CN112011516A - 一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明公开了一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19171。其通过肟化反应合成了西罗莫司半抗原，制备了西罗莫司完全抗原，将其与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；选取高效价、低IC50小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过间接竞争酶联免疫法进行筛选，并三次亚克隆，得到上述细胞株。其分泌的单克隆抗体，对西罗莫司有较好的特异性和检测灵敏度（IC50为3.90 ng/mL），用于建立西罗莫司含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。
背景技术
西罗莫司（sirolimus），又称为雷帕霉素（Rapamycin），是一种低毒强效的大环内酯类免疫抑制剂，为白色结晶固体，脂溶性好，几乎不溶于水，于1975年首次从智利复活节岛的土壤中发现。西罗莫司为T细胞活化和增殖抑制剂，其作用机理与其他免疫抑制剂不同，且免疫抑制活性优于他克莫司和环孢霉素，可治疗和逆转发展中的急性排异反应，以及预防慢性排异反应。但西罗莫司具有半衰期长、治疗窗窄、药代动力学差异大等特点，因此临床使用过程中需监测血药浓度保持在目标浓度范围之内。通常建议的负荷量为 6mg，维持量为 2 mg/日。此外，西罗莫司浓度过低会导致免疫排斥，血小板减少、白细胞减少或高酯血症等。因此，有必要建立快速、高效的西罗莫司的监测方法。
西罗莫司含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的西罗莫司检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为西罗莫司检测提供了一种新的检测途径。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19171。
本发明的第二个目的是提供一种西罗莫司单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 19171的西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5分泌产生。
本发明的第三个目的是提供西罗莫司单克隆抗体的应用。
本发明的一种实施方式中，所述应用是用于临床血样中西罗莫司浓度的监测。
本发明的第四个目的是提供制备西罗莫司免疫原的方法，所述西罗莫司免疫原的制备方法基本步骤为：
（1）西罗莫司半抗原的制备：称取19 mg 西罗莫司，溶解于0.6 mL甲醇:水:吡啶（体积比4:1:1）混合溶液中，加入13 mg 羧甲基羟胺半盐酸盐（Carboxymethoxylaminehemihydrochloride，CMO），70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，即西罗莫司半抗原。
（2）免疫原西罗莫司-KLH的制备：称取10mg的西罗莫司半抗原将其溶解在800μLDMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），该混合物在室温搅拌6h；称取5 mg KLH，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液（CBS，pH=9.4）中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到KLH溶液中，室温反应8h，即得偶联物西罗莫司-KLH，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原西罗莫司-KLH。
（3）包被原西罗莫司-OVA的制备方法，称取10mg的西罗莫司半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，5mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，该混合物在室温搅拌6h；称取5mg OVA，溶解于0.1M、pH9.4的碳酸盐缓冲液CBS中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到OVA溶液中，室温反应8h，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原西罗莫司-OVA。
本发明的西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：
（1）小鼠的免疫：将免疫原西罗莫司-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，剂量为50μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射（不含佐剂）进行冲刺免疫，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；
（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过选择性培养基（HAT培养基）培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5；
（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5分泌的单克隆抗体，对西罗莫司具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为3.90 ng/mL），为检测临床上血样中西罗莫司含量提供了免疫学方法。本发明提供的西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测西罗莫司的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19171，保藏日期为2019年11月28日。
附图说明
图1西罗莫司单克隆抗体对西罗莫司的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将西罗莫司完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对西罗莫司有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株ROX1C5的制备
（1）完全抗原的制备：
a、半抗原合成路线如下：
Figure 855648DEST_PATH_IMAGE001
称取19mg 西罗莫司，溶解于0.6mL甲醇:水:吡啶（体积比4:1:1）溶液中，加入13mg 羧甲基羟胺半盐酸盐（Carboxymethoxylaminehemihydrochloride，CMO），70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜。随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次。收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，即西罗莫司半抗原。
b、免疫原西罗莫司-KLH的制备：称取10mg的半抗原将其溶解在800μL DMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），该混合物在室温搅拌6h；称取5mg 钥孔血蓝蛋白KLH，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液（CBS，pH=9.4）中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到KLH溶液中，室温反应8h，即得偶联物西罗莫司-KLH，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原西罗莫司-KLH。
（2）包被原西罗莫司-OVA的制备：
称取10mg的半抗原将其溶解在800μL DMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），该混合物在室温搅拌6h；称取5mg 鸡卵白蛋白OVA，溶解于0.1M碳酸盐缓冲液（CBS，pH=9.4）中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到OVA溶液中，室温反应8h，即得偶联物西罗莫司-OVA，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原西罗莫司-OVA。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测。
（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。西罗莫司完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用生理盐水稀释免疫原后腹腔注射（不含佐剂）进行冲刺免疫，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠。
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入体积浓度为75%的酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1-4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mLRPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，8min），弃上清，细胞轻轻敲散，重悬于含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640培养基中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用西罗莫司为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对西罗莫司标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株ROX1C5。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液（pH 7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例2 西罗莫司单克隆抗体的IC50的测定
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.0g NaCl，0. 2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4•12 H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液（PBST）：1000mL的0.01mol/L pH 7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween–20；
PBST：含0.05 % Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4•12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
（1）包被：将包被原西罗莫司-OVA用0.05 M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2 h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30 min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体西罗莫司的IC50为3.90ng/mL，说明对西罗莫司有很好的灵敏度，可用于西罗莫司免疫分析检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19171。
2.西罗莫司单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19171的西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株ROX1C5分泌产生。
3.西罗莫司半抗原的制备方法，其特征在于：称取19mg 西罗莫司，溶解于0.6mL混合溶液中；加入13mg 羧甲基羟胺半盐酸盐CMO，70℃水浴搅拌6h，室温避光静置过夜；随后，溶液通过氮气吹干，重悬于1mL三氯甲烷中，并用超纯水萃取三次；收集有机相，再次氮气吹干，终产物溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺DMF中，即得西罗莫司半抗原。
4.根据权利要求3所述西罗莫司半抗原的制备方法，其特征在于：所述混合溶液具体为甲醇:水:吡啶体积比为4:1:1的混合溶液。
5.免疫原西罗莫司-KLH的制备方法，其特征在于：称取10mg权利要求3制备所得西罗莫司半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，5mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，该混合物在室温搅拌6h；称取5mg KLH，溶解于0.1M、pH9.4的碳酸盐缓冲液CBS中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到KLH溶液中，室温反应8h，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原西罗莫司-KLH。
6.包被原西罗莫司-OVA的制备方法，其特征在于：称取10mg权利要求3制备所得西罗莫司半抗原，将其溶解在800μL DMF中，然后加入6.3mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，5mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，该混合物在室温搅拌6h；称取5mg OVA，溶解于0.1M、pH9.4的碳酸盐缓冲液CBS中；随后，逐滴将含半抗原溶液加入到OVA溶液中，室温反应8h，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原西罗莫司-OVA。
7.权利要求2所述西罗莫司单克隆抗体的应用，其特征在于：建立西罗莫司含量的免疫检测方法，应用于临床血样中西罗莫司浓度的监测。
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