CN112034114A - 一种水产品的人体外半动态模拟消化方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于体外模拟消化技术领域的一种水产品的人体外半动态模拟消化方法及装置。包括口腔模拟：在水产品中加入口腔模拟消化液和CaCl2(H2O)2溶液孵育，得到口腔模拟消化物；胃模拟：胃模拟消化液加入口腔模拟消化物，分批加入盐酸溶液后pH为2.0‑1.2；将水将体系补足20mL；加入CaCl2(H2O)2溶液孵育，得到胃模拟消化物；肠模拟：在胃模拟消化物中加入肠模拟消化液，采用氢氧化钠调pH至6.9‑7.4，加水补足40mL，加入CaCl2(H2O)2溶液孵育，得到肠模拟消化物。所述模拟消化液配方更科学全面，消化条件pH值更细致，模拟消化阶段并非的静态不变，能更好地贴合人体消化状况。

Description

一种水产品的人体外半动态模拟消化方法及装置
技术领域
本发明属于体外模拟消化技术领域，尤其涉及一种水产品的人体外半动态模拟消化方法及装置。
背景技术
我国是水产大国，从20世纪90年代起，我国渔业产品的产量已经持续多年位列世界渔业产量榜首，2018年全国水产品总产量6457.66万吨，全国人均占有量已达到46.28千克。常见的水产品包括有鱼类、虾类、蟹类、贝类等产品，含有优质蛋白及不饱和脂肪酸，所含维生素种类丰富、碳水化合物较少，比起禽畜产品脂肪含量更低、更易于消化，营养价值较高。随着我国人民健康意识的增强、居民收入的提高，水产品消费市场有着不错的未来发展潜力，水产品蛋白将成为居民获取优质蛋白的重要来源。
近年来，不少研究已表明人体内部复杂的消化过程对于食物营养成分的吸收利用有着不可忽视的影响作用，传统地基于营养物单一成分进行提取分析所得的研究结果，并不能充分地阐释某类食物的营养价值或生理功效，重要营养素蛋白质的相关研究更是如此，为了获取较高指导意义的研究结果，消化实验的建立使用是必要的。
体内消化实验受活体对象选择的影响较大，由于个体差异明显、耗时较长、成本较高、涉及伦理道德问题等突出缺点，目前无法做到广泛使用。因而，具有省时省力、灵活性好、费用较低、重复性好、无个体差异影响等特点的体外模拟消化实验，在近年来受到广泛关注及应用。现已开发出不少体外动态消化模型，除人体外还模拟了其他动物，例如猪、鼠等；相较于体外静态消化模型而言，设备复杂繁多，搭建及维护麻烦，费用成本依旧偏高，难以达成大范围、低成本的推广使用。而关于体外静态消化方法的研究开发中，一般地采用磁力搅拌或者振荡摇床进行混匀，配制的模拟消化液也偏于简单，消化酶及无机盐等组分的选用还不够贴切人体真实情况，部分甚至缺乏口腔模拟阶段。模拟消化相关专利中，已有针对经济藻类、薏米、小麦面条、碳水化合物等物质的静态模拟消化方法内容公布侧重点大多偏向植物活性物质、碳水化合物等物质的变化，胃消化阶段常常出现胃脂肪酶的省略及pH值的几乎静态不变。国外Laura Sams等人发布于Food&Function(2016)的研究中提出人胃pH值在进食后并非静态不变，而是先从1.0-1.5上升至5-7、再逐渐降低于3h后变回1.0-1.5，显然pH值变化会明显改变酶活以影响消化进程，而鱼虾贝类等为代表的水产品有着“高蛋白、低碳水、不饱和脂肪酸丰富”的成分含量特点，但对于水产品蛋白的体外半动态模拟消化方法尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种水产品的人体外半动态模拟消化方法，包括以下步骤：
1)口腔模拟：在预处理后的水产品中加入口腔模拟消化液，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到口腔模拟消化物；
2)胃模拟：将胃模拟消化液加入口腔模拟消化物，混合，分批次加入盐酸溶液，所述盐酸溶液全部加入后，体系pH为2.0-1.2，盐酸溶液总加入量不超过5mL；用超纯水将胃模拟消化体系补充至20mL；加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到胃模拟消化物；
3)肠模拟：在胃模拟消化物中加入肠模拟消化液，采用氢氧化钠溶液调pH值至6.9-7.4，所用氢氧化钠溶液不超过5mL；用超纯水将肠消化体系补足至40mL，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到肠模拟消化物。
所述步骤1)中水产品/g与口腔模拟消化液/mL的加入比例为1:1；
所述步骤2)口腔模拟消化物/mL与胃模拟消化液/mL加入量比例为：2:1；
所述步骤3)胃模拟消化物/mL与肠模拟消化液/mL加入量比例为：4:3。
口腔模拟消化液配方：取1mL口腔电解质液后用超纯水补到5mL，添加150U/mL的α-淀粉酶或人体口腔唾液淀粉酶；
胃模拟消化液配方：取2mL胃电解质液后用超纯水补到5mL，添加8000U/mL的猪胃粘膜胃蛋白酶、240U/mL兔胃脂肪酶或黑曲霉Aspergillus niger的脂肪酶；
肠模拟消化液配方：取4mL肠电解质液后用超纯水补到10mL，添加400U/mL的猪胰蛋白酶、100U/mL的牛胰凝乳蛋白酶、800U/mL的猪胰α-淀粉酶、8000U/mL的猪胰脂肪酶、16000U/mL的猪胰辅脂肪酶，混合均匀得到溶液A；采用牛胆盐或猪胆盐，配备成80mM浓度的溶液B；将溶液A和溶液B按体积比2:1混合得到肠模拟消化液。
所述溶液A是胰液素。
口腔电解质液配方：70-80mmol/LKCl、17-20mmol/L KH2PO4、60-65mmol/LNaHCO3、5-6mmol/L NaCl、0.7-0.8mmol/L MgCl2(H2O)6、0.2-0.4mmol/L(NH4)2CO3；
更优的，口腔电解质液配方：75.5mmol/LKCl、18.5mmol/L KH2PO4、62.6mmol/LNaHCO3、5.4mmol/L NaCl、0.75mmol/L MgCl2(H2O)6、0.3mmol/L(NH4)2CO3；
胃电解质液配方：30-40mmol/LKCl、4-5mmol/L KH2PO4、45-50mmol/LNaHCO3、300-330mmol/L NaCl、0.5-0.7mmol/L MgCl2(H2O)6、2-3mmol/L(NH4)2CO3；
更优的，胃电解质液配方：34.5mmol/LKCl、4.5mmol/L KH2PO4、47mmol/LNaHCO3、314mmol/L NaCl、0.6mmol/L MgCl2(H2O)6、2.5mmol/L(NH4)2CO3。
肠电解质液配方：32-36mmol/LKCl、3.5-4.5mmol/L KH2PO4、370-400mmol/LNaHCO3、230-240mmol/L NaCl、1.6-1.7mmol/L MgCl2(H2O)6；
更优的，肠电解质液配方：34mmol/LKCl、4mmol/L KH2PO4、383mmol/LNaHCO3、234mmol/L NaCl、1.65mmol/L MgCl2(H2O)6。
所述CaCl2(H2O)2溶液浓度为0.15mol/L；
所述混合过程采用涡旋振荡器，混合时间为1-8s；
所述孵育时间为2.0-3.0h，孵育过程进行360°翻转震荡；
所述步骤1)水产品/g与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；口腔消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.6-0.9mmol/L；
所述步骤2)口腔模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；胃消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.4-0.6mmol/L；
所述步骤3)胃模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为20:0.08；肠消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.4-0.7mmol/L。
所述步骤1)之前，所需使用的试剂及样品预先在模拟消化装置的恒温室进行37℃水浴保温；消化室提取开启至温度为37℃，转速16-24rpm；
所述步骤1)中预处理具体为：将水产品进行清洗、拆分以去除不可食用部分，采用蒸或煮的方式将其熟制，随后用料理机绞碎、匀浆，分装放入带盖离心管内备用；所述绞碎功率为400-600W，绞碎时间为4-5min。
所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内至少均分10次加入；
具体地，所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分10次加入，每次间隔12min、每次加入8％；
更具体地，所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分20次加入，每次间隔6min、每次加入4％。
终止反应及取样过程为：
胃模拟：加入酶抑制剂，或用氢氧化钠/碳酸氢钠溶液调节pH值至8.0-8.5以终止酶解，并取样；
肠模拟：加入酶抑制剂，或通过90℃以上的热水浴以烫灭酶活性，并取样。
一种模拟消化装置，其特征在于，包括恒温室、控制***、消化室三个部分；
恒温室和消化室是由内胆2围成的恒温水浴室3和恒温消化室15，外层套设一层保护外壳1，顶部分别采用透明密封盖4密封；
恒温室底部设置出水管6、加热装置7和温度传感器8；加热装置7和温度传感器8联通控制***的温度控制***9；
恒温水浴室3水面放置固定模拟容器的带孔塑料浮板5；
消化室底部设置与控制***的温度控制***9相连的温度传感器8；恒温消化室15内设置滚动搅拌装置，滚动搅拌装置由垂直架设的主轴承20和支轴承21，以及带孔旋转面板22组成，主轴承20两端采用连接紧固件19固定在恒温消化室15侧壁上，连接安装在控制***的旋转电机11，并通过翻转控制***10进行控制；
带孔旋转面板22绕主轴承20进行翻转震荡；恒温消化室15侧壁上还设置散热面板孔17，以及与控制***相连的加热风扇16和降温风扇18，控制***包括温度控制***9和翻转控制***；
控制***上串联布设电源总开关12、显示调节仪13和控制按钮14，显示和调节温度及翻转速率。
本发明的有益效果在于：
1.模拟消化液中酶及无机盐等组分的配方选用更科学全面，消化条件pH值的设计更细致，模拟胃消化阶段并非完全的静态不变，能更好地贴合人体消化状况；
2.本方法模拟方法中消化过程采用翻转式混合，食糜混合效果佳，重复性较好；
3.本发明模拟消化装置设计一体化，预热步骤所需恒温水浴装置与消化阶段所需恒温翻转装置“合二为一”，简便易携，维护简单，费用成本低；
4.本发明模拟消化装置在恒温水浴室和恒温消化室设置带孔塑料浮板和带孔旋转面板，固定试样管，“一根管一个样”设置方便，利于快速地进行大批量样品的筛选检测，易于推广。
附图说明
图1为本发明装置的主视图；
图2为本发明装置的右视图；
其中：
1.保护外壳2.内胆3.恒温水浴室4.透明密封盖5.带孔塑料浮板6.出水管7.加热装置8.温度传感器9.温度控制***10.翻转控制***11.翻转电机12.电源总开关13.显示调节仪14.控制按钮15.恒温消化室16.加热风扇17.散热面板孔18.降温风扇19.连接紧固件20.主轴承21.支轴承22.带孔旋转面板23.电源插头。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明：
一种水产品的人体外半动态模拟消化方法，包括以下步骤：
1)口腔模拟：在预处理后的水产品中加入口腔模拟消化液，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到口腔模拟消化物；
2)胃模拟：将胃模拟消化液加入口腔模拟消化物，混合，分批次加入盐酸溶液，所述盐酸溶液全部加入后，体系pH为2.0-1.2，盐酸溶液总加入量不超过5mL；用超纯水将胃模拟消化体系补充至20mL；加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到胃模拟消化物；
3)肠模拟：在胃模拟消化物中加入肠模拟消化液，采用氢氧化钠溶液调pH值至6.9-7.4，所用氢氧化钠溶液不超过5mL；用超纯水将肠消化体系补足至40mL，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到肠模拟消化物。
步骤1)中水产品/g与口腔模拟消化液/mL的加入比例为1:1；
步骤2)口腔模拟消化物/mL与胃模拟消化液/mL加入量比例为：2:1；
步骤3)胃模拟消化物/mL与肠模拟消化液/mL加入量比例为：4:3。
口腔模拟消化液配方：取1mL口腔电解质液后用超纯水补到5mL，添加150U/mL的α-淀粉酶或人体口腔唾液淀粉酶；
胃模拟消化液配方：取2mL胃电解质液后用超纯水补到5mL，添加8000U/mL的猪胃粘膜胃蛋白酶、240U/mL兔胃脂肪酶或黑曲霉Aspergillus niger的脂肪酶；
肠模拟消化液配方：取4mL肠电解质液后用超纯水补到10mL，添加400U/mL的猪胰蛋白酶、100U/mL的牛胰凝乳蛋白酶、800U/mL的猪胰α-淀粉酶、8000U/mL的猪胰脂肪酶、16000U/mL的猪胰辅脂肪酶，混合均匀得到溶液A；采用牛胆盐或猪胆盐，配备成80mM浓度的溶液B；将溶液A和溶液B按体积比2:1混合得到肠模拟消化液。
溶液A是胰液素。
口腔电解质液配方：75.5mmol/LKCl、18.5mmol/L KH2PO4、62.6mmol/LNaHCO3、5.4mmol/L NaCl、0.75mmol/L MgCl2(H2O)6、0.3mmol/L(NH4)2CO3；
胃电解质液配方：34.5mmol/LKCl、4.5mmol/L KH2PO4、47mmol/LNaHCO3、314mmol/LNaCl、0.6mmol/L MgCl2(H2O)6、2.5mmol/L(NH4)2CO3；
肠电解质液配方：34mmol/LKCl、4mmol/L KH2PO4、383mmol/LNaHCO3、234mmol/LNaCl、1.65mmol/L MgCl2(H2O)6。
CaCl2(H2O)2溶液浓度为0.15mol/L；
混合过程采用涡旋振荡器，混合时间为1-8s；
孵育时间为2.0-3.0h，孵育过程进行360°翻转震荡；
步骤1)水产品/g与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；
步骤2)口腔模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；
步骤3)胃模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为20:0.08。
步骤1)之前，所需使用的试剂及样品预先在模拟消化装置的恒温室进行37℃水浴保温；消化室提取开启至温度为37℃，转速16-24rpm；
步骤1)中预处理具体为：将水产品进行清洗、拆分以去除不可食用部分，采用蒸或煮的方式将其熟制，随后用料理机绞碎、匀浆，分装放入带盖离心管内备用；所述绞碎功率为400-600W，绞碎时间为4-5min。
步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内至少均分10次加入；
具体地，步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分10次加入，每次间隔12min、每次加入8％；
更具体地，步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分20次加入，每次间隔6min、每次加入4％。
终止反应及取样过程为：
胃模拟：加入酶抑制剂，或用氢氧化钠/碳酸氢钠溶液调节pH值至8.0-8.5以终止酶解，并取样；
肠模拟：加入酶抑制剂，或通过90℃以上的热水浴以烫灭酶活性，并取样。
一种水产品的体外模拟消化反应装置，如图1和图2所示，从包括恒温室、控制***、消化室三个部分，恒温室和消化室是由保温隔热功能的内胆2围成的恒温水浴室3和恒温消化室15，外层套设一层保护外壳1，顶部分别采用透明密封盖4密封；恒温室底部设置出水管6、加热装置7和温度传感器8；加热装置7和温度传感器8联通控制***的温度控制***9；
操作过程中在恒温水浴室3内注入适量的水，并在水面放置带孔塑料浮板5，将模拟装置放置于孔内进行水浴加热，为试剂存取提供便利；
消化室底部也设置与控制***的温度控制***9相连的温度传感器8；恒温消化室15内设置滚动搅拌装置，滚动搅拌装置由垂直架设的主轴承20和支轴承21，以及带孔旋转面板22组成，主轴承20两端采用连接紧固件19固定在恒温消化室15侧壁上，连接安装在控制***的旋转电机11，并通过翻转控制***10进行控制；
带孔旋转面板22在主轴承的带动下进行360°翻转震荡；恒温消化室15侧壁上还设置散热面板孔17，以及与控制***相连的加热风扇16和降温风扇18，控制***包括温度控制***9和翻转控制***。
控制***上还串联布设电源总开关12、显示调节仪13和控制按钮14，用于显示和调节温度及翻转速率，通过电源插头23连接外部电源。
恒温水浴室下端设置有出水管6，可调节水位高低，恒温水浴室3可在正式消化提前单独开启以便预热试剂及样品，恒温消化室15亦可在不启动翻转下预先加热保温。
实施例1：
温度控制***与温度传感器、加热装置、加热风扇及降温风扇相连接，翻转控制***与电机相连接，以上两个控制***均与显示调节仪相连接，操作设置较为方便，***电源后打开总开关即可进行设置运行。温控***根据从传感器收集到的信息以及目标参数设置，可自动调节水加热装置、加热风扇及降温的运转状况，以达到最终所需条件设定。翻转控制***亦是如此，通过监控及调节翻转电机运行状况以达到所需的翻转混合转速及转向。翻转电机通过连接紧固件连接并带动主轴承的旋转，主轴承上的支轴承能套扣并固定好带孔旋转面板，进而带动旋转面板运动，面板可灵活更换，面板也可随支承轴旋转、能在多个不同平面角度以被固定。带孔旋转面板及带孔塑料浮板均有不同的孔径规格，与不同大小的带盖离心管相匹配，离心管常见的有50mL、15mL、5mL、1mL等规格，离心管***对应规格的塑料浮板或旋转面板后，可通过合理程度的挤压及摩擦以保持相对固定，随主轴承转动而转动，以翻转形式将样品混合。透明密封盖在放样或取样时可打开，透过它能较好的观察模拟消化过程中，透明离心管内样品的外观变化。较好的密封性及预热步骤的设计，使得该体外模拟消化反应装置有利于保持较稳定的恒温环境，而翻转式的混合也利于样品与消化液的充分接触，为模拟消化结果的较高指导意义提供保障。
实施例2：
牡蛎经大火蒸制8min后去除外壳，可食用部分通过400W料理机处理4min后变为糜状，称取5g分装于带盖离心管，与预先配好的模拟消化液、钙离子溶液夹紧于带孔塑料浮板上，一同在37℃恒温水浴室进行保温，恒温消化室提前预热达到37℃稳定。
口腔模拟阶段：每5g预处理后的水产品加入5mL口腔模拟消化液，该体系总体积为10mL，体系内除水产品样品外加入有7.55mmol/L KCl、1.85mmol/L KH2PO4、6.26mmol/LNaHCO3、0.54mmol/L NaCl、0.075mmol/L MgCl2(H2O)6、0.03mmol/L(NH4)2CO3、0.75mmol/LCaCl2(H2O)2、75U/mL的α-淀粉酶；离心管夹紧设置于带孔旋转面板的各个孔内，在37℃下在恒温消化室中以20rpm转速翻滚震荡，孵育5min，得到口腔模拟消化物。
胃模拟阶段：每10mL口腔模拟消化物加入5mL胃消化模拟液，构成总体积为20mL的胃模拟消化体系，该体系内除10mL口腔模拟消化物外，还包括有7.225mmol/L KCl、1.375mmol/L KH2PO4、7.83mmol/L NaHCO3、31.67mmol/L NaCl、0.0975mmol/L MgCl2(H2O)6、0.265mmol/L(NH4)2CO3、0.45mmol/L CaCl2(H2O)2、2000U/mL的胃蛋白酶、60U/mL的脂肪酶；调节酸碱值所用1M盐酸溶液总体积为2mL，预先加入20％(0.4mL)，余下1.6mL每间隔12min、按0.16mL/次加入；37℃下在恒温消化室中以20rpm转速共孵育2.5h，各次加酸后pH值依次变为4.9、4.0、3.4、2.9、2.6、2.3、2.1、1.9、1.8、1.7、1.6，胃消化终点pH为1.9，在2.0—1.2范围内，得到胃模拟消化物。
采用氢氧化钠/碳酸氢钠溶液调节pH值至8.0-8.5以终止酶解，4℃下离心(20000rpm，12min)取出上清液，真空冷冻干燥处理后密封保存备用。
肠模拟阶段：每20mL胃模拟消化物加入15mL肠模拟消化液，构成总体积为40mL的肠模拟消化体系，该体系内除20mL胃模拟消化物外约有7.013mmol/L KCl、1.088mmol/LKH2PO4、42.215mmol/L NaHCO3、39.235mmol/L NaCl、0.214mmol/L MgCl2(H2O)6、0.133mmol/L(NH4)2CO3、0.31mmol/L CaCl2(H2O)2、16.67mg/mL的牛胰凝乳蛋白酶(其内猪胰蛋白酶为100U/mL)、10mM牛胆汁盐溶液；调节酸碱值所用1M氢氧化钠溶液体积为1.3mL，37℃下在恒温消化室中以20rpm转速孵育2.0h，肠消化起点和终点pH分别为7.1、7.0，在6.9—7.4范围内，得到肠模拟消化物。
95℃水浴8min灭活后，4℃下离心(20000rpm，12min)取出上清液，真空冷冻干燥处理后密封保存备用，剩余沉淀物-20℃暂存。
实施例3：
实施例2中胃、肠模拟阶段最终加入酶抑制剂终止反应，4℃下离心(20000rpm，12min)取出上清液，真空冷冻干燥处理后密封保存备用，其他步骤均与实施例2相同。
实施例4
终止消化后离心获取的对应不同阶段的样品上清液，可经由以下主要步骤进行进一步的模拟消化产物的分析与评价。
1)脱盐处理：取得的消化样品，通过固相萃取去除过多的盐等杂物，根据说明书使用C18(Waters,USA)固相萃取柱(Vac 35cc,10g)，0.1％三氟乙酸的水溶液为清洗溶剂，50％乙腈的水溶液为样品溶剂，整个过程在固相萃取仪中进行。
2)超滤分离，使用截留分子量分别为10kDa、5kDa、3kDa的中空纤维超滤膜将模拟消化样液进行分离，分别得到N1：＞10kDa；N2：5～10kDa；N3：3～5kDa；N4：＜3kDa。各组分冷冻干燥后置于-20℃保存备用。
3)凝胶过滤层析分离，样品配成10mg/mL溶液，取5mL装入预先准备的Sephadex G-15凝胶色谱柱(0.6×100cm，Biodee Biotech)，然后用蒸馏水作为洗脱液以2.0mL/min的流速分离样品，并在280nm处进行监测。收集观察到的所有成分并冻干，可测定不同部分的生物活性(过敏性)，以选取最高的组分进行后续分离测定。
4)RP-HPLC分离，通过RP-HPLC(Shimadzu Technologies)，Kromasil C18色谱柱(4.6×250mm，SE-445 80Bohus)，进样质量浓度10mg/mL，并用0.45μm的微滤膜过滤，然后注入色谱柱中。用0.1％(v/v)TFA超纯水水溶液(溶剂A)和0.1％TFA乙腈(溶剂B)洗脱。洗脱步骤如下：5％B持续0至5分钟，然后5至40分钟B线性梯度洗脱从5％到45％，然后回到5％B持续10分钟，流速为1mL/min，并在220nm处检测到洗脱峰，通过自动部分收集器对各组分收集并冻干，测定比对各自的生物活性(过敏性)。
5)LC-MS/MS鉴定，采用Thermo Q-Exactive高分辨率质谱仪，选择电喷雾阳离子扫描模式，毛细管电压3.8kV，扫描范围为0.3～2ku；喷雾压力2kV；传输毛细管温度为350℃；二级质谱碰撞电压为10eV。所用色谱条件为：流动相A为含0.1％甲酸的超纯水(色谱级)；流动相B为含0.1％甲酸的乙睛(色谱级)；进样量为5μL；进样质量浓度2mg/mL；梯度洗脱条件为0～40min，B从1％到40％。洗脱液流入质谱仪***用于分析。利用Mascot 2.4搜索引擎(Matrix Science，Boston，MA，USA)进行Swiss-Prot数据库搜索，并借由BIOPEP和www.allergen.org数据库及分析程序预测样品中重要肽段产物的生物活性(过敏性)。

Claims (10)

1.一种水产品的人体外半动态模拟消化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)口腔模拟：在预处理后的水产品中加入口腔模拟消化液，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到口腔模拟消化物；
2)胃模拟：将胃模拟消化液加入口腔模拟消化物，混合，分批次加入盐酸溶液，所述盐酸溶液全部加入后，体系pH为2.0-1.2，盐酸溶液总加入量不超过5mL；用超纯水将胃模拟消化体系补充至20mL；加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到胃模拟消化物；
3)肠模拟：在胃模拟消化物中加入肠模拟消化液，采用氢氧化钠溶液调pH值至6.9-7.4，所用氢氧化钠溶液不超过5mL；用超纯水将肠消化体系补足至40mL，混合，加入CaCl2(H2O)2溶液后转至模拟消化装置的消化室内孵育，得到肠模拟消化物。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，
所述步骤1)中水产品/g与口腔模拟消化液/mL的加入比例为1:1；
所述步骤2)口腔模拟消化物/mL与胃模拟消化液/mL加入量比例为：2:1；
所述步骤3)胃模拟消化物/mL与肠模拟消化液/mL加入量比例为：4:3。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，
口腔模拟消化液配方：取1mL口腔电解质液后用超纯水补到5mL，添加150U/mL的α-淀粉酶或人体口腔唾液淀粉酶；
胃模拟消化液配方：取2mL胃电解质液后用超纯水补到5mL，添加8000U/mL的猪胃粘膜胃蛋白酶、240U/mL兔胃脂肪酶或黑曲霉Aspergillus niger的脂肪酶；
肠模拟消化液配方：取4mL肠电解质液后用超纯水补到10mL，添加400U/mL的猪胰蛋白酶、100U/mL的牛胰凝乳蛋白酶、800U/mL的猪胰α-淀粉酶、8000U/mL的猪胰脂肪酶、16000U/mL的猪胰辅脂肪酶，混合均匀得到溶液A；采用牛胆盐或猪胆盐，配备成80mM浓度的溶液B；将溶液A和溶液B按体积比2:1混合得到肠模拟消化液。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述溶液A是胰液素。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，
口腔电解质液配方：70-80mmol/LKCl、17-20mmol/L KH2PO4、60-65mmol/LNaHCO3、5-6mmol/L NaCl、0.7-0.8mmol/L MgCl2(H2O)6、0.2-0.4mmol/L(NH4)2CO3；
胃电解质液配方：30-40mmol/LKCl、4-5mmol/L KH2PO4、45-50mmol/LNaHCO3、300-330mmol/L NaCl、0.5-0.7mmol/L MgCl2(H2O)6、2-3mmol/L(NH4)2CO3；
肠电解质液配方：32-36mmol/LKCl、3.5-4.5mmol/L KH2PO4、370-400mmol/LNaHCO3、230-240mmol/L NaCl、1.6-1.7mmol/L MgCl2(H2O)6。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，
所述CaCl2(H2O)2溶液浓度为0.15mol/L；
所述混合过程采用涡旋振荡器，混合时间为1-8s；
所述孵育时间为2.0-3.0h，孵育过程进行360°翻转震荡；
所述步骤1)水产品/g与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；口腔消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.6-0.9mmol/L；
所述步骤2)口腔模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为1:0.01；胃消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.4-0.6mmol/L；
所述步骤3)胃模拟消化物/mL与CaCl2(H2O)2溶液/mL的加入比例为20:0.08；肠消化物最终体系中Ca2+添加浓度0.4-0.7mmol/L。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)之前，所需使用的试剂及样品预先在模拟消化装置的恒温室进行37℃水浴保温；消化室提取开启至温度为37℃，转速16-24rpm；
所述步骤1)中预处理具体为：将水产品进行清洗、拆分以去除不可食用部分，采用蒸或煮的方式将其熟制，随后用料理机绞碎、匀浆，分装放入带盖离心管内备用；所述绞碎功率为400-600W，绞碎时间为4-5min。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内至少均分10次加入；
具体地，所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分10次加入，每次间隔12min、每次加入8％；
更具体地，所述步骤2)盐酸溶液的分批次加入方法具体为：预先加入盐酸溶液的20％，余下80％在2h内分20次加入，每次间隔6min、每次加入4％。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，终止反应及取样过程为：
胃模拟：加入酶抑制剂，或用氢氧化钠/碳酸氢钠溶液调节pH值至8.0-8.5以终止酶解，并取样；
肠模拟：加入酶抑制剂，或通过90℃以上的热水浴以烫灭酶活性，并取样。
10.一种权利要求1-9任一项所述方法使用的模拟消化装置，其特征在于，包括恒温室、控制***、消化室三个部分；
恒温室和消化室是由内胆(2)围成的恒温水浴室(3)和恒温消化室(15)，外层套设一层保护外壳(1)，顶部分别采用透明密封盖(4)密封；
恒温室底部设置出水管(6)、加热装置(7)和温度传感器(8)；加热装置(7)和温度传感器(8)联通控制***的温度控制***(9)；
恒温水浴室(3)水面放置固定模拟容器的带孔塑料浮板(5)；
消化室底部设置与控制***的温度控制***(9)相连的温度传感器(8)；恒温消化室(15)内设置滚动搅拌装置，滚动搅拌装置由垂直架设的主轴承(20)和支轴承(21)，以及带孔旋转面板(22)组成，主轴承(20)两端采用连接紧固件(19)固定在恒温消化室(15)侧壁上，连接安装在控制***的旋转电机(11)，并通过翻转控制***(10)进行控制；
带孔旋转面板(22)绕主轴承(20)进行翻转震荡；恒温消化室(15)侧壁上还设置散热面板孔(17)，以及与控制***相连的加热风扇(16)和降温风扇(18)；
控制***上串联布设电源总开关(12)、显示调节仪(13)和控制按钮(14)，显示和调节温度及翻转速率。
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