CN112094900A

CN112094900A - 用于单基因隐性遗传病检测的探针组，试剂盒，筛查方法及其应用

Info

Publication number: CN112094900A
Application number: CN202011044906.5A
Authority: CN
Inventors: 张蕾
Original assignee: Fuzhou Institute Of Data Technology Co ltd
Current assignee: Fuzhou Institute Of Data Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明涉及分子诊断领域，具体涉及一种用于单基因隐性遗传病检测的探针组，试剂盒，筛查方法及其应用，用于出生缺陷的一级防控。本发明针对194种严重致残致死单基因隐性遗传病的164个基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，设计了3343个探针捕获区域，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现194种单基因隐性遗传病的孕前携带者筛查，从而准确预测可能生育足以影响生育决定的严重单基因隐性遗传病患儿的风险，具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。

Description

用于单基因隐性遗传病检测的探针组，试剂盒，筛查方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，具体涉及一种用于单基因隐性遗传病检测的探针组，试剂盒，筛查方法及其应用。

背景技术

单基因隐性遗传病是儿童出生缺陷的重要病因，给患儿和家庭带来极大地痛苦和负担，单基因遗传病虽然发病率低，但由于病种多，综合发病率并不低，超过1/100。根据近期研究数据表明，人群中～85％的个体可能是严重遗传疾病的携带者，个体可携带隐性遗传致病基因2～5个，因此人类有较高的“遗传负荷”，虽然携带者本身不会发病，但很可能把不正常的基因传给下一代。如果恰好伴侣也携带同样的致病基因，他们的后代将有1/4的概率患此疾病，而普通的孕前检查却无法预测这种患病风险。

近年来多项国内外研究表明，备孕夫妻在孕前进行高携带率隐性遗传病的基因筛查是阻止出生缺陷发生的重要的一级预防措施。相关研究(KabackM,Lim-Steele J,Dabholkar D,Brown D,Levy N,Zeiger K.Tay-Sachs disease—carrier screening,prenatal diagnosis,and the molecular era.An international perspective,1970to1993.The International TSD Data Collection Network.JAMA.1993Nov 17；270(19):2307-15)表明，国际上早期面向消费者市场的筛查隐性遗传病携带者的基因检测在技术主要有多聚酶链式反应(PCR)，多型性芯片杂交，以及对大片段缺失和复制的荧光检测。然而，这些方法每次只能鉴定一种或者几种基因突变，适用于有针对性的检查，而且其成本高、适用疾病少、普及面窄、通量低。高通量测序可以同时检测成百上千种疾病，并能以很高的准确度完成。扩展性携带者筛查(Expanded Carrier Screening，ECS)也由此得以产生和发展。

因此，亟需开发一种能够同时检测/筛查多种严重致残致死单基因隐性遗传病的基因检测探针组，与其相配套的试剂盒，以及具体的筛查方法和应用。

发明内容

为此，需要提供一种针对194种严重致残致死单基因隐性遗传病的基因检测探针组，试剂盒，具体的筛查方法和应用，以解决现有技术中检测成本高、适用疾病少、普及面窄、通量低的问题。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于单基因隐性遗传病检测的探针组，所述探针组依据164个基因共3343个捕获区域设计获得，所述的捕获区域如表1所示。

本发明的第二方面提供了一种用于单基因隐性遗传病检测的试剂盒，其含有本发明第一方面所述的探针组。

本发明的第三方面提供了一种单基因隐性遗传病的筛查方法，其包括：采用本发明第一方面所述的探针组进行检测。

作为一种可选的实施方式，所述基因筛查方法具体包括以下步骤：

(1)样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组DNA；

(2)DNA片段化：将所述基因组DNA超声打断或者酶切至100～500bp的DNA片段；

(3)末端修复/dA尾添加与接头连接：对所述DNA片段进行末端修复/dA尾添加与接头连接得到产物，对所述产物进行纯化；

(4)杂交前扩增：将步骤(3)中的纯化产物进行PCR扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；

(5)第一次探针捕获：将所述DNA文库进行杂交前封闭，采用所述探针组进行杂交捕获；

(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物进行洗脱，获得捕获的靶序列，将所述捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列；

(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第二次探针捕获的DNA文库，重复步骤(5)和步骤(6)，对第二次目标区域富集获得富集的靶序列进行纯化，获得待测序产物；以及

(8)测序及分析：将所述待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果。

作为一种可选的实施方式，在步骤(1)中，所述待测样品为血斑、血液或口腔黏膜细胞。

作为一种可选的实施方式，在步骤(3)中，在步骤(3)中，所述接头为Y型接头，所述Y型接头包括第一序列和第二序列，所述第一序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二序列如SEQID NO.2所示。

作为一种可选的实施方式，在步骤(4)中，所述纯化为磁珠纯化；所述PCR扩增富集的体系为：纯化产物14.5μL；2×高保真热启动预混液17.5μL；和标签引物混合液3μL；

所述标签引物的正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示；

所述PCR扩增富集的反应条件为：98℃预变性45s；98℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环12次；72℃最终延伸1min；4℃保温。

作为一种可选的实施方式，在步骤(6)中，所述PCR扩增的体系为：捕获的靶序列20μL；2×高保真热启动预混液25μL；和文库扩增引物-TS混合液5μL；

所述PCR扩增富集的反应条件为：98℃预变性45s；98℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环8次；72℃最终延伸1min；4℃保温。

作为一种可选的实施方式，在步骤(3)中，所述末端修复/dA尾添加与接头连接采用Illumina公司的KAPAHyper Plus Kit。

作为一种可选的实施方式，在步骤(6)中，所述洗脱采用

Hybridization andWash Kit。

作为一种可选的实施方式，在步骤(8)中，所述二代测序采用Illumina二代测序平台NovaSeq6000进行；

所述二代测序中，所用引物的正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明的第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的试剂盒在单基因隐性遗传病检测中的应用。

区别于现有技术，上述技术方案提供了一种针对194种严重致残致死单基因隐性遗传病的164个基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，设计了3343个探针捕获区域(如表1所示)。基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现194种单基因隐性遗传病的孕前携带者筛查，可帮助备孕夫妻提前了解双方严重单基因隐性遗传病致病基因的携带情况，从而准确预测可能生育足以影响生育决定的严重单基因隐性遗传病患儿的风险，以便提前试管婴儿或产前诊断等有效措施进行干预。本发明提供的探针组在用于194种严重致残致死单基因隐性遗传病的基因筛查中具有准确率高，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。

通过比较我国现有的几家公司开展的扩展性携带者筛查项目，可以发现各个检测产品检测的疾病和基因差异大，有些机构甚至将发病率过低、迟发性疾病、低外显率疾病、表型中等或较轻的疾病包括在内。因此，扩展性携带者筛查检测基因包的设计非常关键，既要考虑检测成本又要兼顾筛查覆盖率和检出率：1)需要排除发病率过低的疾病，即从大规模人群频率数据入手，选择携带率>1/500；2)选择早发且严重致残致死致愚、足以影响生育决定的严重单基因病，结合ACOG委员会意见(NO.690[4]和NO.691[5])进行选择。

以上述基因包的外显子区和重要调控区为筛查目标，若能够设计并合成一系列杂交探针组，采用基于探针捕获的高通量测序法进行筛查，可有效实现一次性完成数百种严重致残致死的单基因隐性遗传病的孕前筛查。

为此，发明人结合靶序列液相杂交捕获技术和高通量测序技术，设计了一组针对194种严重致残致死单基因隐性遗传病的基因检测探针组，并为备孕夫妻提供了提前了解双方携带严重单基因隐性遗传病致病基因的筛查方法。

需要说明的是，在本发明的实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在本发明的实施例中，术语“探针”为一小段DNA片段，用于捕获与其互补的目标序列。

在本发明的实施例中，基于本发明所提供的严重致残致死单基因隐性遗传病相关致病基因的探针捕获区域可根据常规方法合成相应的探针，探针的合成只需将捕获区域的信息提供给专业的探针设计合成公司即可完成，例如艾吉泰康公司https://design.igenetech.com/。

实施例1 194种严重致残致死单基因隐性遗传病的基因检测探针组

发明人经过查阅大量单基因隐性遗传病致病基因相关文献及数据库，获得了194种携带率高、严重致残致死的单基因隐性遗传病及其相关基因(详见表2)，通过高通量的实验筛选及相关实验验证，最终设计出3343个探针捕获区域(捕获区域如表1所示)，针对探针捕获区域的探针联合使用可用于检测194种严重致残致死单基因隐性遗传病的致病基因。针对所设计的探针捕获区域的探针特异性强、灵敏度高，对194种严重致残致死单基因隐性遗传病缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。

表1 194种单基因隐性遗传病对应的164个致病基因的捕获区域

表2 194种单基因隐性遗传病及其对应的164个致病基因

实施例2 194种严重致残致死单基因隐性遗传病捕获和测序方法

本实施例利用受检者少量(2mL)外周血提取DNA，通过高通量目标基因测序结合生物信息学分析手段从受检者海量遗传信息中筛选出其携带单基因隐性遗传病致病基因的情况，具体步骤如下：

(1)样品采集与提取：以7例经临床确诊为单基因遗传病患儿(分别是GJB2相关非综合征型耳聋、Bardet-Biedl综合征12型、脊髓性肌萎缩、杆状肌病、肢带型肌营养不良症2B型、视网膜色素变性、Usher综合征)的父母血液样本为例，分别进行基因组DNA提取。其中，基因组DNA提取可以采用市面上已有的DNA提取试剂盒进行提取；使用的试剂盒为QIAamp DNABloodMini Kit。

(2)DNA片段化：将基因组DNA超声打断至100～500bp的DNA片段。

(3)末端修复与接头连接：使用Illumina公司的KAPAHyper Plus Kit对DNA片段进行末端修复及测序接头连接；产物用DNA纯化磁珠VAHTS DNAClean Beads进行纯化。

其中，接头为Y型接头，包括：第一序列(如SEQ ID NO.1所示)，包括依次相连的N1序列、N2序列和N3；以及第二序列(如SEQ ID NO.2所示)，包括依次相连的S1序列和S2序列。其中，N2序列和S2序列互补。N1序列：ACACTCTTTCCCTACACGAC；N2序列GACGCTCTTCCG；N3序列：ATCT；S1序列：CACTGACCTCAAGTCTGCACA；S2序列：CGAGAAGGCTAG。

该Y型接头的结构如下所示：

5’-ACACTCTTTCCCTACAC-

-GACGCTCTTCCGATCT-3’

-CGAGAAGGCTAG-5’

3’-CACTGACCTCAAGTCTGCACA-

(4)杂交前扩增：将步骤(3)中的纯化产物进行PCR扩增富集，PCR扩增富集的体系为：

反应条件为：

PCR扩增产物用DNA纯化磁珠VAHTS DNAClean Beads进行纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库。

其中，标签引物的正向序列为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[Index1]ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(如SEQID NO.3所示)；

反向序列为：3’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Index2]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-5’(如SEQ ID NO.4所示)。

Index1、Index2为标签引物，通常由6或8个特异性的碱基序列，用来识别不同样本，例如可以为：TGCAGCTA、TGCTTGAC、TGGCGAAT、TGATCCGT、TTCACAGC、TCAATGGA、AGGATATC、GGACTCAA、ACCACGTT、ATCTGCAT。

(5)第一次探针捕获：使用

Hybridization andWashKit，按说明书操作，将DNA文库进行杂交前封闭，获得已封闭的DNA文库；再将实施例1针对探针捕获区域的探针组配制成探针混合液；与已封闭的DNA文库进行4-16小时的杂交捕获；杂交捕获的条件如下：

(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物使用

Hybridization andWashKit进行洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列，PCR扩增体系为：

反应条件为：

(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第二次探针捕获的DNA文库，重复步骤(5)和步骤(6)以再进行一次探针捕获及目标区域富集，第二次富集的靶序列用DNA纯化磁珠VAHTS DNAClean Beads进行纯化，获得待测序产物。

(8)将待测序产物用Illumina二代测序平台NovaSeq6000测序，采用生物信息学分析测序结果。

其中，二代测序中所用引物的正向序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGAC-3’(如SEQID NO.5所示)；

反向序列为：3’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-5’(如SEQ ID NO.6所示)。

本实施例中，基因组DNA提取浓度和DNA文库浓度的Qubit定量结果，详见表3。

表3基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度

本实施例中，捕获后文库的Qubit定量结果如表4所示。

表4捕获后文库的Qubit定量浓度

本实施例中，7位遗传病患儿父母血液样本的筛查结果，如表5所示。

表5 7位遗传病患儿父母的单基因隐性遗传病致病基因的筛查结果

备注：变异分类：P(Pathogenic，致病的)、LP(Likelypathogenic，疑似致病的)。

从以上结果可以看出，7位患儿的父母均是所生患儿遗传病的致病基因携带者，并且平均每人携带2-3个致病变异。如果这些患儿父母在孕前通过本发明提供的探针组进行筛查检测，即可知晓双方高风险基因的携带情况，***生育遗传病患儿的风险，通过进一步的遗传咨询、辅助生育或产前诊断，提前采取措施进行干预，以有效防止出生缺陷的发生。

综上，根据本发明的探针捕获区域(如表1所示)设计相应的探针，即可实现194种严重致残致死遗传病的孕前携带者筛查。并且，本发明具有覆盖基因数目多，可准确预测可能生育足以影响生育决定的严重单基因隐性遗传病患儿的风险，具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围，其中未尽详细描述的技术参数和原料组分在本发明列举的参数范围内变化时，仍能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍属与本发明的保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 福州数据技术研究院有限公司

<120> 用于单基因隐性遗传病检测的探针组，试剂盒，筛查方法及其应用

<130> P14912

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

cactgacctc aagtctgcac acgagaaggc tag 33

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> unsure

<222> (30)..(37)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnnaca ctctttccct acacgac 57

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> unsure

<222> (25)..(32)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgt 53

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

acactctttc cctacacgac 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agat 24