CN112020651A - 用于家禽肠道健康的肠道和粪便生物标志物 - Google Patents
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Abstract
驯养的鸟(如肉鸡)的生长性能、健康和幸福很大程度上依赖于功能良好的肠道。由此，非常需要找到对于肠损伤为特异性的并在本领域可容易应用的生物标志物。本发明公开了一套20种特异性蛋白质，其可以在所述鸟的新鲜粪便滴落物和/或肠道内容物中定量，且其每种都与受损的肠特异性相关。
Description
发明的技术领域
驯养的鸟如肉鸡的生长性能、健康和幸福很大程度依赖于功能良好的肠道。由此，非常需要找到对于肠损伤为特异性的并在本领域可容易应用的生物标志物。本发明公开了一套20种特异性蛋白质，所述特定蛋白质可以在所述鸟的新鲜粪便滴落物和肠道内容物中定量，且其每种都与受损的肠特异性相关。
背景技术
家禽如肉食鸡具有所有产肉动物中最低的饲料转化，并因此被认为是相对可持续的动物蛋白来源，其产生和消费仍然世界范围内地上升(Scanes,2007,Cowieson和Selle,2012)。功能良好的肠道是对于消化和营养吸收和由此的较低饲料转化的关键重点，也对肉鸡的健康和幸福至关重要(Bailey等.,2010)。事实上，肠道疾病和综合征在肉鸡中相当常见，并构成了进行治疗的最重要原因(Casewell等.,2003)。在家禽实践中，球虫病为迄今为止最重要的肠道疾病(Yegani和Korver，2008；Caly等.,2015)。由细菌病原体引起的临床疾病不常见，但普遍认为，多种肠道综合征包括亚临床坏死性肠炎和球虫病，病毒性肠炎，和各种非限定的肠炎综合征正在影响肉鸡性能，(Yegani和Korver,2008)。确诊这些亚临床实体，并将它们与不具有传染性病因的性能问题进行区别并不是明了的，所述性能问题是如由不总是引起肠道损伤的非最理想配制饮食引起的那些。
肠道壁结构和形态为肠道健康的主要决定因素。能够容易地使用尸检时对肠道壁的宏观观察来监测由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和球虫(coccidia)引起的肠道病变(Johnson和Reid,1970)，但对于更细微的肠道病理学则不很清楚。肠壁(如肠壁张力和厚度)和肠道内容物(如黏度)的宏观改变可以被有经验的兽医作为肠道健康的参数使用，但在一些程度上是主观的(Teirlynck等.,2011)。组织病理学显微镜观察给出肠道健康的精确描述，因为绒毛结构、上皮细胞缺陷和炎症能够被评分(Yamauchi,2002)。在任何情况下，上述肠道健康监测***应在死后进行而不具有较高的预测诊断价值，尽管成群的动物中可以牺牲并用于监视疾病。
用于肠道健康的可定量的容易测量的生物标志物仍然没有在实践中用于肉食鸡，但作为独立于触发因素是否来自宿主，营养的或微生物的因素的，用于监视引起性能问题的亚临床肠道实体和评价对于肠道健康的控制方法的工具将有巨大的价值。上皮损伤和上皮通透性可能是对在肉食鸡中的肠道健康问题的主要驱动因素，并且对这些细胞和肠粘膜的损伤通过绒毛缩短，隐窝延长和炎症细胞的浸润而表征(Teirlynck等.，2011；Adelman等.，2018)。已表明，绒毛长度的增加，和绒毛与隐窝比的增加与生长性能的改善有关联(Awad等.，2009)。虽然肠中的炎症反应对控制和遏制感染是不可缺少的，这些反应应该也有向抗炎症状态的精确转变，因为炎症在耗费能量，而这影响性能(Broom和Kogut，2018)。
已经开发了各种***来测量肠道通透性，但主要使用在实验性模型中(Gilani等.，2016；Gilani等.，2017；Wang等.，2015)。已显示对分子在血清或者血浆中的定量具有价值，所述分子是口服施用的且因为它们的大小差异，能够或不能穿过上皮层而没有肠道损伤和提高的通透性。实例为乳糖和甘露醇(乳糖/甘露醇比(LMR)，Gilani等.，2017)在血浆中的浓度比，或荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-葡聚糖)在血清中(Gilani等.，2018；Kuttappan等.，2015)的浓度比，在口服递送这些化合物至动物后，具有表示肠道通透性高的提高的LMR或者FITC-葡聚糖水平。用于肠健康的其他生物标志物已被在血清中评价，它们中大多数是急性期蛋白(O′Reilly和Eckersall，2014)，但这些对肠损伤不是特异性的。而且，所有血液标志物都需要侵入性取样，而侵入性取样在家禽实践中不优选作为诊断性检验。虽然非常多的标志物已使用转录组学方法在肠组织上被识别(Hong等.，2014)，但这些也不适用本领域。因此，显然需要找到用于家禽的肠道健康的肠道和/或粪便生物标志物，其存在于新鲜粪便滴落物，窝或者肠道内容物样品中，以便在本领域中适用。在人类中，钙卫蛋白被使用于评价严重肠疾病情况下的炎症的病例，并已证明为可靠的和特异性的(Canani等.，2008；Chang等.，2014)。然而，对于家禽如鸡，已知没有用于肠健康的肠道蛋白生物标志物。
附图的简要说明
图1|在第26天，对于对照和攻击而言每栏的平均体重(g)(图1a)，宏观肠外观评分(图1b)和球虫病评分(图1c)。*表示在对照和攻击处理组之间统计学显著性为p＜0.05。
图2|在第26天，对于对照和攻击而言，每栏的平均绒毛长度(图2a)，隐窝深度(图2b)，绒毛与隐窝比(图2c)和T-淋巴细胞浸润(CD3区域％)(图2d)。***表示在对照和攻击组之间统计学显著性为p＜0.0001。
发明内容
本发明涉及确诊家禽的肠健康的可靠的，快速和非侵入性生物标志物试验。术语“家禽”指人类为了它们的蛋、它们的肉或者它们的羽毛而饲养的驯养的鸟。这些鸟最通常的是总目鸡雁小纲(Galloanserae)的成员，特别是鸡形目，鸡形目包括鸡、鹌鹑和火鸡。本发明公开了指示肠道病理学的生物标志物的鉴定。本发明进一步描述在家禽中的肠道损伤模型，在其中，一套肠道和/或粪便生物标志物与例如绒毛缩短和CD3浸润相关，后者为肠道炎症的标志物。
因此，本发明在一方面涉及确定驯养的鸟的肠道健康状态的方法，所述方法包括：
-提供从所述驯养的鸟获得的粪便样品或肠道内容物样品；和
-在所述粪便样品或者肠道内容物样品中对蛋白或其片段进行定量，
其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，α-辅肌动蛋白-4，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，组蛋白H2A-IV，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区，组织蛋白酶D和视黄醇结合蛋白4。
更具体而言，本发明在一方面涉及确定驯养的鸟的肠道健康状态的方法，所述方法包括：
-获得所述驯养的鸟的粪便样品或肠道内容物样品；和
-对所述粪便或者肠道内容物样品中的蛋白或其片段进行定量，
其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂和载脂蛋白A-1。
术语“肠道健康状态”在一方面涉及肠道壁结构和形态的状态，所述状态可以受到例如传染性原因或非传染性起因，例如非最理想配制饮食的影响。因此，该术语主要涉指通过绒毛缩短，隐窝延长和炎症细胞的浸润而表征的上皮损伤和上皮通透性。当使用如Teirlynck等.(2011)描述的评分***进行评价时，该损伤和炎症标志物也能够关联至与“正常“外观相比的“严重的”肠的宏观外观。
术语“获得粪便或者肠道内容物样品”指收集来自所述鸟的新鲜粪便滴落物或者在所述鸟的尸检时的肠道内容物的任何方式。术语“在鸟的尸检时的肠道内容物”指在将鸟安乐死后，从存在于回肠或者结肠中的内容物收集的样品。
术语“对在所述粪便或者肠道内容物样品中的蛋白或其片段进行定量”指本领域技术人员已知的，对在所述样品中的蛋白质或者片段进行定量的任何方法。该术语的非限制性实例为质谱法(例如发现和靶向蛋白质组学，多反应监测(MRM)分析，总理论光谱测定的顺序窗口采集(all theoretical spectra assay)(SWATH)，...)其需要事先从所述样品中分离所述蛋白质或其片段。此分离可以经由使用不同的裂解缓冲剂利用或不利用珠磨或者其他常用的方法进行蛋白提取而开始进行，裂解缓冲剂如基于十二烷基硫酸钠(SDS)的蛋白裂解缓冲液，细菌蛋白提取试剂(B-Per)或者基于尿素的裂解缓冲液。对于蛋白质或其片段进行定量的手段的其他非限制性实例为ELISA和Western Blotting，它们可以不利用从所述样品的事先蛋白分离而进行。代替地，所述粪便或者肠道内容物样品可以在定量前利用或不利用珠磨而稀释(10％m/v)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者50mM Tris，150mM NaCl(pH 7.2)缓冲液中。
应该清楚的是，单一蛋白的定量能够足以确定肠道健康状态，但也可以将2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20种或者更多种蛋白质的组合用于确定所述家禽的肠道健康状态。
本发明的指示家禽中肠道病理学的蛋白生物标志物如下：
1.脊髓蛋白1
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P09840(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P08940)。所述蛋白为存在于异嗜性粒细胞的分泌颗粒中的颗粒蛋白。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 1；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
2.纤连蛋白
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P11722(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P11722)。纤连蛋白(Fn)为高分子量糖蛋白，其以可溶性形式存在在血浆中，并以不溶解形式作为细胞外基质(ECM)组分存在(Pankov和Yamada，2002)。它有助于多种细胞活动，包括伤口愈合。纤连蛋白的产生受促炎性细胞因子如IL-1-α，IL-6和TNF-α影响。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 2；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
3.膜联蛋白A5
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P17153(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P17153)。此蛋白为抗凝血蛋白，其作为凝血酶原激酶特异性复合物的间接抑制剂，而凝血酶原激酶特异性复合物参与凝血级联。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No3；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
4.核仁磷酸蛋白
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P16039(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P16039)。核仁磷酸蛋白为DNA结合核蛋白，其已被描述作为与伤口相关的蛋白(Mellgren，2010)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 4；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
5.碳酸酐酶2
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P07630(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P07630)。此酶引起二氧化碳和水的快速相互转变为碳酸氢盐和质子(或反之亦然)，该反应对于酸/碱平衡是重要的。该酶为上皮细胞中分化的标志物。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 5；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
6.氨肽酶Ey
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为O57579(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/O57579)。来自鸡(Gallus gallus domesticus)蛋黄的氨肽酶Ey(EC 3.4.11.20)为同二聚外肽酶，具有对于在底物的P1位置的N-末端氨基酸残基的广泛特异性(Midorikawa等.1998)。氨肽酶为膜结合金属肽酶家族的成员，在肠细胞的刷状缘膜上高水平表达(Gal-Garber和Uni，2000)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 6；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
7.转甲状腺素蛋白
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P27731(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P27731)。血浆转甲状腺素蛋白(TTR)为由肝分泌的血浆蛋白，与视黄醇结合蛋白4(RBP4)和其视黄醇配体结合而循环。TTR为在动物物种中高度保守的蛋白。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 7；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
如下灰框指示SEQ ID No 7的如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例：
8.卵抑制剂
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P10184(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P10184)。卵抑制剂在卵白中发现，为丝氨酸蛋白酶抑制剂，能够减少由胰蛋白酶和糜蛋白酶的酶消化。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 8；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
9.载脂蛋白A-1
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P08250(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P08250)。载脂蛋白(apo)A-1为28kDa的可交换的载脂蛋白，在脂蛋白代谢中起关键作用。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 9；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
如下灰框指示SEQ ID No 9的如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例：
10.血红蛋白亚单位β
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P02112(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P02112)。在肠道内容物中检测到血红蛋白亚单位β(HBB)表明，施用的攻击诱导了肠漏和允许红血细胞从血液泄漏到内腔的内皮损伤。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 131；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
11.超氧化物歧化酶
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P80566(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P80566)。超氧化物歧化酶(SOD)催化超氧自由基歧化为氢过氧化物(H2O2)和氧，并有助于在猫科中提高小肠保存(Sun等.，1991)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 132；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
如下灰框指示SEQ ID No 132的如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表蛋白片段的非限制性实例，所述蛋白片段可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到：
12.α-辅肌动蛋白-4
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为Q90734(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/Q90734)。通过间接免疫荧光，显示α-辅肌动蛋白-4(ACTN4)定位在鸡肠道上皮细胞的顶端部(Craig和Pardo，1979)，更具体而言，作为紧密连接(zonula occludens)(Chen等.，2006)和/或带状桥粒(zonula adherens)(Milanini等.，2017)的组分。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 133；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化结肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
13.血管紧张素转换酶
在UniProt数据库中此蛋白的登录号为Q10751(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/Q10751)。血管紧张素转换酶(ACE)定位于肠道中刷状缘膜，并作为主要的功能酶参与在小肠中蛋白消化的最后场所(Yoshioka等.，1987)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 134；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
14.含WD重复序列的蛋白质1
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为O93277(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/O93277)。含WD(色氨酸-天冬氨酸)重复序列的蛋白1(WDR1)也称为肌动蛋白互作因子1(AIP1)，作为ADF-丝切蛋白的辅因子，并通过肌动蛋白丝的分解促进肌动蛋白的周转(Fujibuchi等.，2004)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 135；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
15.线粒体的天冬氨酸氨基转移酶
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P00508(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P00508)。线粒体的天冬氨酸氨基转移酶(AATM)，以前作为谷草转氨酶为人所知，催化L-天冬氨酸和2-氧化戊二酸(oxoglutatarate)到草酰乙酸和谷氨酸的反应。这线粒体的同种型主要存在于肝中(Kaneko等.，2008)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 136；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
16.组蛋白H2A-IV
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P02263(见http：//www.uniprot.org/uniprot/P02263)。H2A4为核小体的核心成分，将DNA缠绕和压实成染色质。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 137；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
17.Igλ链C区
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P20763(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P20763)。抗体由两条重链和轻链组成，凭此鸟只有一个轻链的同种位(isotope)，亦即lambda(λ)。轻链由恒定的，Igλ链C-区(LAC)，和可变区，Igλ链V1-区(LVl)(
等.，2014)构成。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 138；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
18.Igλ链V1区
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P04210(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P04210)。抗体由两条重链和轻链组成，凭此鸟只有一个轻链的同种位，亦即lambda(λ)。轻链由恒定，Igλ链C-区(LAC)，和可变区，Igλ链V1-区(LV1)(
等.，2014)构成。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 139；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
19.组织蛋白酶D
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为Q05744(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/Q05744)。组织蛋白酶D(CATD)为天冬氨酸蛋白酶，在酸性pH时针对变性的蛋白质为最佳活性的。CATD表达在溶解体中，但也与一些细胞内膜结合而存在这点已在许多不同细胞种类中检测到(Fusek和Vetvicka，1995)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 140；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
20.视黄醇结合蛋白4
此蛋白在UniProt数据库中的登录号为P41263(见http：//www.uniprot.org/ uniprot/P41263)。转甲状腺素蛋白(TTR)为在动物物种中的高保守的蛋白，其参与血流中的甲状腺激素和结合至视黄醇结合蛋白4(RET4)的视黄醇的运输(Ingenbleek&Bernstein，2015)。已知视黄醇(维生素A)对上皮细胞分化和增殖是不可缺少的(Thomas等.，2004)。
此蛋白具有如下氨基酸序列(即，SEQ ID No 141；灰框指示如进一步描述的通过胰蛋白酶消化回肠样品而获得的肽，并代表可以在粪便或者肠道内容物样品中定量到的蛋白片段的非限制性实例)：
本发明进一步涉及如上所述的方法，其中，当与在健康对照动物的粪便和/或肠道内容物样品中发现的水平相比时，存在于所述粪便或者肠道内容物样品中的选自由以下各项组成的组中的蛋白的提高的水平，为肠道健康不良的指示：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，α-辅肌动蛋白-4，组蛋白H2A-IV和视黄醇结合蛋白4。术语“与在健康对照动物中发现的水平相比，蛋白的提高的水平”是指与在健康对照动物中发现的水平相比，至少提高2倍，如提高2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍...。
本发明进一步地涉及如上所述的方法，其中，当与健康对照动物的粪便和/或肠道内容物样品中发现的水平相比时，存在于所述粪便或者肠道内容物样品中的氨肽酶Ey，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区和组织蛋白酶D的蛋白的下降的水平，为肠道健康不良的指示。术语“与在健康对照动物中发现的水平相比，蛋白的下降的水平”是指与在健康对照动物中发现的水平相比，至少下降2倍，如下降2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍...。
本发明因此涉及如上所述的方法，其中，所述蛋白丰度在健康和受攻击的组之间有显著差异，和/或蛋白的水平与肠道健康相关，如通过测量所述鸟的十二指肠的绒毛长度，和/或，通过测量在所述鸟的十二指肠中的绒毛与隐窝比，和/或通过测量在所述绒毛中的T-淋巴细胞浸润，和/或，通过对所述鸟的宏观肠道外观进行评分而确定。显然，所述肠道健康为针对/与所述鸟的性能参数的如体重和饲料转化比相关的衡量。
本发明进一步地涉及如上所述的方法，其中，所述肠道内容物样品为结肠道内容物样品，且其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]和α-辅肌动蛋白-4。
本发明进一步地涉及如上所述的方法，其中，所述肠道内容物样品为回肠道内容物样品，且其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，载脂蛋白A-1，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，组蛋白H2A-IV，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区，组织蛋白酶D和视黄醇结合蛋白4。
更具体而言，本发明涉及如上所述的方法，其中，所述脊髓蛋白1的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：APFSGELSGPVK(SEQ ID No 10)，APFSGQLSGPIR(SEQ ID No 11)，FSGELSGPVK(SEQ ID No 12)，HGQIQK(SEQ ID No 13)，SDPTSNLER(SEQ ID No 14)，SGELSGPVK(SEQ ID No 15)，SGQLSGPIR(SEQ ID No 16)，VFPGIISHI(SEQ ID No 17)，VFPGIVSH(SEQ ID No 18)，VFPGIVSHI(SEQ ID No 19)；其中，所述纤连蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ATITGYK(SEQ ID No 20)，DDQESIPISK(SEQ ID No 21)；其中，所述膜联蛋白A5的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：KAMKGMGTDEETILK(SEQ ID No22)，LLLAVVK(SEQ ID No 23)，VDEALVEK(SEQ ID No 24)；其中，所述核仁磷酸蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：IGNASTK(SEQ ID No 25)，TPDSK(SEQ ID No 26)，TVTLGAGAK(SEQ ID No 27)，VVLASLK(SEQ ID No 28)；其中，所述碳酸酐酶2的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：VGNAKPEIQK(SEQ ID No 29)，VVDALNSIQTK(SEQ ID No 30)；其中，所述氨肽酶Ey的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ADNQDIGFGSGTR(SEQ ID No31)，AIAEGQGEYALEK(SEQ ID No 32)，APVVSEADK(SEQ ID No 33)，AQIIDDAFNLAR(SEQ IDNo 34)，AVFTVTMIHPS(SEQ ID No 35)，AWDFIR(SEQ ID No 36)，DFIWER(SEQ ID No 37)，DFLTEDVFK(SEQ ID No 38)，DHLQEAVNK(SEQ ID No 39)，DLWDHLQEAVNK(SEQ ID No 40)，DNAYSSIGNK(SEQ ID No 41)，EAPVVSEADK(SEQ ID No 42)，EGQGEYALEK(SEQ ID No 43)，ENSLLYDNAYSSIGNK(SEQ ID No44)，EQALER(SEQ ID No 45)，FLEAPVVSEADK(SEQ ID No46)，FLEAPVVSEADKLR(SEQ ID No 47)，FNTEFELK(SEQ ID No 48)，GADSAETWDIK(SEQ ID No49)，HYNTAYPLPK(SEQ ID No 50)，IAEGQGEYALEK(SEQ ID No 51)，ILSFFER(SEQ ID No52)，IWGRPAAIAE(SEQ ID No 53)，IWGRPAAIAEGQGEY(SEQ ID No 54)，IWGRPAAIAEGQGEYALEK(SEQ ID No 55)，KQDATSTIN(SEQ ID No 56)，KQDATSTINSIASNVVGQPL(SEQ ID No 57)，KQDATSINSIASNVVGQPLA(SEQ ID No 58)，LAGPLQQGQHYR(SEQ ID No 59)，LEAPVVSEADK(SEQ ID No 60)，LPTALKPESYEVTLQPF(SEQ IDNo 61)，MLSDFLTEDVFK(SEQ ID No 62)，NSVPLPDSIGAIMDR(SEQ ID No 63)，PAAIAEGQGEYALEK(SEQ ID No 64)，QAIPVINR(SEQ ID No 65)，QDATSTINSIASNVVGQPL(SEQID No 66)，QNVSNNPIAPNLR(SEQ ID No 67)，SDFLTEDVFK(SEQ ID No 68)，SDQVGLPDFNAGAMENWG(SEQ ID No 69)，SEVFDSIAYSK(SEQ ID No 70)，SLLYDNAYSSIGNK(SEQID No 71)，SNNHQAIPVINR(SEQ ID No 72)，SVPLPDSIGAIMDR(SEQ ID No 73)，TDLWDHLQEAVNK(SEQ ID No 74)，TGELADDLAGFYR(SEQ ID No 75)，TGPILSFFER(SEQ ID No76)，TIDPTK(SEQ ID No 77)，TLFGQYGGGSFSFSR(SEQ ID No 78)，TNINWVK(SEQ ID No 79)，VNYNQENWDQLL(SEQ ID No 80)，VNYQENWDQLLQ(SEQ ID No 81)，VNYQENWDQLLQQ(SEQ ID No82)，VVATTQMQAPDAR(SEQ ID No 83)，WRLPTAL(SEQ ID No 84)，WRLPTALKPES(SEQ ID No85)，WRLPTALKPESYEVTLQPF(SEQ ID No 86)，YDNAYSSIGNK(SEQ ID No 87)，YLQYTIDPTK(SEQ ID No 88)，YPLPK(SEQ ID No 89)；其中，所述转甲状腺素蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：AADGTWQDFATGK(SEQ ID No 90)，CPLMVK(SEQ ID No 91)，DGTWQDFATGK(SEQ ID No 92)，DVVFTANDSGHR(SEQ ID No 93)，GLGLSPFH(SEQ ID No 94)，GLGLSPFHEY(SEQ ID No 95)，GLGLSPFHEYA(SEQ ID No 96)，GLGLSPFHEYADVVF(SEQ ID No97)，GLGLSPFHEYADVVFTANDSGHR(SEQ ID No 98)，GSPAANVAVK(SEQ ID No 99)，GSPAANVAVKV(SEQ ID No 100)，GTWQDFATGK(SEQ ID No 101)，HYTIAALL(SEQ ID No 102)，HYTIAALLSPF(SEQ ID No 103)，HYTIAALLSPFS(SEQ ID No 104)，TTEEQFVEGVYR(SEQ ID No105)，TTEFGEIHEL(SEQ ID No 106)，TTEFGEIHELTTEEQ(SEQ ID No 107)，TTEFGEIHELTTEEQFVEGV(SEQ ID No 108)，TTEFGEIHELTTEEQFVEGVYR(SEQ ID No 109)，TTEFGEIHELTTEEQFVEGVYRVEFDTSSYWK(SEQ ID No 110)，VEFDTSSYWK(SEQ ID No 111)，VLDAVR(SEQ ID No 112)；其中，所述卵抑制剂的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：EHGANVEK(SEQ ID No 113)，TLNLVSMAAC(SEQ ID No 114)，TLVACPR(SEQ ID No 115)；其中，所述载脂蛋白A-1的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DLEEVKEK(SEQ ID No116)，EMWLK(SEQ ID No 117)，IRDMVDV(SEQ ID No 118)，IRPFLDQF(SEQ ID No 119)，IRPFLDQFSAK(SEQ ID No 120)，LADNLDTLSAAAAK(SEQ ID No 121)，LISFLDELQK(SEQ ID No122)，LSQKLEEI(SEQ ID No 123)，LTPVAEEAR(SEQ ID No 124)，LTPVAQELK(SEQ ID No125)，LTPYAENLK(SEQ ID No 126)，MTPLVQEFR(SEQ ID No 127)，QKLSQK(SEQ ID No 128)，QLDLK(SEQ ID No 129)，YKEVR(SEQ ID No 130)；其中，所述血红蛋白亚单位β的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：KVLTSFGDAV(SEQ ID No 142)，LHVDPENF(SEQ ID No 143)，LLIVYPWTQR(SEQ ID No 144)，NLDNIK(SEQ ID No 145)，VLTSFGDAVK(SEQ ID No 146)；其中，所述超氧化物歧化酶[Cu-Zn]的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：AVCVMK(SEQID No 147)，FQQQGSGPVK(SEQ ID No 148)，GDAPVEGVIHFQQQGSGPVK(SEQ ID No 149)，GGVAEVEI(SEQ ID No 150)，GGVAEVEIEDSVISLTGPH(SEQ ID No 151)，GVIGIAK(SEQ ID No152)，HVGDLGNVTA(SEQ ID No 153)，HVGDLGNVTAK(SEQ ID No 154)，ITGLSDGDHGFHVH(SEQID No 155)，LACGVIGIAK(SEQ ID No 156)，LTGNAGPR(SEQ ID No 157)，SDDLGR(SEQ ID No158)，SDDLGRGGDNESK(SEQ ID No 159)，TMVVHA(SEQ ID No 160)；其中，所述α-辅肌动蛋白-4的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DAEDIVNTARDPEK(SEQ ID No 161)，TIPWLEDR(SEQ ID No 162)；其中，所述血管紧张素转换酶的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：AALPEDELKEYNTLLSDMETTYSVAK(SEQ ID No 163)，ALYNK(SEQ ID No 164)，DGANPGFHEAIGDV(SEQ ID No 165)，DGANPGFHEAIGDVMA(SEQ ID No 166)，DGANPGFHEAIGDVMAL(SEQ ID No 167)，DYNELLFAWK(SEQ ID No 168)，ETPTFEEDLER(SEQ IDNo 169)，EVMLEK(SEQ ID No 170)，FEESDR(SEQ ID No 171)，FFTSLGLIPMPQEFWDK(SEQ IDNo 172)，GGANPGFHEAIGDVLS(SEQ ID No 173)，GLIPMPQEFWDK(SEQ ID No 174)，GLLEMPPEFWEK(SEQ ID No 175)，GPIPAHL(SEQ ID No 176)，GPIPAHLLGNMW(SEQ ID No177)，GPIPAHLLGNMWAQQ(SEQ ID No 178)，GPIPAHLLGNMWAQS(SEQ ID No 179)，GYLIDQWR(SEQ ID No 180)，IIGSIQTLGPSNLPLDK(SEQ ID No 181)，IIGSIQTLGPSNLPLDKR(SEQ ID No182)，IKEDEYNQQWWNL(SEQ ID No 183)，IYSTAK(SEQ ID No 184)，KIIGSIQTLGPSNLPLDK(SEQ ID No 185)，LLGDAMK(SEQ ID No 186)，LLYAWEGWHNAAGNPLR(SEQ ID No 187)，LSVLER(SEQ ID No 188)，MSIALDK(SEQ ID No 189)，NTILSDMDK(SEQ ID No 190)，QCTVVNMDDLITVH(SEQ ID No 191)，QFDPSDFQDETVTR(SEQ ID No 192)，QQGWTPK(SEQ ID No193)，QQYNTILSDMDK(SEQ ID No 194)，RYVELSNK(SEQ ID No 195)，SLGLIPMPQEFWDK(SEQID No 196)，SLSVSTPSHLQK(SEQ ID No 197)，SLYETPTFEEDLER(SEQ ID No 198)，SMIEKPADGR(SEQ ID No 199)，SNIFDLVMPFPDATK(SEQ ID No 200)，SVSTPK(SEQ ID No201)，SVSTPSHLQK(SEQ ID No 202)，TLGPSNLPLDK(SEQ ID No 203)，TNEVLGWPEFDWRSPIPEGYPEGIDK(SEQ ID No 204)，TSLGLIPMPQEFWDK(SEQ ID No 205)，TSLGLLEMPPEFWEK(SEQ ID No 206)，VDATPAMK(SEQ ID No 207)，VELSNK(SEQ ID No 208)，YGAEHISLK(SEQ ID No 209)，YHIPGNTPY(SEQ ID No 210)，YINLK(SEQ ID No 211)，YNELLFAWK(SEQ ID No 212)，YQGLCPPVPR(SEQ ID No 213)，YVELSNK(SEQ ID No 214)；其中，所述含WD重复序列的蛋白质1的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：IIGGDPK(SEQID No 215)，KVFASLPQVERGVSK(SEQ ID No 216)，VINSVDIK(SEQ ID No 217)；其中，所述线粒体天冬氨酸转氨酶的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：GPPDPILGVTEAFK(SEQ IDNo 218)，LLLSAPR(SEQ ID No 219)，MDKEYLPI(SEQ ID No 220)，MGLYGER(SEQ ID No221)，NPTGVDPR(SEQ ID No 222)，TQLVSNLK(SEQ ID No 223)；其中，所述组蛋白H2A-IV的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：NDEELNK(SEQ ID No 224)，VTIAQGGVLPNIQAAVLLPK(SEQ ID No 225)；其中，所述免疫球蛋白λ链C区的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DFYPSPVTVDWVIDGSTR(SEQ ID No 226)，ITLFPPSK(SEQ ID No227)，NDFYPSPVTVDWVIDGSTR(SEQ ID No 228)，SGETTAPQR(SEQ ID No 229)，THNGTSITK(SEQ ID No 230)，TVDWVIDGSTR(SEQ ID No 231)，VAPTITLFPPSK(SEQ ID No 232)，VAPTITLFPPSKEELN(SEQ ID No 233)，VAPTITLFPPSKEELNEAT(SEQ ID No 234)，VAPTITLFPPSKEELNEATK(SEQ ID No 235)，VTHNGTSITK(SEQ ID No 236)；其中，所述免疫球蛋白λ链V1区的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ALTQPSSVSANPGETVK(SEQ ID No237)，APGSAPVTLIYDNTNRPSNIPSR(SEQ ID No 238)，GSAPVTLIYDNTNRPSNIPSR(SEQ ID No239)，ITCSGDR(SEQ ID No 240)，NPGETVK(SEQ ID No 241)，PSNIPSR(SEQ ID No 242)，RPSNIPSR(SEQ ID No 243)，SANPGETVK(SEQ ID No 244)，SVSANPGETVK(SEQ ID No 245)，YGWYQQK(SEQ ID No 246)；其中，所述组织蛋白酶D的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DPTAQPGGELLLGGTDPK(SEQ ID No 247)，ELQTAIGAKPL(SEQ ID No 248)，ELQTAIGAKPLI(SEQ ID No 249)，FDGILGMAFPR(SEQ ID No 250)，IPLTK(SEQ ID No 251)，QPGGELLLGGTDPK(SEQ ID No 252)，VTPFFDNVMQQK(SEQ ID No 253)；其中，所述视黄醇结合蛋白4的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：QIDLCLDR(SEQ ID No 254)，TVDENGQMSAIAK(SEQ ID No 255)。
此外，本发明涉及如上所述的方法，其中，所述驯养的鸟为肉鸡。术语“肉鸡”指专门用于产肉而繁殖和养育的任何鸡(Gallus gallus domesticus)。
再者，本发明涉及如上所述的方法，其中蛋白质或其片段通过使用与所述蛋白质或其片段特异性结合的抗体而定量。
术语“特异性(或选择性)结合(或检测)”蛋白或肽而言，当指抗体时，指在蛋白质和其他生物制品的异质性群体中，决定蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，指定的抗体以至少两倍于背景地与特定的蛋白结合，且基本上不以显著量结合存在于该样品中的其他蛋白质。在该种条件下与抗体特异性结合可需要针对其对于特定的蛋白的特异性而被选择的抗体。可以使用多种免疫分析形式来选择与特定的蛋白具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规使用于选择与蛋白可特异性免疫反应的抗体(见，例如，Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，关于免疫分析形式的描述，和能够用于确定特异性免疫反应性的条件)。通常特异性或者选择性反应将会为至少两倍于背景信号或者噪音，更通常多于背景的10至100倍。“免疫分析”为使用与抗原(例如，标志物)特异性结合的抗体的分析。免疫分析的特点在于，通过使用特定的抗体的特异性结合特性来对抗原进行分离，靶向和/或定量。
此外，本发明涉及如上所述的方法，其中，所述抗体为酶联免疫吸附测定的一部分。
将会通过如下非限制性实例进一步地说明本发明。
实施例
缩略语列表
材料和方法
研究设计
从当地孵化场获得总计360日龄的肉鸡(Ross 308)，并养在层栏(floor pens)的木制刨花上。在整个研究过程中任意提供喂食和饮水。肉鸡被随机指派给对照和攻击组这两种处理组(每种处理9栏，每栏20只肉鸡)。所有的动物喂商业饲料，直到第12天将饲料换成基于小麦(57.5％)的补充有5％黑麦的饮食(表1)。从第12天到18天，攻击组的所有动物经由饮水每天接受每kg体重的10mg氟苯尼考和10mg恩诺沙星，以诱导肠道微生物群落的实质变化。在抗生素处理后，从第19天到21天，每天通过口服填喂给予由大肠杆菌(Escherichia coli)(G.78.71)，粪便肠球菌(Enterococcus faecalis)(G.78.62)，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)(LMG22873)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)(LMG49479)，产气荚膜梭菌(netB-)(D.39.61)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)(LMG27713)组成的1ml的细菌混合物。如下制备细菌的培养物。使用溶原性肉汤(LB，Oxoid，)用于E.coli生长。粪便肠球菌和产气荚膜梭菌在脑心浸液(BHI，Sigma)肉汤中生长。使用Man-Rogosa-Sharpe(MRS，Oxoid)培养基用于卷曲乳杆菌(L.crispatus)和唾液乳杆菌(L.salivarius)的生长。用于活泼瘤胃球菌的生长，使用了如由Miyazaki等.(1997)描述的厌氧M2GSC培养基(pH 6)，但其中的30％使用了15％的澄清瘤胃液代替，并在添加高压灭菌后的1mg/ml盐酸半胱氨酸和4mg/ml NaHCO3。E.coli和粪便肠球菌在有氧条件下在37℃培养。在有氧(5％O2)培养箱中培养了乳酸菌属(Lactobacillus spp.)。产气荚膜梭菌和活泼瘤胃球菌在厌氧室(气体混合物84％N2，8％O2en 8％H2，GP[concept]，Jacomex，France)中在37℃培养。细菌细胞通过超速离心法(10 000rpm，10min，20℃)收集，每一小球重悬在100ml无氧的磷酸盐缓冲盐水(PBS，1mg/ml盐酸半胱氨酸，pH 6)中。重悬的小球用无氧的PBS混合并稀释至总体积1.5l以达到每一菌株的终浓度为约109菌落形成单位(CFU)/ml(表2)。在第20天，对动物施用由不同爱美尔球虫属(Eimeria sp.)组成的球虫攻击，亦即60.000个卵囊的堆型艾美尔球虫(E.acervulina)和30.000个卵囊的巨型艾美尔球虫(E.maxima)。
在第26天，对鸟量体重，每栏3只鸟被安乐死。取样十二指肠环用于组织学检查，从回肠和结肠收集内容物用于蛋白提取。
表1|小麦/黑麦为基础的肉鸡饮食的组成和营养含量。起始饮食给予到第11天。生长饮食从第12天给予到第34天。
表2|肉鸡在第19，20和21天口服灌输1ml的细菌混合物，所述混合物具有106-1010CFU的大肠杆菌，粪便肠球菌，唾液乳杆菌，卷曲乳杆菌，产气荚膜梭菌(netB-)和活泼瘤胃球菌
宏观评分***
宏观外观肠使用之前描述的评分***(Teirlynck等.，2011)评价，其中共计评估了10个参数，并分配为0(不存在)或者1(存在)，结果总评分在0和10之间。总评分0表示肠管的正常外观，而10指向与正常外观相比，严重偏离。参数为(1)肠的“鼓胀”；(2)炎症，Meckel憩室头部(cranial to the Meckel’s diverticulum)；(3)宏观可见的，可触知的脆弱的Meckel憩室小肠头部；(4)在切开3秒后，Meckel憩室的肠道头部以纵向切开失去张力；(5)肠道内容物在Meckel憩室头部的异常发生(过多的粘液、橙色内容物、气体)；(6，7，8，9)与(2，3，4，5)相同，但位于Meckel憩室的尾部，且(10)在结肠中存在未消化的颗粒。如Johnson&Reid(1970)描述的进行了球虫病评分，其中动物被给予与堆型艾美球虫，巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫相关的典型病变的分数。对每一项给予在0(不存在)和4(严重)之间的评分。总球虫病评分以对由每个体艾美球虫属引起的病变给予的得分的总和计算。
形态学参数
将十二指肠环在4％甲醛中固定24小时，在二甲苯中脱水并包埋在石蜡中。使用超薄切片机(Microme HM360，Thermo Scientific)切4μm的切片，并如De Maesschalck等.(2015)描述的那样进行加工。形态学参数使用标准光显微镜确定。十二指肠中的绒毛长度和隐窝深度使用徕卡DM LB2 Digital和基于计算机的图像分析程序，LAS V4.1(徕卡应用套件V4 (Leica Application Suite V4)，德国)，通过对每个肠道段的12个绒毛的随机测量而测量。也计算了绒毛与隐窝比。
免疫组织化学检查
利用高压锅对4μm切片在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH6)中进行抗原复性。载玻片用洗涤缓冲液(Dako kit，K4011)洗涤，并用过氧化物酶试剂(Dako，S2023)封闭5分钟。载玻片用蒸馏水和Dako洗涤缓冲液洗涤后，用在抗体稀释剂(Dako，S3022)中1∶100稀释的抗CD3一抗(Dako CD3，A0452)在室温温育30分钟。再次用洗涤缓冲液漂洗后，载玻片用已标记的聚合物-HR抗兔(Envision+System-HRP，K4011)室温温育30分钟。载玻片用洗涤缓冲液洗涤2次后，添加二-氨基-联苯胺(DAB+)底物和DAB+发色团(Dako kit，K4011)持续5分钟。载玻片用Aquadest洗涤以停止染色，使用Shandon Varistain-Gemini自动玻片染色机(AutomatedSlide Stainer)脱水，并用苏木精复染10秒。载玻片用徕卡DM LB2 Digital和基于计算机的图像分析程序LAS V4.1(徕卡应用套件V4，德国)进行分析以测量在每个切片大约10个绒毛中在总计3mm2的区域中的CD3阳性区域，CD3阳性区域表示T-淋巴细胞浸润。
发现蛋白质组学
样品制备
收集个体结肠和回肠内容物样品并在使用前储存在-20℃。取500mg，使其溶解在10ml 2M尿素，50mM铵碳酸氢盐中并通过涡流而匀浆。在离心(20.000xg，15min，4℃)后，上清直接在具有5kDa MWCO滤器(Sartorius，德国)的Vivaspin 20中过滤通过0,22μm滤器单元(Merck，德国)，并在4000xg离心1h。滤器用1ml 2M尿素，50mM铵碳酸氢盐洗涤3次，接着进行离心(4000xg，10min，4℃)。样品用1ml 500mM三乙基碳酸氢铵(TEABC，Sigma)洗涤3次来除去尿素。随后，样品被浓缩至±500μl的体积。为了确定蛋白浓度，进行了Bradford分析，其中在595nm测量OD值。将大约50μg的蛋白质用1mM二硫苏糖醇(DTT)还原并在60℃温育30min，接着用用10mM甲基硫代磺酸酯(methanethiosulfonate)(MMTS)在室温烷基化10min。此后，添加氯化钙和乙腈，至终浓度分别为1mM和5％(v/v)。最后以1∶20(胰蛋白酶∶蛋白)比例添加胰蛋白酶，在37℃过夜消化。将样品真空干燥并用高效液相色谱法-质谱法(HPLC-MS)分析。
HPLC-MS
将肽溶解在HPLC级水中的0.1％甲酸中(缓冲液A)使得终浓度为1μg/μL。每一样品中添加100fmol的mass prep digestion standard 2(MPDS2)。数据依赖性采集技术MS分析在TripleTOF 5600(Sciex)上进行，TripleTOF 5600(Sciex)配备了在阳离子模式的DuoSpray离子源，并与Eksigent NanoLC 400HPLC***(Sciex)耦合。肽在microLC YMCTriart C18柱(id 300μm，长度15cm，粒径3μm)上，通过捕集-洗脱(trap-elute)注射(YMCTriart C18保护柱，id 500μm，长度5mm，粒径3μm)以5μL/min的流速进行分离。洗脱使用4-40％的缓冲液B(0.1％甲酸，5％DMSO在80％ACN中)梯度，历时90min进行。离子源参数设置为离子喷雾电压为5.5kV，气帘气为30psi，雾化气为13psi，温度为80℃。
对于DDA，在整个梯度过程中，2.25s的仪器循环在高灵敏度模式中重复进行，包含具有0.2s的累积时间的全扫描MS光谱(300-1250m/z)，接着进行20个具有0.2s的积累时间的MS/MS试验(50-1800m/z)，MS前驱波具备充电状态2至5+超过500cps阈值。滚动碰撞能量(Rolling collision energy)按生产商的建议使用，且排除10s的前目标离子。
数据库检索
将在LC-MS/MS分析期间生成的*.wiff文件导入用于蛋白质组学软件的Progenesis QI(非线性动力学)。基于保留时间和重现特征的m/z而将不同样品进行排列，从而能够进行相对定量。在随后的峰值选取后，从软件导出合并的*.mgf文件，并用MASCOTDaemon(Matrix Science，版本2.5.1)针对鸡数据库(参阅从Swissprot，January 2016下载的蛋白数据库)辅以cRAP数据库(laboratory proteins and dust/contact proteins，http：//www.thegpm.org/crap/)和内标而检索所述合并的*.mgf文件用于鉴定。最大肽质量误差和片段质量误差分别设为10ppm和0.1Da。此外，在半胱氨酸上的甲硫基被设为固定修饰，天冬酰胺和/或谷氨酰胺的脱酰胺和甲硫胺酸的氧化被设为可变修饰。酶的特异性被设为具有最大错过一次切割的胰蛋白酶。鉴定结果从MASCOT Daemon导出，错误发现率为5％(*.xml格式)，并导入用于蛋白质组学的Progenesis QI。
统计分析
统计学分析用Graphpad Prism(v.5)进行。为了评价数据是否为正态分布，进行了Kolmogorov-Smirnov检验。如果为正态分布的情况，数据的比较用独立样本t检验进行。否则，进行非参数Mann-Whitney检验。将p值＜0.05作为有统计显著性。不同参数之间的统计学一致性通过相关性分析进行评价。
结果
性能参数
在不同时间期期间测量了体重(BW)，日增重(DWG)，每日采食量(DFI)和饲料转化比(FCR)。在第26天，35和41天在处理和对照组之间观察到显著差异，但在12天龄并没有(表3)。
表3|对于对照和攻击组在期间不同时间期测量的体重(BW)，日增重(DWG)，每日采食量(DFI)和饲料转化比(FCR)的平均标准偏差。显著性差异(p＜0.05)以粗体显示。
宏观评分
每个处理对27只鸟给予肠的外观和球虫病评分。在第26天(p＝0.0001)对于接受了攻击处理的肉鸡观察到更低体重。在第26天，对肠宏观外观评分和总球虫病评分在攻击组中更高(p＜0.001)(图1，表4)。
表4|在第26天对于对照(n＝27)和攻击组(n＝27)的体重(BW)，宏观肠道外观评分(MGAS)和球虫病评分(CS)的平均标准偏差。显著性差异(p＜0.05)以粗体显示。
肠道形态和免疫组织化学
在第26天，相比于对照组，在来自处理组的动物的肠中的十二指肠切片中，检测到显著更短的绒毛长度，增加的隐窝深度，更低的绒毛与隐窝比和更高的炎症水平(p＜0.0001)(表5)。
表5|在第26天对于对照(n＝27)和攻击组(n＝27)的绒毛长度(VL)，隐窝深度(CD)，绒毛与隐窝比(VL/CD)和T-淋巴细胞浸润(CD3区域％)的平均标准偏差。对于所有的评价参数，统计学显著性为p＜0.0001。
相关
Pearson r具有在-1(总负相关)和+1(总正相关)之间的值。如果是正相关的情况，随其他参数增加，一个参数增加，反之亦然。当一个参数降低且其他的参数增加时，为负相关。在第26天，所有的宏观(宏观肠外观评分，球虫病评分和体重)和组织学参数(绒毛长度，隐窝深度，绒毛与隐窝比和T-淋巴细胞浸润)相互相关(表6)。
表6|在宏观肠外观评分(MGAS)，球虫病评分(CS)，体重(BW)，绒毛长度(VL)，隐窝深度(CD)，绒毛与隐窝比(VL/CD)和T-淋巴细胞浸润(CD3区域％)之间的Pearson相关系数。示出了具有p＜0.05统计学显著性的相关系数。
发现蛋白质组学1。
用MASCOT Daemon(Matrix Science，版本2.5.1)针对鸡数据库(参阅从Swissprot，2016年1月下载的蛋白数据库)辅以cRAP数据库(实验室蛋白和灰尘/接触蛋白(dust/contact protein)http：//www.thegpm.org/crap/)，针对结肠鉴定了157种蛋白。理论上，良好的肠道健康生物标志物应该和一种或多种组织学参数有关，因为在肠道健康的评价中，绒毛长度和炎症水平的测量被用作标准测量。也评价了与宏观肠外观评分的相关性。值得注意的是，对于其结肠浓度与绒毛长度为负相关的蛋白质，观察到与隐窝深度，CD3区域％和宏观肠道外观评分为反相关。仅示出了具有p＜0.1的统计学显著性的相关(表7)。
表7|在第26天在结肠内容物中的蛋白丰度和绒毛长度(VL)，隐窝深度(CD)，绒毛与隐窝比(VL/CD)和T-淋巴细胞浸润(CD3区域％)和宏观肠道外观评分(MGAS)之间的Pearson相关系数。示出了具有p＜0.1统计学显著性的相关系数。
发现蛋白质组学2
用MASCOT Daemon(Matrix Science，版本2.5.1)针对鸡数据库(参阅从Swissprot，2016年1月下载的蛋白数据库)辅以cRAP数据库(laboratory proteins anddust/contact protein http：//www.thegpm.org/crap/)，针对结肠和回肠分别鉴定了157个和181种蛋白质，据此选取了在对照和受攻击的鸟之间的显著差异蛋白质(p＜0.05)。在来自攻击组的肉鸡中，与对照动物相比以下蛋白质在结肠内容物中显示显著更高的丰度(p＜0.05)：α-辅肌动蛋白-4(ACTN4)，膜联蛋白A5(ANXA5)，载脂蛋白A-1(APOA1)，纤连蛋白(FINC)，血红蛋白亚单位β(HBB)，脊髓蛋白1(MIM1)，核仁磷酸蛋白(NPM)，卵抑制剂(IOV7)和转甲状腺素蛋白(TTR)。与对照动物相比，在结肠和回肠内容物两者中，超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD)显示了下降的丰度(p＜0.05)。在回肠样品中，在受攻击的鸟中，血管紧张素转化酶(ACE)，线粒体天冬氨酸转氨酶(AATM)，组织蛋白酶D(CATD)，Igλ链C区(LAC)，Igλ链V-1区(LV1)，TTR和含WD重复序列的蛋白质1(WDR1)显示了更低的丰度(p＜0.05)。如下蛋白质的丰度较高(p＜0.05)：APOA1，组蛋白H2A-IV(H2A4)和视黄醇结合蛋白4(RET4)(表8和表9)。
表8：在对照和攻击组之间，在结肠内容物中显著不同的蛋白质。
在第26天，对来自对照(n＝9)和受攻击的(n＝9)组的动物结肠内容物使用高效液相色谱法-质谱法(HPLC-MS)进行蛋白质组学。这导致了在受攻击的鸟中显著差异的蛋白质(p＜0.05)，其中9中蛋白质具有更高的归一化丰度，并且超氧化物歧化酶[Cu-Zn]降低。
表9：在对照和攻击组之间，在回肠内容物中显著不同的蛋白质。
在第26天，对来自对照(n＝9)和受攻击的(n＝9)组的动物回肠内容物使用高效液相色谱法-质谱法(HPLC-MS)进行蛋白质组学。这导致在受攻击的鸟中12中显著差异的蛋白质(p＜0.05)，其中载脂蛋白A-1(APOA1)，组蛋白H2A-IV(H2A4)和视黄醇结合蛋白4(RET4)具有更高的归一化丰度，并且其他9中蛋白质的归一化丰度降低。
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Claims (12)
1.确定驯养的鸟的肠道健康状态的方法，所述方法包括：
-提供从所述驯养的鸟获得的粪便样品或肠道内容物样品，和
-对所述样品中的蛋白或其片段进行定量，
其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，α-辅肌动蛋白-4，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，组蛋白H2A-IV，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区，组织蛋白酶D和视黄醇结合蛋白4。
2.确定驯养的鸟的肠道健康状态的方法，所述方法包括：
-提供从所述驯养的鸟获得的粪便样品或肠道内容物样品；和
-对所述样品中的蛋白或其片段进行定量，
其中，所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂和载脂蛋白A-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，当与健康对照动物的粪便或者肠道内容物样品中发现的水平相比时，存在于所述粪便或者肠道内容物样品中的选自由以下各项组成的组中的蛋白的提高的水平，为肠道健康不良的指示：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，α-辅肌动蛋白-4，组蛋白H2A-IV和视黄醇结合蛋白4。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，当与健康对照动物的粪便或者肠道内容物样品中发现的水平相比时，存在于所述粪便或者肠道内容物样品中的氨肽酶Ey，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区和组织蛋白酶D的蛋白的下降的水平，为肠道健康不良的指示。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，蛋白的所述水平与肠道健康相关如通过测量所述鸟的十二指肠的绒毛长度，和/或通过测量在所述鸟的十二指肠中的绒毛与隐窝比，和/或通过测定在所述绒毛中的T-淋巴细胞浸润，和/或通过对所述鸟的宏观肠道外观进行评分而确定。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述肠道内容物样品为结肠内容物样品，且其中所述蛋白选自由以下各项组成的组：脊髓蛋白1，纤连蛋白，膜联蛋白A5，核仁磷酸蛋白，碳酸酐酶2，氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，卵抑制剂，载脂蛋白A-1，血红蛋白亚单位β，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]和α-辅肌动蛋白-4。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肠道内容物样品为回肠内容物样品，且其中所述蛋白选自由以下各项组成的组：氨肽酶Ey，转甲状腺素蛋白，载脂蛋白A-1，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，血管紧张素转换酶，含WD重复序列的蛋白质1，线粒体天冬氨酸转氨酶，组蛋白H2A-IV，免疫球蛋白λ链C区，免疫球蛋白λ链V-1区，组织蛋白酶D和视黄醇结合蛋白4。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述脊髓蛋白1的片段包括以下氨基酸序列中的至少一种：APFSGELSGPVK，APFSGQLSGPIR，FSGELSGPVK，HGQIQK，SDPTSNLER，SGELSGPVK，SGQLSGPIR，VFPGIISHI，VFPGIVSH，VFPGIVSHI；其中，所述纤连蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ATITGYK，DDQESIPISK；其中，所述膜联蛋白A5的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：KAMKGMGTDEETILK，LLLAVVK，VDEALVEK；其中，所述核仁磷酸蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：IGNASKTK，TPDSK，TVTLGAGAK，VVLASLK；其中，所述碳酸酐酶2的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：VGNAKPEIQK，VVDALNSIQTK；其中，所述氨肽酶Ey的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ADNQDIGFGSGTR、AIAEGQGEYALEK、APVVSEADK、AQIIDDAFNLAR、AVFTVTMIHPS、AWDFIR、DFIWER、DFLTEDVFK、DHLQEAVNK、DLWDHLQEAVNK、DNAYSSIGNK、EAPVVSEADK、EGQGEYALEK、ENSLLYDNAYSSIGNK、EQALER、FLEAPVVSEADK、FLEAPVVSEADKLR、FNTEFELK、GADSAEPTWDIK、HYNTAYPLPK、IAEGQGEYALEK、ILSFFER、IWGRPAAIAE、IWGRPAAIAEGQGEY，IWGRPAAIAEGQGEYALEK、KQDATSTIN、KQDATSTINSIASNVVGQPL、KQDATSTINSIASNVVGQPLA、LAGPLQQGQHYR、LEAPVVSEADK、LPTALKPESYEVTLQPF、MLSDFLTEDVFK、NSVPLPDSIGAIMDR、PAAIAEGQGEYALEK、QAIPVINR、QDATSTINSIASNVVGQPL、QNVSNNPIAPNLR、SDFLTEDVFK、SDQVGLPDFNAGAMENWG、SEVFDSIAYSK、SLLYDNAYSSIGNK、SNNHQAIPVINR、SVPLPDSIGAIMDR、TDLWDHLQEAVNK、TGELADDLAGFYR、TGPILSFFER、TIDPTK、TLFGQYGGGSFSFSR、TNINWVK、VNYNQENWDQLL、VNYNQENWDQLLQ、VNYNQENWDQLLQQ、VVATTQMQAPDAR、WRLPTAL、WRLPTALKPES、WRLPTALKPESYEVTLQPF、YDNAYSSIGNK、YLQYTIDPTK、YPLPK；其中，所述转甲状腺素蛋白的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：AADGTWQDFATGK、CPLMVK、DGTWQDFATGK、DVVFTANDSGHR、GLGLSPFH、GLGLSPFHEY、GLGLSPFHEYA、GLGLSPFHEYADVVF、GLGLSPFHEYADVVFTANDSGHR、GSPAANVAVK、GSPAANVAVKV、GTWQDFATGK、HYTIAALL、HYTIAALLSPF、HYTIAALLSPFS、TTEEQFVEGVYR、TTEFGEIHEL、TTEFGEIHELTTEEQ、TTEFGEIHELTTEEQFVEGV、TTEFGEIHELTTEEQFVEGVYR、TTEFGEIHELTTEEQFVEGVYRVEFDTSSYWK、VEFDTSSYWK、VLDAVR；其中，所述卵抑制剂的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：EHGANVEK、TLNLVSMAAC、TLVACPR；其中，所述载脂蛋白A-1的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DLEEVKEK、EMWLK、IRDMVDV、IRPFLDQF、IRPFLDQFSAK、LADNLDTLSAAAAK、LISFLDELQK、LSQKLEEI、LTPVAEEAR、LTPVAQELK、LTPYAENLK、MTPLVQEFR、QKLSQK、QLDLK、YKEVR；其中，所述血红蛋白亚单位β的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：KVLTSFGDAV、LHVDPENF、LLIVYPWTQR、NLDNIK、VLTSFGDAVK；其中，所述超氧化物歧化酶的片段包括以下氨基酸序列中的至少一种：AVCVMK，FQQQGSGPVK、GDAPVEGVIHFQQQGSGPVK、GGVAEVEI、GGVAEVEIEDSVISLTGPH、GVIGIAK、HVGDLGNVTA、HVGDLGNVTAK、ITGLSDGDHGFHVH、LACGVIGIAK、LTGNAGPR、SDDLGR、SDDLGRGGDNESK、TMVVHA；其中，所述α-辅肌动蛋白-4的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DAEDIVNTARDPEK、TIPWLEDR；其中，所述血管紧张素转换酶的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：
9.AALPEDELKEYNTLLSDMETTYSVAK、ALYNK、DGANPGFHEAIGDV、DGANPGFHEAIGDVMA、DGANPGFHEAIGDVMAL、DYNELLFAWK、ETPTFEEDLER、EVMLEK、FEESDR、FFTSLGLIPMPQEFWDK、GGANPGFHEAIGDVLS、GLIPMPQEFWDK、GLLEMPPEFWEK、GPIPAHL、GPIPAHLLGNMW、GPIPAHLLGNMWAQQ、GPIPAHLLGNMWAQS、GYLIDQWR、IIGSIQTLGPSNLPLDK、IIGSIQTLGPSNLPLDKR、IKEDEYNQQWWNL、IYSTAK、KIIGSIQTLGPSNLPLDK、LLGDAMK、LLYAWEGWHNAAGNPLR、LSVLER、MSIALDK、NTILSDMDK、QCTVVNMDDLITVH、QFDPSDFQDETVTR、QQGWTPK、QQYNTILSDMDK、RYVELSNK、SLGLIPMPQEFWDK、SLSVSTPSHLQK、SLYETPTFEEDLER、SMIEKPADGR、SNIFDLVMPFPDATK、SVSTPK、SVSTPSHLQK、TLGPSNLPLDK、TNEVLGWPEFDWRSPIPEGYPEGIDK、TSLGLIPMPQEFWDK、TSLGLLEMPPEFWEK、VDArPAMK、VELSNK、YGAEHISLK、YHIPGNTPY、YINLK、YNELLFAWK、YQGLCPPVPR、YVELSNK；其中，所述含WD重复序列的蛋白质1的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：IIGGDPK，KVFASLPQVERGVSK，VINSVDIK，；其中，所述线粒体天冬氨酸转氨的片段酶包含以下氨基酸序列中的至少一种：GPPDPILGVTEAFK，LLLSAPR，MDKEYLPI，MGLYGER，NPTGVDPR，TQLVSNLK；其中，所述组蛋白H2A-IV的片段包括以下氨基酸序列中的至少一种：NDEELNK，VTIAQGGVLPNIQAAVLLPK；其中，所述免疫球蛋白λ链C区的片段包括以下氨基酸序列中的至少一种：DFYPSPVTVDWVIDGSTR、ITLFPPSK、NDFYPSPVTVDWVIDGSTR、SGETTAPQR、THNGTSTTK、TVDWVIDGSTR、VAPTTTLFPPSK、VAPTITLFPPSKEELN、VAPTITLFPPSKEELNEAT、VAPTITLFPPSKEELNEATK、VTHNGTSITK；其中，所述免疫球蛋白λ链V1区的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：ALTQPSSVSANPGETVK、APGSAPVTLIYDNTNRPSNIPSR、GSAPVTLIYDNTNRPSNIPSR、ITCSGDR、NPGETVK、PSNIPSR、RPSNIPSR、SANPGETVK、SVSANPGETVK、YGWYQQK；其中，所述组织蛋白酶D的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：DPTAQPGGELLLGGTDPK、ELQTAIGAKPL、ELQTAIGAKPLI、FDGILGMAFPR、IPLTK、QPGGELLLGGTDPK、VTPFFDNVMQQK；其中，所述视黄醇结合蛋白4的片段包含以下氨基酸序列中的至少一种：QIDLCLDR、TVDENGQMSATAK。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述驯养的鸟为肉鸡。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质或其片段通过使用与所述蛋白质或其片段特异性结合的抗体而定量。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述抗体为酶联免疫吸附测定的一部分。
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