CN112010829B - 海洋真菌hk1-6中神经保护活性苯酚衍生物及其制备方法 - Google Patents

海洋真菌hk1-6中神经保护活性苯酚衍生物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋真菌HK1‑6中神经保护活性苯酚衍生物及其制备方法，所述苯酚衍生物具有式I所示的结构：

Description

海洋真菌HK1-6中神经保护活性苯酚衍生物及其制备方法
技术领域
本发明属于海洋天然药物化学领域，具体涉及海洋真菌HK1-6中神经保护活性苯酚衍生物及其制备方法。
背景技术
申请人先前研究(中国发明专利申请号：201711417393.6、201810658502.1；J.Nat.Prod.,2017,80(4),1081–1086、J.Nat.Prod.,2019,82(2),368-374)中公开了系列分离自海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的抗耐药致病菌活性的化合物。本发明对海洋真菌HK1-6做进一步研究，获得了一种具有神经保护活性的苯酚衍生物。
发明内容
本发明提供一种海洋真菌HK1-6中神经保护活性苯酚衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述苯酚衍生物具有式I所示的结构：
Figure BDA0002080265110000011
本发明的另一实施方案提供上述式I结构的苯酚衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)先在菌种培养基中对海洋真菌HK1-6进行菌种培养；
(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌HK1-6进行发酵培养；
(3)将步骤(2)发酵培养得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；经过色谱分离即得式I结构的苯酚衍生物。
本发明上述制备方法中步骤(1)中菌种培养基优选PDA培养基，进一步优选含有葡萄糖0.1％–10.0％、酵母膏0.01％–5％、蛋白胨0.01％–5％、琼脂0.1％–6.0％、氯化钠0.05％–10％，适量的水；更进一步优选含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、琼脂0.1％–3.0％、氯化钠0.05％–5％；上述百分比均为重量百分比；培养温度优选为0–45℃，进一步优选5–30℃，更进一步优选15–25℃；培养时间优选为2–10天，进一步优选为3、5、7天。步骤(2)中发酵培养基优选PDA培养基，进一步优选含有葡萄糖0.1％–10.0％、酵母膏0.01％–5％、蛋白胨0.01％–5％、溴化钠0.05％–10％，适量的水；更进一步优选含有葡萄糖0.1％–5.0％、酵母膏0.01％–2％、蛋白胨0.01％–2％、溴化钠0.05％–5％；上述百分比均为重量百分比；培养温度优选为0–45℃，进一步优选5–30℃，更进一步优选10–25℃；培养时间优选为20–40天，进一步优选21、24、28、30、32、35天；步骤(3)中所述色谱分离优选减压硅胶柱层析、正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析、高效液相制备色谱中的一种或几种组合。
本发明的另一实施方案提供海洋真菌HK1-6在制备上述式I结构的苯酚衍生物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗神经损伤药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的应用。
一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物组合物还可包括其他预防和/或治疗神经损伤药物。该药物组合物还可包括药学上可接的辅料(药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂)。该药物组合物的剂型优选固体制剂、半固体制剂或液体制剂等。
一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物组合物还任选包括其他神经保护药物。该药物组合物还可包括药学上可接的辅料(药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂)。该药物组合物的剂型优选固体制剂、半固体制剂或液体制剂等。
本发明所述的海洋真菌HK1-6同在先申请(申请号：201711417393.6)中的海洋真菌Penicillium sp.HK1-6，来源于红树林根际土壤。其菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年7月5日；保藏编号：CGMCCNo.12762；分类命名：青霉Penicillium sp.。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是式I化合物的1H NMR(600MHz,acetone-d6)谱图；
图2是式I化合物的13C NMR(150MHz,acetone-d6)谱图；
图3是式I化合物的HSQC谱图；
图4是式I化合物的1H–1H COSY谱图；
图5是式I化合物的HMBC谱图；
图6是式I化合物的HRESIMS谱图；
图7是式I化合物的神经保护活性图，A为式I化合物对正常星形胶质细胞细胞活力的影响图；B为式I化合物对模型星形胶质细胞活力的影响(OGD for 6h)图，###p<0.001vscontrol,*p<0.05vs OGD,***p<0.001vs OGD。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)海洋真菌HK1-6菌种的培养
真菌HK1-6的菌种培养所用的培养基为每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，氯化钠30g，琼脂15g；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株接种于培养基平板中，在20℃下摇床培养3天。
(2)海洋真菌HK1-6的发酵
真菌HK1-6的发酵培养所用的发酵培养基为，每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，氯化钠30g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于25℃静置培养28天。
(3)式I结构的苯酚衍生物的分离纯化
取步骤(2)所得的发酵物30L，将发酵液和菌体分离后，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压浓缩得到发酵液浸膏；先进行减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，将其中50:50和40:60梯度洗脱得到的馏分合并后浓缩经正相硅胶柱层析(硅胶200-300目，洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝6:1-3:1)，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为65％的MeOH/H2O，最终得到式I化合物(16.0mg，白色固体)。
Figure BDA0002080265110000041
结构确证数据：UV(MeOH)λmax(logε)290(0.9),206(1.9)nm；IR(KBr)νmax 3158,1570,1411,1268,1169,1120,1025,850,758,649cm-1；1H NMR(600MHz,acetone-d6)δH 6.38(1H,s,H-10),6.36(1H,s,H-8),5.84(1H,s,H-4),3.89(2H,s,H-6),2.53(3H,s,H-14),1.83(3H,s,H-15)；13C NMR(150MHz,acetone-d6)δC203.6(C,C-13),138.5(C,C-7),165.0(C,C-1),162.5(C,C-5),161.7(C,C-9),161.6(C,C-11),165.7(C,C-3),119.6(C,C-12),111.7(CH,C-8),102.8(CH,C-10),100.8(CH,C-4),98.6(C,C-2),38.3(CH2,C-6),32.4(CH3,C-14),8.5(CH3,C-15)；HRESIMS(positive)m/z 313.0694[M+Na]+(Calcd.for C15H14NaO6,313.0683).
实施例2神经保护活性测试
根据MTT法(Biomedicine&Pharmacotherapy,2016,84:925～930)研究式I化合物对氧糖剥夺(OGD)损伤大鼠脊髓星形胶质细胞的体外神经保护作用。
细胞培养。在试验用大鼠出生后24h内取其大脑皮层，用0.25％胰蛋白酶分散细胞，离心后将细胞培养在高糖培养基DMEM(添加有10％FBS,青霉素G(100units/mL)和链霉素(100μg/mL))，在37℃、5％CO2条件下培养，最终经12-14天培养获得单层星形胶质细胞。
细胞活力测试。将大鼠脊髓星形胶质细胞以1×104个/孔置于96孔板于5％CO2细胞培养箱中培养。将不同浓度的化合物(0,0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0μg/mL)添加到细胞培养基，培养24小时。采用MTT法检测细胞活力。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)于37℃条件反应4h，然后每孔加入100μL DMSO溶解formazan，最后在自动酶标仪490nm下测OD值。
神经保护活性测定。大鼠脊髓星形胶质细胞以1×104个/孔置于96孔板于5％CO2细胞培养箱中培养。不同浓度的式I化合物(0.3125,0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0μg/mL)在氧糖剥夺前加入胶质细胞培养基培养24h，对照组在常氧条件下于正常DMEM培养基中培养，模型组不加化合物且经6h糖氧剥夺处理(5％CO2,1％O2,94％N2)。MTT法检测细胞活力。经糖氧剥夺后,每孔加入20μL MTT(5mg/mL)处理4h，然后每孔加入100μL DMSO溶解formazan，最后在自动酶标仪490nm下测OD值。
结果表明，式I化合物对星形胶质细胞基本无毒性；在0.3125～5μg/ml浓度范围内，化合物预处理对模型星形胶质细胞有明显的保护作用。即式I化合物能减轻OGD诱导的大鼠脊髓星形胶质细胞活力丧失，具有一定的神经保护作用(见附图7)。

Claims (9)

1.一种海洋真菌Penicillium sp.HK1-6中神经保护活性苯酚衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述苯酚衍生物具有式I所示的结构：
Figure FDA0003691419460000011
所述海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的保藏编号为CGMCCNo.12762。
2.海洋真菌Penicillium sp.HK1-6在制备权利要求1所述式I结构的苯酚衍生物中的应用，所述海洋真菌Penicillium sp.HK1-6的保藏编号为CGMCCNo.12762。
3.权利要求1所述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗神经损伤药物中的应用。
4.权利要求1所述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐在制备神经保护药物中的应用。
5.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以权利要求1所述式I结构的苯酚衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
6.权利要求5所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物还包括其他预防和/或治疗神经损伤药物。
7.权利要求5所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物还包括其他神经保护药物。
8.权利要求5-7任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物还包括药学上可接的辅料。
9.权利要求8所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的剂型选自固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
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