况下，COX-2、IL-1β和IL-6的表达量较低。
由此可知，神经干细胞培养液具有抑制皮肤炎症的效果。
实验实施例9.确认神经干细胞培养液的抗氧化效果
实验实施例9.1.消除细胞内活性氧(ROS)的效果
使用包含羧基-H2DCFDA的ROS检测试剂盒(Abcam公司)进行如下实验，以确认神经干细胞培养液对细胞内活性氧(reactive oxygen species；ROS)的生成所起的影响。
DCFH-DA容易穿透细胞膜并扩散到细胞内，通过细胞内的酯酶被水解成失去荧光的DCFH，然后在存在ROS的环境下迅速氧化成呈现高荧光的DCF。因此，DCF的荧光强度与细胞内ROS的量成正比。
将人真皮成纤维细胞(HS68)以每孔2.5Х104cells的量分株于24孔微孔板中，并在含有10％的FBS的培养基及37℃、5％CO2条件的培养箱中进行24小时的培养。之后，将无处理组作为阴性对照组，添加250μM的抗坏血酸(Vitamin C)作为阳性对照组、添加过氧化氢作为比较对照组、以及添加神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)作为实验组，并进行24小时的培养。接着，同时添加25μM的DCFDA，在37℃下进行45分钟的反应后，用50μM的TBHP(Tert-Butyl Hydrogen Peroxide Solution，叔丁基过氧化氢溶液)进行处理，在37℃下进行1分钟至5分钟的反应。用1x磷酸盐缓冲盐水进行1次的洗涤后，分别加入100μl的各个孔的1x磷酸盐缓冲盐水，然后利用荧光微孔板读数仪在激发波长(excitation)485nm、及发射波长(emission)528nm下测定荧光值。其结果如图13所示。
其结果确认到，与通过过氧化氢增加来ROS水平的氧化损伤诱导组相比，在添加神经干细胞培养液的情况下，ROS水平显着较低。这意味着通过预先添加神经干细胞培养液，即使因人真皮成纤维细胞内抗氧化***活性的增加而暴露于相同浓度的过氧化氢，也能够维持较低水平的ROS。
实验实施例9.2.总抗氧化效果的测定
在实验实施例9.1中，确认了在添加有神经干细胞培养液的人真皮成纤维细胞(HS68)中，由过氧化物引起的细胞凋亡减少，细胞内ROS水平也有降低。因此，针对阴性对照组(N.C)、作为比较对照组的脂肪干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)及作为实验组的神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)，根据Trolox当量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity)方法测定TAC，以确认神经干细胞培养液的总抗氧化能力(Total antioxidant status)。
抗氧化剂有三种类型：酶***(GSH还原酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等)、小分子(抗坏血酸、尿酸、GSH、维生素E等)和蛋白质(白蛋白、转铁蛋白等)。Trolox用于对抗氧化剂进行标准化，所有其他抗氧化剂均以Trolox等效物进行测定。利用能够测定小分子抗氧化剂与蛋白质或小分子的组合的总氧化能力分析试剂盒(Total Antioxidant CapacityAssay Kit)来进行测定，小分子及蛋白质两者将Cu2+离子过转换为Cu+。蛋白质掩膜(Protein Mask)可防止由蛋白质而引起的Cu2+的减少，从而仅分析小分子抗氧化剂。还原的Cu+离子因比色探针(probe)而被螯合化，与总抗氧化剂容量成比例地在约570nm处出现宽吸收峰。在酸性pH值下，无色的还原型2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazo-thiazoline-6-sulfonate)；ABTS)被过氧化氢氧化成青绿色的ABTS。如果样品内存在抗氧化物质，则ABTS会与这些浓度成比例地被脱色，通过570nm处的吸光度测定这种颜色变化反应的结果。使用Trolox作为标准试剂来制作标准曲线，以测定样品物质的TAC。Trolox作为广泛用于测定总抗氧化能力的代表性标准试剂，用mM Trolox当量(mM Trolox equivalent)表示TAC活性。
将Cu2+试剂及样品和蛋白质掩膜进行混合并向96孔板中添加至200μl，在黑暗条件下，在定轨振荡器中进行90分钟的反应，然后用570nm处的吸光度进行测定。其结果如图14所示。
其结果确认到，与阴性对照组及脂肪干细胞培养液相比，在处理神经干细胞培养液的情况下，ABTS自由基的清除活性以浓度依赖性方式增加。
由此可知，神经干细胞培养液具有抗氧化的效果。
实验实施例10.确认神经干细胞培养液的皮肤保湿及增强屏障的效果
将人表皮细胞(HaCaT)以每孔1.0Х106cells/孔的量分株于6孔板中，并进行培养，然后替换为不含血清的培养基。经过24小时后，将阴性对照组(N.C)、用视黄酸(Retinoic acid，R.A，sigma-aldrich公司，R2625，1uM)作为阳性对照组、用神经干细胞培养液(浓度为10％、25％、50％、100％)作为实验组进行处理。
在24小时后，从细胞中分离RNA以合成cDNA，按照实验实施例1.2.2.中记载的方法执行qRT-PCR，以确认兜甲蛋白(Loricrin)、内披蛋白(Involucrin)、透明质酸合成酶-2(Hyaluronic acid synthase，HAS-2)和HAS-3的表达量。此时，合成的cDNA是利用如下表4所示的各个特异性引物组执行的。
【表4】
Figure BDA0002548584630000171
/>
Figure BDA0002548584630000181
图15a是表示兜甲蛋白、内披蛋白、HAS-2及HAS-3是否表达的电泳照片，图15b是表示兜甲蛋白、内披蛋白、HAS-2及HAS-3的表达量的图表。
其结果确认到，与阴性对照组处理的情况相比，在用神经干细胞培养液进行处理的情况下，兜甲蛋白、内披蛋白、HAS-2及HAS-3的表达量较高。
由此可知，神经干细胞培养液具有皮肤保湿及增强皮肤屏障的效果。
实验实施例11.神经干细胞培养液的分泌蛋白质组(secretome)分析
使用RayBio公司的人细胞因子/生长因子抗体(Human Cyokine/Growth FactorAntibody；RayBiotech公司，Noncross，美国佐治亚州)来确认在不含血清状态下的神经干细胞培养液成分。
将阵列膜(Array membrane)在封闭缓冲液中在室温下孵育30分钟后，用2ml的神经干细胞培养液处理1小时。对膜进行5次的洗涤后，将生物素缀合(biotin-conjugated)抗体在室温下进行1小时至2小时的处理，添加2ml的作为底物的HRP-链霉亲和素偶联物。经过2小时后，用检测缓冲液(detection buffer)处理2分钟，使用iBright(CL1000成像***，赛默飞世尔科技公司)来确认神经干细胞培养液的成分。此外，以图表方式表示神经干细胞培养液的分泌蛋白质组分析的信号强度。其结果如表4、图16和图17所示。
【表5】
Figure BDA0002548584630000182
/>
Figure BDA0002548584630000191
其结果确认到，神经干细胞培养液较多包含多种生长因子、细胞因子等。
具体地，可知其特别地包含与皮肤再生及抗老化有关的蛋白质，即包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、腱蛋白样蛋白1(Chordin-like 1)、Csk、EDA-A2、EGF、bFGF、GDF3、GDF5、GDF15、GLO-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-7、潜在型TGF-β结合蛋白1、MFG-E8、MMP-20、PDGF-AA、PECAM-1、Smad1、Smad4、音猬因子(Shh N端)、TGF-β5、血小板反应蛋白1、Tie-2、VEGF及VEGF-C。此外，其特别地包含参与促进胶原蛋白合成及改善皱纹的蛋白质，即包含MCP-1、TIMP-1、bFGF、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、Smad1、Smad4、TGF-β5、血小板反应蛋白1。此外，其包含已知与美白作用有关的蛋白质TGF-β5，并包含与抗氧化效果有关的蛋白质GLO-1。此外，可知其包含抗炎效果及预防自身免疫疾病所需的蛋白质，即包含Axl、GRO、血小板反应蛋白1，TGF-β5。
<110> 株式会社韩诗珐玛
<120> 包含作为有效成分的神经干细胞培养液的用于改善皮肤的组合物
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Claims (14)

1.一种用于改善皮肤的化妆品组合物，其包含作为有效成分的神经干细胞培养液，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1 F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1（Smad1）、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C；并且所述改善皮肤为缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，所述神经干细胞来源于10周至14周的死产胎儿脑组织。
3.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，所述神经干细胞为L-MYC基因所转导的细胞。
4.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，其用于促进皮肤细胞的胶原蛋白合成。
5.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，其用于抑制皮肤细胞的弹性蛋白酶活性。
6.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，其用于抑制皮肤细胞的黑色素合成。
7. 根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于， 其用于抑制皮肤细胞的酪氨酸酶活性。
8. 根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于， 其用于抑制皮肤细胞的活性氧的生成。
9.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，其用于促进角质细胞的分化及透明质酸的合成。
10. 一种用于改善皮肤的医药外品组合物，其包含作为有效成分的神经干细胞培养液，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1 F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C；并且所述改善皮肤为缓解伤口、改善皱纹、皮肤再生、增加皮肤弹性、皮肤美白、抗炎、抗氧化、皮肤保湿、或增强皮肤屏障。
11. 一种用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、治疗或预防异位性皮肤炎或自身免疫疾病的药物组合物，其包含作为有效成分的神经干细胞培养液，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1 F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C。
12. 一种神经干细胞培养液在制备用于改善皮肤的化妆品中的用途，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1 F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C。
13. 一种神经干细胞培养液在制备用于改善皮肤的医药外品中的用途，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1 F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C。
14. 一种神经干细胞培养液在制备用于治疗皮肤伤口、皮肤再生、皮肤抗炎、治疗或预防异位性皮肤炎或自身免疫疾病的药物中的用途，所述神经干细胞培养液包含激活素RIA/ALK-2、脂联素1、Axl、BIK、腱蛋白样蛋白1、Csk、EDA-A2、表皮生长因子、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子、半乳凝素3、生长分化因子-3、GDF5、GDF-15、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、GRO、GLO-1、细胞间粘附分子2、***结合蛋白2、IGFBP-3、IGFBP-7、IL-1 F6、IL-1F8、IL-7、IL-15 R Alpha、IL-20 R beta、胰岛素、潜在型TGF-β结合蛋白1、单核细胞趋化蛋白1、MFG-E8、MMP-20、NRG1 Isoform GGF2、PDGF-AA、血小板内皮细胞粘附分子1、S100A10、sFRP-4、sgp130、母亲DPP同源物1、Smad4、音猬因子N-端、组织因子途径抑制物1、TGF-β5、血小板反应蛋白1、酪氨酸激酶受体2、金属蛋白酶组织抑制剂1、血管内皮生长因子及VEGF-C。
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