CN112011547A

CN112011547A - 一种控制油菜叶形的主效基因及其应用

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Publication number: CN112011547A
Application number: CN202010719919.1A
Authority: CN
Inventors: 范楚川; 周永明; 胡利民; 张�浩; 申潇潇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN112011547B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控油菜叶形的主效基因及其应用。本发明所提供的控制油菜叶形的主效基因，所述主效基因为BnaA10.RCO基因或者其等位基因，其中BnaA10.RCO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明所涉及到的控制油菜叶形的主效基因，是位于油菜A10染色体上的基因，编码一个与植物叶形发育相关的HD‑ZIPI转录因子，本发明利用图位克隆基因定位和遗传转化相结合的方法分离克隆了该基因，为油菜的叶形改良育种提供了理论基础；同时也为白菜型油菜、芥菜型油菜等十字花叶植物的叶形调控研究提供了参考。

Description

一种控制油菜叶形的主效基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控油菜叶形的主效基因及其应用。

背景技术

叶片是植物最重要的器官之一，具有光合作用、蒸腾作用、营养供给和水分运输等功能，影响作物的生理特性甚至产量。叶片形态变化影响叶面温度、植物的水分利用效率和光合作用强度，是植物对环境的一种适应性表现，是通过长期的自然选择所形成的。叶片的形状和大小存在丰富的自然变异，叶片可以根据叶缘形状分为全缘、浅裂和深裂等类型。此外，一些研究也发现花叶性状也与植物的抗逆性有关。迄今为止，关于叶形的研究主要集中在拟南芥、碎米荠和番茄等模式物种中，而油菜中关于叶形基因的定位和分子调控机理研究很少。

油菜中的花叶表型在植株发育早期就能够表现出来，且表型稳定，不易受环境条件的影响，因此，花叶也成为一种理想的形态标记应用于油菜杂种的生产。目前已有的关于油菜花叶表型的应用是利用花叶显性性状为标记，进行恢复系和不育系等选育，保证杂交油菜的纯度。但是油菜中关于叶形基因的定位和分子调控机理研究很少，因此，如何更好的了解花叶叶形的形成机理，为利用叶形性状更好的进行油菜遗传改良具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制油菜叶形的主效基因及其应用。本发明所提供的主效基因能够实现油菜叶形的调控，为油菜的叶形改良育种提供理论基础。

本发明所提供的控制油菜叶形的主效基因，所述主效基因为BnaA10.RCO基因或者其等位基因，其中BnaA10.RCO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种调控油菜叶形的蛋白，所述蛋白由上述的主效基因编码。

本发明还提供了一种含有控制油菜叶形的主效基因的表达载体，其中，所述表达载体为含有上述主效基因的PMDC32载体。

本发明还提供了控制油菜叶形的主效基因、该基因编码的蛋白以及含有该基因的表达载体在调控油菜叶形中的应用。

本发明还提供了一种含有调控油菜叶形主效基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1-1，分别从HY刻裂叶和Z9浅裂叶两个材料中扩增BnaA10.RCO基因组DNA序列；

S1-2，将步骤S1中扩增后的序列用酶切连接的方法连入以CaMV35S为启动子的PMDC32载体上。

其中，步骤S1-1中扩增BnaA10.RCO基因组DNA序列所用的引物为：

A10-117F GGGCttaattaaCTACCATGGGTAAGGCTGTTGC

A10-118R GACAggtaccATGGAATGGTCAACGACGAGC

本发明还提供了一种控制油菜叶形的主效基因的克隆方法，包括以下步骤：

S2-1，将甘蓝型油菜参考基因组中BnLLA10区段注释的基因比对到拟南芥基因组中，并进行功能注释，确定候选基因；

S2-2，设计引物对HY刻裂叶和Z9浅裂叶两个材料的候选基因进行克隆，并将其cDNA和DNA的测序结果进行比较，确定候选基因在两个材料中等位基因的差异位置；

S2-3，分析候选基因在HY和Z9的近等基因系Z9-NIL中的特异表达量，并经过超表达实验和基因敲除实验，最终确定出主效基因BnaA10.RCO；

S2-4，将主效基因BnaA10.RCO连接到表达载体上并经过农杆菌介导的下胚轴转化法转入到受体细胞中，即可。

其中，步骤S2-1中确定的候选基因为BnaA10.RCO和BnaA10.LMI1。

其中，步骤S2-2中BnaA10.RCO基因克隆时所用的引物的核苷酸序列为：

A10_101F：TCTCCAAGATCCGAAACACCT

A10_101R：ATGGAATGGTCAACGACGAGC。

本发明公开了分离克隆的调控油菜叶形的主效基因BnaA10.RCO，以及它的等位基因(HY)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，在等位基因比较测序中发现两个亲本材料HY和Z9的等位基因差异主要位于基因5’调控区位置，利用qRT-PCR技术对HY及其近等基因系Z9-NIL进行表达量分析，发现在不同组织中BnaA10.RCO基因表达量在HY中明显高于近等基因系，超表达和基因敲除的转基因实验都证明BnaA10.RCO基因正调控油菜叶形。

本发明在油菜中克隆了调控油菜叶形的主效基因，为油菜的叶形改良育种提供了理论基础；同时也为白菜型油菜、芥菜型油菜等十字花叶植物的叶形调控研究提供了参考。

附图说明

图1为BnaA10.RCO的基因结构图；其中箭头所指的S1、S2中的位置即为靶点序列位置；

图2为BnaA10.RCO基因的表达量分析图；其中A为不同天数的HY和Z9-NIL的幼苗叶片中的表达量，B为10天时HY和Z9-NIL幼苗不同组织中的表达量；

图3为在J9707和HY背景下，过表达的BnaA10.RCOHY(HY OE)和BnaA10.RCOZ9(Z9OE)的表型和表达水平；其中15d叶龄的幼苗：(A)J9707；(B)J9707背景中的HY OE-16、HYOE-55、HY OE-63、HY OE-141和HY OE-30转基因系；(C)HY；(D)HY背景下的Z9 OE-7、Z9 OE-17、Z9 OE-23；(E)HY背景中的Z9 OE-119和Z9 OE-122转基因系；(F)HY背景中的Z9 OE-20和Z9 OE-25转基因系。(G-K)分别对应于A(G)、B(H)、C(I)、D(J)和F(K)中的幼苗长大到50d植株时的成熟叶。

图4为在花叶亲本HY中用CRISPR/Cas9***诱导的BnaRCO突变体。(A)Cas9P35s-BnaRCO(SRCO)的载体示意图。(B)针对RCO设计的靶点序列，其中用下划线标记了PAM序列。(C)BnaRCO编辑单株T₀和T₁代的基因型和表型。(D)BnaRCO编辑单株的sgRNA靶位点附近的序列。PAM序列用下划线标记，具体的突变序列信息见右边的标注；“A”或者“C”代表野生型等位基因，“a”或者“c”代表突变等位基因。标尺为1cm。

图5为BnaA10.RCO突变体表型及突变体中BnaLMI1的表达水平的检测。不同基因型编辑单株的表型(A)(二叶期)及其叶形指数(B)的比较；AaCc代表两个RCO基因拷贝杂合突变体，aacc代表两个RCO基因拷贝代表纯合突变体或双等位突变体；(C)通过qPCR用BnOTC进行RNA总量的均一化，检测了BnaA10.RCO编辑的转基因系中7d幼苗的茎尖中BnaLMI1的表达水平。标尺为1cm。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

供试材料：

HY来自于安徽省“铜陵花叶”，地方品种，叶片表型为深裂叶，也叫做花叶，由江西省农科院种植资源库提供。

Z9为“中双9号”简称为Z9，为推广品种，叶片表型为浅裂叶形。

半冬性甘蓝型油菜J9707为浅裂叶形，用于本研究中的转化受体，由华中农业大学油菜工程中心提供。

表达载体PMDC32购买自addgene网站，网址为https://www.addgene.org。

PYLCRISPR/Cas935S-H编辑载体由华南农业大学刘耀光老师实验室提供，载体具体序列参见Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y.Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.Mol Plant,2015,8:1274-1284。

Z9-NIL：两个亲本材料HY和Z9通过正反交分别得到F1杂种，其中HY×Z9的F1杂种通过自交和与HY亲本的回交，衍生出F2、F3、BC1F2、BC2F2和BC3F2等不同世代的分离群体。在BC3F2世代，通过分子标记辅助选择的方法筛选出在叶形主效位点(BnLLA10位点)为纯合Z9等位基因型且叶形与供体亲本Z9相同的单株，作为HY材料的近等基因系，称为Z9-NIL(Near-Isogenic Line ofHY)。

本发明提供一种控制油菜叶形的主效基因，所述主效基因为BnaA10.RCO基因或者其等位基因，其中BnaA10.RCO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明所涉及到的主效基因BnaA10.RCO基因，是位于油菜A10染色体上的基因，编码一个与植物叶形发育相关的HD-ZIPI转录因子，发明人利用图位克隆基因定位和遗传转化相结合的方法分离克隆了该基因。本发明利用本研究小组已发表的A10染色体上控制叶形的位点，即BnLLA10的精细定位结果，将定位区段缩小至A10染色体上A10_87和A10_88所对应的41.0kb的区段内。通过对这个区间范围内的5个基因的功能预测，确定了BnaA10.RCO基因为候选基因。该候选基因有2个内含子和3个外显子，编码223个氨基酸序列。该候选基因在HY和Z9两个亲本中基因型只有基因编码区离ATG处35bp有1个由C-T的碱基突变，导致HY相对Z9由Met12突变成Thr12。但该突变不在RCO基因保守motif区段内，且Met12也出现在刻裂叶材料Yuye 87中，说明Thr12或者Met12不是决定叶形的关键氨基酸。而BnaA10.RCO的5’-UTR区在亲本间存在很多差异，包括79个SNP和21个INDEL，而3’-UTR只有13个SNP差异。通过表达量检测发现在9d幼苗的茎顶端组织、10d和15d幼苗的叶片中，HY相较于Z9-NIL中，BnaA10.RCO基因表达量都显著上调表达。利用超表达技术，通过农杆菌介导的遗传转化，发现该基因的表达量与叶形复杂度呈正相关。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过农杆菌介导的遗传转化，发现在HY中敲除该基因会使花叶叶形突变成正常叶。在该超表达转基因株系和该基因敲除突变体中，相较于其野生型，BnaLMI1表达水平没有显著差异。因此，最终确定BnaA10.RCO基因为控制油菜叶缘刻裂的主效基因。

其中，步骤S1-1中扩增BnaA10.RCO基因组DNA序列所用的引物为：

A10-117F GGGCttaattaaCTACCATGGGTAAGGCTGTTGC

A10-118R GACAggtaccATGGAATGGTCAACGACGAGC。

S2-2，设计引物对HY刻裂叶和Z9浅裂叶两个材料进行候选基因测序，并将其cDNA和DNA的测序结果进行比较，确定两者的候选基因存在较大差异的位置；

其中，步骤S2-1中确定的候选基因为BnaA10.RCO和BnaA10.LMI1。

其中，步骤S2-2中基因克隆测序时所用的引物的核苷酸序列为：

A10_101F：TCTCCAAGATCCGAAACACCT

A10_101R：ATGGAATGGTCAACGACGAGC。

实施例1BnaA10.RCO基因的定位与克隆

经过申请人的大量研究，申请人认为在A10染色体定位区段内存在效应大的叶形基因，且在芸薹属中该位点对叶形的调控作用比较保守。

在甘蓝型油菜参考基因组中(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)，定位区段的41.0kb内有5个注释基因，即BnaA10g26310D到BnaA10g26350D(表1)。我们将BnLLA10区段内注释的基因比对到拟南芥基因组(http://www.arabidopsis.org/)，并进行功能注释。其中BnaA10g26320D(BnaA10.RCO)和BnaA10g26330D(BnaA10.LMI1)为拟南芥LMI1-like旁系同源基因，编码HD-Zip I转录因子，其同源基因在碎米荠、拟南芥被报道参与叶形调控(Vlad et al 2014,Sicard et al 2014)。另外3个基因中，BnaA10g26310D是一个外泌素家族基因；BnaA10g26340D编码一个3-脱氧-D-甘露糖八辛酸酯转移酶；BnaA10g26350D编码一个β-甘露聚糖合酶合成酶。这3个基因的注释信息都和叶形调控无关。因此，串联同源基因BnaA10.RCO和BnaA10.LMI1是最有可能控制油菜花叶的候选基因。

表1甘蓝型油菜参考基因组中定位区段内的注释基因

基于此，根据HY(刻裂叶)和Z9(浅裂叶)两个材料重测序序列，我们设计了A10-101F/R这对引物对BnaA10.RCO基因序列进行扩增，其中引物序列为：

A10_101F：TCTCCAAGATCCGAAACACCT

A10_101R：ATGGAATGGTCAACGACGAGC。

同时利用这对引物对该基因的cDNA和基因组扩增并进行TA克隆，其中PCR反应体系为：2ul DNA模板、25ul Phanta Max Buffer(Vazyme,P505-d1)、引物工作液各2ul、10mMdNTP 1ul、Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase 1ul和双蒸馏水混合成50ul的体系。反应程序为：1：95℃ 4分钟；2：95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分30秒；3：重复2步骤33次；4：72℃ 10分钟，25℃ 5分钟。

cDNA测序结果对比DNA测序结果表明，BnaA10.RCO有2个内含子和3个外显子，编码223个氨基酸序列，与BnaA10.LMI1相比蛋白相似性为61％，为同源基因。该类基因含有1个保守的同源盒(Homeobox domain)和亮氨酸拉链结构域(Leucine zipper domain)。在等位基因比较测序结果中，我们发现BnaA10.RCO基因在两个亲本中基因编码区离ATG处35bp有1个由C-T的碱基突变，导致HY相对Z9由Met12突变成Thr12。但该突变不在RCO基因保守motif区段内，且Met12也出现在刻裂叶材料Yuye 87中，说明Thr12或者Met12不是决定叶形的关键氨基酸。而BnaA10.RCO的5’-基因调控区在亲本间存在很多差异，包括79个SNP和21个INDEL，而3’-基因调控区只有13个SNP差异(图1)。

BnaA10.RCO基因的5’基因调控区克隆引物:

A10_111F：GAGCGAGTTGGATGAGTTAG

A10_112F：CTTTAGTCTTGCTGTTCTTGTG

A10_115R：CGGCGATGATGTAGAGATAATA

A10_145F：TTACCTTCGGTTCTTAGCGT

A10_148F：GTAGAGAGGGAAGTCATGTTGTC

A10_150R：CGATGTCTTGCGGTACTTTAT

BnaA10.RCO基因的3’基因调控区克隆引物:

A10_106F：TTCTTCGCAGGAGGTGTA

A10_107F：CAGGTTACGTTCCTCCTTTC

A10_108F：CGGTCTTGCTCCAACATT

A10_109R：TATCATCGCAACAGCCTTAC

A10_110R：GAGGCAAATGAATCTGAACAAC

实施例2BnaA10.RCO的表达量分析

在HY和Z9-NIL中检测BnaRCO的基因表达量。提取亲本HY和Z9-NIL茎顶端的总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，利用基因的表达检测引物进行PCR扩增，所述引物序列为：

RCOF：GGTAGCTGTTTGGTTCCAGAA

RCOR：CCCTCCGGCTATTTGATTGT

油菜基因ORNITHINE TRANSCARBAMYLASE(OTC)基因(Cnops et al 2004)作为内参基因，引物序列如下：

BnOTC-F：CATAACCACCCTTGCCAAATC

BnOTC-R：TTGTTCCCGTCTCCAACATAG

其中，反应体系为：2×super mix 7.5ul、左右引物(2.5uM)各2ul、CDNA:5.5ul，反应程序为1：95℃ 30秒；2：95℃ 15秒，56℃ 15秒，72℃ 15秒，收集荧光；3：重复2步骤45次；4：溶解曲线生成，4℃ 10分钟。

qRT-PCR结果表明在9d幼苗的茎顶端组织、10d和15d幼苗的叶片中，HY相较于Z9-NIL中，BnaRCO基因表达量显著上调表达。另外，相较于10d和15d幼苗的叶片，9d幼苗的茎顶端组织中候选基因的表达量显著上升(图2A)；在幼苗的不同组织，包括下胚轴、根、茎顶端、10d幼苗的叶片、10d幼苗的子叶中，BnaRCO基因的表达量在茎顶端中水平最高(图2B)，说明BnaRCO可能作用于叶片发育早期参与调控叶形。图2中A为HY和Z9-NIL中BnaRCO基因在发芽后9d的幼苗的茎顶端、10d的幼苗的叶子和15d的幼苗的叶子中的表达量；B为BnaRCO基因在HY幼苗的不同组织中的表达量；qRT-PCR是以BnOTC为内参基因，表达量计算是3个生物学重复的平均值±SD来表示的；Z9-NIL是BC3F2群体中HY背景下，在BnLLA10位点为纯合Z9基因型的个体；**，P<0.01的显著水平，*,P<0.05的显著水平。

实施例3BnaA10.RCO的超表达试验

我们分别从HY和Z9基因组中扩增BnaA10.RCO基因组DNA序列，上述引物信息为：

A10-117F：GGGCttaattaaCTACCATGGGTAAGGCTGTTGC

A10-118R：GACAggtaccATGGAATGGTCAACGACGAGC

连入以CaMV35S为启动子的表达载体PMDC32中，构建超表达载体。

该载体同时转化浅裂叶J9707和花叶HY两种受体材料。其中BnaA10.RCO^HY为HY中BnaA10.RCO等位基因的超表达载体，简称HY OE；BnaA10.RCO^Z9为Z9中BnaA10.RCO等位基因的超表达载体，简称Z9 OE。

通过农杆菌介导的下胚轴转化法，在以J9707(浅裂叶形，优异转化受体材料)为受体材料的HY OE转基因阳性株系后代中，大部分转基因阳性单株叶缘刻裂明显增多，个别产生深裂叶表型，类似于HY(图3B-H)。在HY转化背景下，Z9 OE转基因系阳性株系中，叶形刻裂程度比HY更严重，仅剩下少量叶肉组织，裂叶之间的生长和细胞增殖被抑制，叶片面积明显减少。HY转基因背景下Z9 OE中，Z9_OE-20、Z9_OE-119两个转基因系表现为平滑的叶边缘，表现出共表达抑制现象(图3E，F，K)。利用qRT-PCR进行表达量检测发现，BnaA10.RCO的表达均大大降低，表明两个株系中存在共抑制现象(图3M)。其中，图3为在J9707和HY背景下，过表达的BnaA10.RCOHY(HY OE)和BnaA10.RCOz9(Z9 OE)的表型和表达水平。15d叶龄的幼苗：(A)J9707；(B)J9707背景中的HY OE-16、HY OE-55、HY OE-63、HY OE-141和HY OE-30转基因系；(C)HY；(D)HY背景下的Z9 OE-7、Z9 OE-17、Z9 OE-23；(E)HY背景中的Z9 OE-119和Z9OE-122转基因系；(F)HY背景中的Z9 OE-20和Z9 OE-25转基因系。(G-K)分别对应于A(G)、B(H)、C(I)、D(J)和F(K)中的幼苗长大到50d植株时的成熟叶。通过qRT-PCR对BnOTC进行标准化，通过qRT-PCR检测10d转基因株系及其叶片的叶片(L)和茎尖(M)中的BnaRCO和BnaLMI1表达水平；表达量的值表示3个生物学重复的平均值±SD，标尺，1cm。

以上结果表明，不论是提高HY或Z9的BnaA10.RCO等位基因的表达量都可以增加叶形复杂度；而在HY中降低BnaA10.RCO基因表达量使叶缘变平滑。因此，BnaA10.RCO表达水平与叶形呈正相关关系。

转基因操作的具体步骤如下：

超表达载体构建：1)构建p35S:BnaRCO载体：将BnaA10.RCO基因序列以引物A10_117F(PacI)/A10_118R(KpnI)从HY和Z9中扩增出来，再利用酶切连接的方法连入pMDC32载体。对构建好的载体再通过测序验证正确后，提取质粒，然后转化农杆菌GV3101。

其中PCR扩增的反应体系为：2ul DNA模板、25ul Phanta Max Buffer(Vazyme,P505-d1)、引物工作液各2ul、10mM dNTP 1ul、Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase 1ul和双蒸馏水混合成50ul的体系。反应程序为1：95℃ 4分钟；2：95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分30秒；3：重复2步骤33次；4：72℃ 10分钟，25℃ 5分钟。酶切表达载体的反应体系为质粒15ul、FastDigest buffer 5ul、PacI和KpnI各1.25ul，最后加双蒸馏水混合成40ul体系；反应条件为37℃ 15分钟，连接时的反应体系为质粒4ul、T4 DNA ligasebuffer 2ul、T4 DNA ligese 0.5ul和双蒸馏水混合成10ul体系，反应条件为20-25℃ 10分钟。

遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

1)灭菌：种子用2ml离心管装小半管，加入75％酒精浸泡种子1-3分钟，注意时间不宜过长，否则影响发芽。去掉酒精，加入84消毒液(用蒸馏水稀释一倍)浸泡种子5-8分钟；去掉84消毒液，用无菌水冲洗3-5遍。

2)播种：用无菌镊子将灭菌种子播到M0培养基上，每皿20-25粒；然后，将培养皿放无菌培养盒中，暗光24℃培养6d。

3)摇菌：播种4d后用LB培养目标农杆菌菌株。灭菌PU瓶加入4ml LB培养液，再吸入10μl活化的目标菌株，并加入抗生素，即4ml LB液体加4μL kana和4μL Gent以及10μL菌液；于180-220r/min摇床中摇菌培养12-15h。

4)外植体的制备及侵染：测菌的OD值(OD约0.4左右较好)，吸取2ml培养好的菌株到2ml无菌离心管中，6000r/min离心3分钟，倒掉上清；用2ml DM重新悬浮一次，6000r/min离心3分钟，弃上清后，加2ml DM再次悬浮，将悬浮的菌液放4℃备用。无菌剪刀剪取暗培养6d的幼苗的下胚轴到无菌平皿中，平皿中先加入18mL M1液体培养基；剪下的外植体最适长度为0.8-1.0cm，且切取外植体时尽量一次性垂直剪下。每皿150-200个外植体时，加入第一步准备好的2ml DM悬浮菌液，开始计时浸染10-15分钟，期间每隔2分钟摇晃一次。然后快速吸出菌液，将外植体转移到无菌的滤纸上，吸走外植体上附着的大量菌液。

5)转到M1培养基中，每皿30-50个外植体，暗光下24℃放置。

6)24-48h后转到M2培养基，24℃光照条件下培养(白天16h/晚上8h)。

7)15-20d后转到M3培养基中，每2-3周继代一次，直至出现绿芽。

8)大于2cm的绿芽转入M4生根培养基生根，生根时间需2-4周。长出健壮的完整幼苗后就可以把幼苗移栽至大田或温室继续生长直至结实。

实施例4BnaA10.RCO的基因敲除试验

为了进一步证明BnaA10.RCO参与叶形调控，针对BnaA10.RCO基因编码区设计了两个sgRNA盒，将该载体命名为Cas9P35S-RCO，简称SRCO(图4A)。sgRNA构建引物为：

BnRCOT1-F：gtcACGGGCGTAGACGAATTTCC

BnRCOT1-R：aaacggaaattcgtctacgcccg

BnRCOT2-F：attGCTTCACCCTCCACCGTGCA

BnRCOT2-R：aaactgcacggtggagggtgaag

这两个sgRNA分别用拟南芥启动子pU3d和pU6-1启动表达，且同时靶向RCO的两个同源拷贝BnaA10.RCO(BnaA10g26320D)和BnaC04.RCO(BnaC04g00850D)(图4B)。将构建好的SRCO载体利用农杆菌下胚轴转化法转化HY材料。利用载体特异性引物进行转基因阳性鉴定，上述特异性引物序列为：

PB-L：GCGCGCGGTCTCGCTCGACTAGTATGG

PB-R：GCGCGCGGTCTCTACCGACGCGTATCC

扩增体系为：2ul DAN模板、1ul buffer3、0.16ul 10mM dNTP、0.1ul Taq DNApolymerase、左右引物各加0.5ul、双蒸馏水混合成10ul的体系。扩增程序为：95℃ 4分钟；2：95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分；3：重复2步骤32次；4：72℃ 10分钟，25℃ 5分钟。

结果共得到38个T₀代转基因阳性单株，这些单株进一步通过高通量测序方法鉴定基因型(Liu et al 2017)，基因编辑鉴定引物序列为：

C04-1：ggagtgagtacggtgtgcCCTACTTCCCGTTCCCTCAA

A10_266：gagttggatgctggatggATGGAATGGTCAACGACGAG

A10_267：ggagtgagtacggtgtgcGCGTGATAATTCCAAGATTTTTAGAA

A10_269：gagttggatgctggatggGATTCAGACAGGAAGGTGAAG

A10_271：ggagtgagtacggtgtgcACCTCATCGTGCGTTGTC

高通量测序结果表明有21个T₀代单株发生了基因编辑事件，编辑效率为55.3％。在这21个编辑单株中有12个单株在BnaA10.RCO和BnaC04.RCO两个拷贝同时发生纯合或双等位突变，突变体表现为浅裂叶形。为了进一步确认该突变表型是否可以遗传，我们继续对5个发生编辑的T₀代家系进行繁殖，并检测基因型。结果发现在所有检测的单株中，当BnaA10.RCO两个等位基因都发生移码突变(纯合突变或双等位突变，aacc基因型)或只有BnaA10.RCO发生纯合突变或双等位突变时，突变体都表现相同的浅裂叶形；而两个基因为杂合基因型(AaCc)时，突变体表现为中间叶形(图4C-D，图5A-B)。因此，我们推断BnaA10.RCO对叶形有决定作用，而根据RCO基因两个拷贝的表达量分析结果表明BnaC04.RCO几乎不表达，说明BnaC04.RCO与叶形调控无关。在rco突变体株系中进行BnaLMI1的基因表达量检测。检测结果表明在转基因系材料中BnaLMI1的基因表达量相较于受体材料中该基因的表达量都没有显著变化(图5C)。其中，图4为在花叶亲本HY中用CRISPR/Cas9***诱导的BnaRCO突变体。(A)Cas9P35s-BnaRCO(SRCO)的载体示意图。(B)针对RCO设计的靶点序列，其中用下划线标记了PAM序列。(C)BnaRCO编辑单株T₀和T₁代的基因型和表型。(D)BnaRCO编辑单株的sgRNA靶位点附近的序列。PAM序列用下划线标记，具体的突变序列信息见右边的标注；“A”或者“C”代表野生型等位基因，“a”或者“c”代表突变等位基因。标尺为1cm。

这意味着BnaRCO调控叶形的过程不需要依赖于调控BnaLMI1的表达水平。

CRISPR/Cas9编辑载体构建：利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线工具挑选基因靶位点，然后参照Ma等(2015)所描述的方法构建CRISPR/Cas9编辑载体进行，所用骨架载体为PYLCRISPR/Cas935S-H。主要步骤包括：

1)对骨架载体用Bsa I酶切，其中酶切反应体系为：取pU3d等质粒各

1μg，在25μl反应用10U Bsa I，冷冻保存，反应条件为：37℃酶切20分钟，回收骨架片段；

2)sgRNA盒构建，做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F接头反向引物，和用接头正向引物gR-R；第二轮为Overlapping PCR，用位置特异引物扩增出表达盒产物。其中U-F接头反向引物为：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG，接头正向引物gR-R为CGGAGGAAAATTCCATCCAC，反应体系为：表达盒连接产物0.5ul、引物各0.3ul、2mM dNTP1.5ul、1.5ul 10×buffer(KOD-Plus,TOYOBO)、5mM MgSO₄ 0.6ul、KOD plus 0.3ul，加双蒸馏水混合成15ul的体系，反应条件为：94℃ 2分钟；2：98℃ 10秒，58℃ 10秒，68℃ 10秒；3：重复2步骤25次；4：68℃ 4分钟，25℃ 4分钟。

3)双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接。用变温循环进行酶切连接约10-15循环:37℃ 5分钟；10℃ 5分钟，20℃ 5分钟；最后37℃ 5分钟。

4)对构建好的载体再通过测序验证正确后，提取质粒，然后转化农杆菌GV3101。农杆菌介导的下胚轴转化方法参照实施例3中的介绍。

基因编辑的基因型检测方法如下：本发明利用高通量的测序方法来检测突变基因型，本实验室主要采用了王克剑老师课题组开发的Hi-TOM测序方法，进行两轮重叠PCR：第一轮PCR使用靶点引物扩增目标片段；第二轮PCR使用通用引物扩增第一轮PCR产物，通用引物在目标片段两端添加上二代测序序列元件和barcode序列；PCR产物纯化后进行二代高通量测序；最后经过简单的数据提取后，使用在线网站Hi-Tom(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)分析每个单株的具体突变形式。

遗传转化所用培养基：

M0培养基：1/2MS(2.2g/L)+蔗糖(30g/L)，调pH值至5.8左右，加琼脂8g/L，然后高温灭菌；

DM悬浮液：MS(4.4g/L)+蔗糖(30g/L)，调pH约5.8，加琼脂8g/L，然后高温灭菌，使用时添加乙酰丁香酮终浓度100μM；

M1培养基：MS(4.4g/L)+蔗糖(30g/L)+甘露醇(18g/L)+2,4-D(1mg/L)+KT(0.3mg/L)，调pH约5.8，加琼脂8g/L，然后高温灭菌，使用时添加乙酰丁香酮终浓度100μM；

M2培养基：MS(4.4g/L)+葡萄糖(10g/L)+甘露醇(18g/L)+2,4-D(1mg/L)+KT(0.3mg/L)，调pH约5.8，加琼脂8g/L，然后高温灭菌，使用时添加硫代硫酸银(终浓度30μM)，以及抗生素(如潮霉素、特美汀)；

M3培养基：MS(4.4g/L)+蔗糖(30g/L)+木糖(0.25g/L)+MES(0.6g/L)，调pH约5.8，加琼脂8g/L，然后高温灭菌。使用时添加激素ZT(终浓度2mg/L)、IAA(终浓度0.1mg/L)和AgNO3(终浓度3mg/L)，以及抗生素(如潮霉素、特美汀)；

M4培养基：MS(4.4g/L)+蔗糖(10g/L)，调pH约5.8，加琼脂8g/L，然后高温灭菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种控制油菜叶形的主效基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1769

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 1

atggaatggt caacgacgag caatgttgaa aacacgagag ttgcttttat gccacttcag 60

tggctggagt ctaactcatc caactcgctc caaaacttca gctatgatcc ttatgcaggt 120

atattcattc acatgcatct ttatatccat ctttttgtgg atttgttgta attccggttg 180

agttttaaaa tttccaccaa aatatagcta ggtttgcatt aaattttgaa aaggtagcac 240

cattaatggc gagagattaa aaagaaaata ttagtatttt atttttatga tttttttaaa 300

gaaaattaaa gaaatatgaa tggtcagttg aatgacactt gtataataga attctcaaaa 360

tttgtgcaaa atgtttaaaa ttgaaaccat ttttcctctt tttattattt tctttaattt 420

taattatgag agactcagag aaatacgcct actatttcca tttttggaaa agattcgatt 480

ttatacagta ctccagtata tgactttttt gagggaacgg gaaaaacgtt ttgcaattct 540

aaaaatcttg gaattatcac gcttttctta tgagaagtag gatatagacc accgatattc 600

ttatgacttt cttggaacca tgctcagtgt ttcaaaagta gaaacgtcgc ttttcaaatg 660

ttttgagatt cgttttctcg ctcaagaaaa actggaaagt tttttttttg tattgtattt 720

gaaattatta ttgttgagcg tttgtgtcgt tctctttgtt tttgttgtta agttttacca 780

ggaaattcgt ctacgcccgt ccttacgcaa accggaccgg ttatttctgt accggaatca 840

tcagaaaaga tcaccaatgc gtgcccatat ccaagtaacg acgacgagat gataaagaag 900

aagcagaaac taacgactga acaattagct tcacttgaac agagttttca agaagatatc 960

aaacttgatt cagacaggaa ggtgaagctg tcgaaggagc ttcgtctgca gccacgtcag 1020

gtagctgttt ggttccagaa ccgccgtgca cggtggaggg tgaagcatct cgaggagtcg 1080

tacaactcgc taaggaaaga gtacgacgtg gtttcaagac agaatcaaat gctacacgat 1140

gaggtatata tatatatata tattttcttt ttttgacaac gcacgatgag gtatatatat 1200

gcaccattta aaaaaaaaaa tcatgggatc ttagagcatc cgtctccctt tagatattca 1260

cctaggtaat tgatagataa aatattacta gtagttattt aatatagttt atttaatgat 1320

tacattagaa atcatactaa aagtaagcaa atcatagatt gccatataac tttaagagta 1380

tctccagttt tttttttttt ttttttaagt ttctcaaact ccgtcattta tctctctact 1440

ttttgagttc tttttttttc ttcactacat tttcaaaatt tcttatttta taatgatcag 1500

atattcggtt gagatacacc aatgtgattt ctaaactatt catcctttgt tgttttagcc 1560

ctttagtttt tgattttgtg acgcaggtga tgaatctgag aggtgtaata ctaaaagacc 1620

atttgatgaa gaggcaaatg aatctgaaca acaatcaaat agccggaggg agtcaaattt 1680

acggtactgc agatcaatat aataatccaa tgtgtgttgc ttcaacttgt tggcccccgt 1740

tatcatcgca acagccttac ccatggtag 1769

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 3

Met Glu Trp Ser Thr Thr Ser Asn Val Glu Asn Thr Arg Val Ala Phe

1 5 10 15

Met Pro Leu Gln Trp Leu Glu Ser Asn Ser Ser Asn Ser Leu Gln Asn

20 25 30

Phe Ser Tyr Asp Pro Tyr Ala Val Leu Pro Gly Asn Ser Ser Thr Pro

35 40 45

Val Leu Thr Gln Thr Gly Pro Val Ile Ser Val Pro Glu Ser Ser Glu

50 55 60

Lys Ile Thr Asn Ala Cys Gln Tyr Pro Ser Asn Asp Asp Glu Met Ile

65 70 75 80

Lys Lys Lys Gln Lys Leu Thr Thr Glu Gln Leu Ala Ser Leu Glu Gln

85 90 95

Ser Phe Gln Glu Asp Ile Lys Leu Asp Ser Asp Arg Lys Val Lys Leu

100 105 110

Ser Lys Glu Leu Arg Leu Gln Pro Arg Gln Val Ala Val Trp Phe Gln

115 120 125

Asn Arg Arg Ala Arg Trp Arg Val Lys His Leu Glu Glu Ser Tyr Asn

130 135 140

Ser Leu Arg Lys Glu Tyr Asp Val Val Ser Arg Gln Asn Gln Met Leu

145 150 155 160

His Asp Glu Val Met Asn Leu Arg Gly Val Ile Leu Lys Asp His Leu

165 170 175

Met Lys Arg Gln Met Asn Leu Asn Asn Asn Gln Ile Ala Gly Gly Ser

180 185 190

Gln Ile Tyr Gly Thr Ala Asp Gln Tyr Asn Asn Pro Met Cys Val Ala

195 200 205

Ser Thr Cys Trp Pro Pro Leu Ser Ser Gln Gln Pro Tyr Pro Trp

210 215 220

Claims

1.一种控制油菜叶形的主效基因，其特征在于，所述主效基因为BnaA10.RCO基因或者其等位基因，其中BnaA10.RCO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种调控油菜叶形的蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1所述的主效基因编码。

3.一种含有控制油菜叶形的主效基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的含有控制油菜叶形的主效基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求1所述的主效基因的PMDC32载体。

5.控制油菜叶形的主效基因、该基因编码的蛋白以及含有该基因的表达载体在调控油菜叶形中的应用。

6.一种含有调控油菜叶形主效基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的含有调控油菜叶形主效基因的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤S1-1中扩增BnaA10.RCO基因组DNA序列所用的引物为：

A10-117F：GGGCttaattaaCTACCATGGGTAAGGCTGTTGC

A10-118R：GACAggtaccATGGAATGGTCAACGACGAGC。

8.一种控制油菜叶形的主效基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2-4，将主效基因BnaA10.RCO连接到表达载体上并经过农杆菌介导的下胚轴转化法转入到受体材料中，即可。

9.根据权利要求8所述的控制油菜叶形的主效基因的克隆方法，其特征在于，步骤S2-1中确定的候选基因为BnaA10.RCO和BnaA10.LMI1。

10.根据权利要求9所述的控制油菜叶形的主效基因的克隆方法，其特征在于，步骤S2-2中BnaA10.RCO克隆时所用的引物的核苷酸序列为：

A10_101F：TCTCCAAGATCCGAAACACCT

A10_101R：ATGGAATGGTCAACGACGAGC。