CN112079912B - 一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用。其制备方法包括将CaIFN‑α进行氨基酸位点突变成犬α干扰素突变体CaIFN‑α‑Mut，CaIFN‑α、CaIFN‑α‑Mut以及蛋白标签合成之前分别进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至表达载体得到重组质粒，之后经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到目的蛋白即犬α干扰素重组蛋白。解决了现有犬α干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题，在大规模生产中能够极大降低生产成本。

Description

一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
犬α干扰素(CaIFN-α)是一种具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性的蛋白，抗病毒活性为犬α干扰素的主要生物学活性，广泛用于犬病毒性疾病的防治，包括：犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬腺病毒、犬副流感、犬冠状病毒感染、犬疱疹病毒感染、犬病毒性角膜炎及其他病毒性疾病。其作用机制为犬α干扰素通过一系列的信号传导刺激机体产生ISG(干扰素刺激基因)产物，ISG类产物包括多种抗病毒蛋白，能够有效抑制病毒的复制。同时还可通过提高机体的免疫效应和调整病毒转录过程等有效方式来实现其抗病毒作用。天然干扰素包括CaIFN-α具有半衰期短的特性，为4h左右，而现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。
现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。犬α干扰素的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达***中的表达，在大肠杆菌表达***缺少将蛋白质有效的释放分泌机制，面临产量小、表达形式为包涵体的问题，存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺；同时大肠杆菌表达***无法有效形成二硫键，不利于犬α干扰素的正确折叠，影响其天然构象及稳定性，进而影响其生物学活性；利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况，在相应表达***中由于蛋白的翻译折叠等过程中还普遍存在表达的犬α干扰素生物活性低的现象。
在长效性修饰的研究中，血清白蛋白修饰、蓖麻毒素B链、GST等技术均有利用来融合犬α干扰素，融合表达时易出现断裂、酶降解及影响犬α干扰素活性等问题，在不同表达***中融合蛋白的选择是一个技术性难题。
在犬病毒病预防方面，国内运用较多的是疫苗和抗体，但是由于母源抗体的干扰及毒株的抗原漂移，有时会导致免疫失败，因此研制安全高效的干扰素抗病毒制剂具有重大意义。犬α干扰素具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性。但其自身的半衰期短及现有技术限制了犬α干扰素的临床应用。如何提高其自身的生物学活性、延长半衰期、探索一条高效的表达***对犬α干扰素的临床应用具有广阔的前景。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用，形成一种生物学活性高、半衰期延长、稳定性好、不易降解的犬α干扰素突变体。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种高活性的犬α干扰素重组蛋白，所述犬α干扰素重组蛋白的融合片段包括采用犬α干扰素或者犬α干扰素突变体，所述犬α干扰素重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～4所示；
所述犬α干扰素突变体为CaIFN-α(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示)进行氨基酸位点突变形成的CaIFN-α-Mut；所述犬α干扰素突变体为CaIFN-α进行氨基酸位点突变形成的CaIFN-α-Mut，所述突变的氨基酸包括犬α干扰素的第150～164位点的1个或2个氨基酸，所述通过对犬α干扰素的氨基酸位点的突变可以增强生物学活性，所述突变位点为通过分析犬α干扰素的氨基酸选择得到；
所述突变的氨基酸包括犬α干扰素第160个氨基酸突变为缬氨酸，所得突变体CaIFN-α-Mut1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；或者突变为亮氨酸，所得突变体CaIFN-α-Mut2的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示
所述突变的氨基酸包括犬α干扰素第163、164个氨基酸分别突变为赖氨酸和谷氨酸，所得突变体CaIFN-α-Mut3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；
所述犬α干扰素重组蛋白还包括His-Tag片段，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.9所示，优选His-Tag蛋白标签，便于目的蛋白的纯化；
所述CaIFN-α、CaIFN-α-Mut1、CaIFN-α-Mut2、CaIFN-α-Mut3以及His-Tag融合之前先进行密码子优化，优化之后的碱基序列分别如SEQ ID NO.10～14所示；
本发明还提供了一种高活性的犬α干扰素重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将CaIFN-α进行氨基酸位点突变成犬α干扰素突变体CaIFN-α-Mut，CaIFN-α、CaIFN-α-Mut以及蛋白标签合成之前分别进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至酵母表达载体得到重组质粒，之后经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到得到目的蛋白即犬α干扰素重组蛋白。
所述酵母表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P；
所述表达宿主菌包括毕赤酵母宿主菌或酿酒酵母菌，所述毕赤酵母宿主菌包括X33、GS115、KM71以及SMD1168，有利于二硫键的形成；
所述诱导表达包括采用甲醇诱导技术，选择了高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达***，利用甲醇诱导技术，高效地诱导蛋白表达，有效地提高目的蛋白的表达量至克级别，在大规模生产中能够极大地降低生产成本，同时该表达***利于犬α干扰素自身二硫键的的形成；
酵母自身适度的糖基化修饰的CaIFN-α及其突变体，提高了生物学活性及延长了半衰期。酵母自身糖基化修饰后的突变体半衰期提高了2.5倍。
本发明还提供了一种高活性的犬α干扰素重组蛋白用于制备抗病毒药物。
本发明的有益效果如下：
本发明的高活性的犬α干扰素重组蛋白相比纯犬α干扰素具有稳定性高、生物学活性高、半衰期延长的优势，解决了现有表达***及相关生物技术制备的犬α干扰素含量低、生物学活性低、半衰期短、稳定性差、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题，在大规模生产中能够极大降低犬α干扰素的生产成本，可有效实现犬α干扰素用于抗病毒药物中；
本发明的重组蛋白的制备工艺中，选择了高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达***，对犬α干扰素的氨基酸位点的突变，获得更高生物学活性的CaIFN-α-Mut，同时提高其稳定性及延长半衰期，使得犬α干扰素的外源表达具有表达含量高、糖基化适度、二硫键易于形成、表达产物生物学活性好、背景蛋白质少、操作简便及易于工业化生产等优势。
附图说明
图1为目的蛋白的构建示意图；
图2为菌液的PCR鉴定结果；
图3为重组酵母菌液的PCR鉴定结果；
图4为诱导上清的去糖基化处理对比图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
一种高活性的犬α干扰素重组蛋白的制备以及相关检测：
1.将CaIFN-α进行氨基酸位点突变成犬α干扰素突变体CaIFN-α-Mut，CaIFN-α、CaIFN-α-Mut以及蛋白标签His-Tag合成之前分别进行毕赤酵母密码子优化，之后合成于pUC57质粒载体上，目的基因的C端引入His-Tag及终止密码子TAA，经EcoRI、XbaI双酶切后克隆至表达载体得到重组质粒；
所述表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P，本实施例选择构建于pPICZαA上，并进行T4连接酶连接及转化感受态DH5α，得到的重组质粒的构建示意图如图1所示；
将得到的重组质粒CaIFN-α-pPICZαA、CaIFN-α-Mut1-pPICZαA、CaIFN-α-Mut2-pPICZαA、CaIFN-α-Mut3-pPICZαA进行阳性转化鉴定，鉴定引物分别α-factor和3’Aox1，由广州金唯智生物科技有限公司合成，采用的PCR鉴定体系如表1所示，鉴定程序如表2所示：
表1 PCR鉴定体系
Figure BDA0002701880760000061
Figure BDA0002701880760000071
表2 PCR鉴定程序
程序 温度 时间 循环数
预变性 94℃ 4min /
变性 94℃ 30s 30
退火 55℃ 30s
延伸 72℃ 30s
再延伸 72℃ 4min /
保存 16℃ / /
PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，挑取PCR鉴定为阳性菌进行质粒抽提并测序鉴定，结果如图2所示，由图可见，各组CaIFN-α-pPICZαA、CaIFN-α-Mut1-pPICZαA、CaIFN-α-Mut2-pPICZαA、CaIFN-α-Mut3-pPICZαA均为阳性，且质粒测序结果显示各组测序正确，如SEQ ID NO.1～4所示。
2.重组质粒经酶切线性化
参考TAKARA公司酶切试验手册，用Sac I单酶切各重组质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检测线性化完全，对线性化产物进行纯化回收，纯化回收方法参考试剂盒使用说明书。
3.将线性化产物导入表达宿主菌
3.1毕赤酵母感受态细胞的制备
1)接种酵母受体菌(包括X33、GS115、KM71以及SMD1168，本实施例采用KM71)单菌落于YPD平板，30℃培养2天；
2)挑取平板上的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3)过夜培养后按1％左右的接种量接种到100mLYPD培养基中震荡培养至OD值1.2～1.5；
4)4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
5)4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
6)再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100mL预冷无菌水重悬菌体；
7)20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次；
8)将菌体溶于1mL，1M预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化。
3.2线性化产物电转化毕赤酵母感受态细胞
1)准备好80μL的KM71酵母感受态(本实施例采用KM71，其它宿主菌的使用方式相同)与线性化的质粒1～5μg(冰上预冷15min)混合，迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌)，电击；
电转参数为Voltage：1500V；Capacitance：25μF；Resistance：200Ω；Cuvette(mm)：2mm；
2)电击结束，迅速加入1mL山梨醇(1M)，冰上静置15min，随后30℃温箱中静置培养1h，再加入1mLYPD液体培养基，30℃，200r/min振荡培养1小时，常温4000r/min离心收集菌体，涂至含有100μg/μL的YPDS平板中30℃静置培养3d，得到重组酵母菌。
3.3重组酵母菌的鉴定及高拷贝的筛选
用灭菌枪头细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，接种于2mL的YPD液体培养基中(含150μg/mLZeocin)，30℃，200r/min振荡培养过夜；
采用菌液PCR分析P.pastoris转化子，PCR鉴定体系同表1，PCR鉴定程序如表3所示：
表3重组酵母菌液PCR鉴定程序
Figure BDA0002701880760000091
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定引物能扩增出目的条带的克隆定为阳性转化子，PCR鉴定结果如图3所示，由图可见，各组均有阳性重组酵母菌株，表明线性化产物电转化导入宿主菌KM71成功。
高拷贝的筛选需结合PCR鉴定中的条带亮度及高抗性YPD平板(200μg/mLZeocin)试验结果。
4.高拷贝重组酵母菌诱导表达
1)用灭菌枪头细挑YPD平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于30mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，30℃，200r/min振荡过夜，至OD600＝2～6，此时细胞处于对数生长期；
2)3000r/min室温离心5min收集沉淀，重悬于15mL的BMMY中，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在250mL的三角锥瓶中振荡培养；
3)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％，进行诱导培养；
4)培养至96h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE或置于-80℃保存。
5.重组酵母菌诱导表达上清的SDS-PAGE
重组酵母菌诱导表达4d的上清进行去糖基化处理，去糖基化试剂终浓度为1％，37℃孵育3h，设置相应的KM71及空质粒pPICZαA-KM71对照组，同时设置未去糖基化试剂组，观察该表达***对目的蛋白糖基化修饰的情况，蛋白上样缓冲液为5×Loading Buffer，上样量为12μL；
如图4所示，CaIFN-α及相应的突变体CaIFN-α-Mut1、CaIFN-α-Mut2、CaIFN-α-Mut3均在酵母表达***中高效表达，条带大小为20kDa，与预期一致。去糖基化处理组及未去糖基化处理组比较可知，未去糖基化处理组蛋白略大于去糖基化处理组，表明该酵母表达***对CaIFN-α、CaIFN-α-Mut1、CaIFN-α-Mut2、CaIFN-α-Mut3进行了适度的糖基化修饰。
6.表达产物的纯化回收
为研究毕赤酵母糖基化修饰对犬α干扰素活性的影响，设置去糖基化处理组及未去糖基化处理组，对两组表达上清的纯化结合His Tag进行镍柱亲和层析方法进行蛋白的吸附、洗脱纯化，利用透析法进行咪唑的去除后测定浓度，各组样品纯化后浓度见下表4。
表4各组样品纯化后的浓度
Figure BDA0002701880760000111
7.目的蛋白生物学活性检测
采用MDCK-VSV微量病变抑制法检测目的蛋白的活性，将消化后的MDCK细胞铺96孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后每孔加入100μL4倍倍比稀释的纯化后的犬α干扰素(去糖基化处理组和未去糖基化处理组)，37℃孵育24h后每孔用100TCID50VSV攻毒，同时设置正常细胞对照组和只加病毒的病毒对照组；
48h后察细胞病变的抑制结果，以抑制50％细胞病变CPE50的最高干扰素稀释度为1个活性单位。48h后观察细胞病变的抑制结果，以抑制50％细胞病变CPE50的最高干扰素稀释度为1个活性单位，结果如表5所示。结果如表5所示。
表5各组目的蛋白的活性
Figure BDA0002701880760000112
结果表明：去糖基化处理组及未去糖基化处理组中CaIFN-α-His、CaIFN-α-Mut1-His、CaIFN-α-Mut2-His、CaIFN-α-Mut3-His均有较高的活性，未去糖基化处理组的活性高于去糖基化处理组，表明适度的糖基化能够有效提高犬α干扰素的活性；
CaIFN-α与突变体的活性比较可知，各组活性CaIFN-α-Mut2-His＞CaIFN-α-Mut3-His＞CaIFN-α-Mut1-His＞CaIFN-α-His，尤其是CaIFN-α-Mut2的活性远高于天然CaIFN-α，表明适当的氨基酸位点的突变有利于犬α干扰素活性的提升。
8.犬α干扰素重组蛋白半衰期的测定
选择各组的CaIFN-α-His、CaIFN-α-Mut1-His、CaIFN-α-Mut2-His、CaIFN-α-Mut3-HisCaIFN-α-Mut2-His的去糖基化处理组和未去糖基化处理组来进行犬α干扰素半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定犬α干扰素的血药浓度与时间的关系；
取体重接近10kg的成年比格犬(6只/组)，雌雄各半，按1mg/mL/只剂量颈部皮下注射冻干的各组样品，分别在注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血，血样4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清；
采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中犬α干扰素的浓度，利用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数，结果如下表所示：
表6半衰期的测定
Figure BDA0002701880760000121
Figure BDA0002701880760000131
经测定各组的去糖基化处理组的半衰期为4.2h，与文献报道的天然CaIFN-α-His的半衰期4h相当，未去糖基化处理组半衰期为10.2h-10.6h，较去糖基化处理组提高了2.5倍左右。
利用酵母表达***中对犬α干扰素糖基化修饰能够显著延长半衰期，简化了犬α干扰素的长效性修饰工艺，具有广阔的的应用前景。
序列表
<110> 广州源博医药科技有限公司
<120> 一种高活性的犬α干扰素重组蛋白及其制备方法和应用
<130> /
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
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130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys His His His His His His
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<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Val
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys His His His His His His
165 170
<210> 3
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys His His His His His His
165 170
<210> 4
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Lys Glu His His His His His His
165 170
<210> 5
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys
<210> 6
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
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Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Val
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys
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<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Leu
145 150 155 160
Arg Arg Arg Lys
<210> 8
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn Trp Arg Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His Tyr
20 25 30
Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu
35 40 45
Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val
50 55 60
Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala
130 135 140
Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile
145 150 155 160
Arg Arg Lys Glu
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
His His His His His His
1 5
<210> 10
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgtcatttgc cagataccca tggtttacga aactggaggg tgttaacttt gcttggtcaa 60
atgagacgtc tgtcagctgg ttcttgtgat cattacacta atgactttgc tttccccaaa 120
gaactgtttg acggacagcg tttgcaagaa gctcaagctt tatctgtggt ccacgttatg 180
acacaaaagg tattccattt attttgtcct gatacctcaa gtgctccatg gaacatgacc 240
ctattagaag agctatgtag tggtttgtct gaacagctgg atgacctgga ggcatgtccc 300
ttgcaagaag ccggtttggc tgagaccccc ttgatgcacg aggattctac tttgagaact 360
tacttccaac gtatttcatt atatttgcag gatagaaacc actccccttg cgcttgggaa 420
atggttagag ccgaaattgg aagaagtttc tttagttcta ctatcctgca ggaacgtatt 480
agacgtagaa aa 492
<210> 11
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgtcatttgc cagataccca tggtttacga aactggaggg tgttaacttt gcttggtcaa 60
atgagacgtc tgtcagctgg ttcttgtgat cattacacta atgactttgc tttccccaaa 120
gaactgtttg acggacagcg tttgcaagaa gctcaagctt tatctgtggt ccacgttatg 180
acacaaaagg tattccattt attttgtcct gatacctcaa gtgctccatg gaacatgacc 240
ctattagaag agctatgtag tggtttgtct gaacagctgg atgacctgga ggcatgtccc 300
ttgcaagaag ccggtttggc tgagaccccc ttgatgcacg aggattctac tttgagaact 360
tacttccaac gtatttcatt atatttgcag gatagaaacc actccccttg cgcttgggaa 420
atggttagag ccgaaattgg aagaagtttc tttagttcta ctatcctgca ggaacgtgtt 480
agacgtagaa aa 492
<210> 12
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tgtcatttgc cagataccca tggtttacga aactggaggg tgttaacttt gcttggtcaa 60
atgagacgtc tgtcagctgg ttcttgtgat cattacacta atgactttgc tttccccaaa 120
gaactgtttg acggacagcg tttgcaagaa gctcaagctt tatctgtggt ccacgttatg 180
acacaaaagg tattccattt attttgtcct gatacctcaa gtgctccatg gaacatgacc 240
ctattagaag agctatgtag tggtttgtct gaacagctgg atgacctgga ggcatgtccc 300
ttgcaagaag ccggtttggc tgagaccccc ttgatgcacg aggattctac tttgagaact 360
tacttccaac gtatttcatt atatttgcag gatagaaacc actccccttg cgcttgggaa 420
atggttagag ccgaaattgg aagaagtttc tttagttcta ctatcctgca ggaacgtctg 480
agacgtagaa aa 492
<210> 13
<211> 492
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgtcatttgc cagataccca tggtttacga aactggaggg tgttaacttt gcttggtcaa 60
atgagacgtc tgtcagctgg ttcttgtgat cattacacta atgactttgc tttccccaaa 120
gaactgtttg acggacagcg tttgcaagaa gctcaagctt tatctgtggt ccacgttatg 180
acacaaaagg tattccattt attttgtcct gatacctcaa gtgctccatg gaacatgacc 240
ctattagaag agctatgtag tggtttgtct gaacagctgg atgacctgga ggcatgtccc 300
ttgcaagaag ccggtttggc tgagaccccc ttgatgcacg aggattctac tttgagaact 360
tacttccaac gtatttcatt atatttgcag gatagaaacc actccccttg cgcttgggaa 420
atggttagag ccgaaattgg aagaagtttc tttagttcta ctatcctgca ggaacgtatt 480
agacgtaaag aa 492
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
catcatcatc atcatcat 18

Claims (5)

1.一种高活性的犬α干扰素重组蛋白，其特征在于，所述犬α干扰素重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
2.一种权利要求1所述的高活性的犬α干扰素重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将CaIFN-α进行氨基酸位点突变成犬α干扰素突变体CaIFN-α-Mut，CaIFN-α、CaIFN-α-Mut以及蛋白标签合成之前分别进行密码子优化，之后合成于质粒载体上，经双酶切后克隆至酵母表达载体得到重组质粒，之后经酶切线性化、导入表达宿主菌得到重组酵母菌，之后经诱导表达、层析纯化得到目的蛋白即犬α干扰素重组蛋白。
3.由权利要求2所示的犬α干扰素重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述酵母表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P。
4.由权利要求2所示的犬α干扰素重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达宿主菌包括毕赤酵母宿主菌或酿酒酵母菌。
5.一种权利要求1所述的高活性的犬α干扰素重组蛋白在制备抗病毒药物的应用。
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