CN112010724A - 萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法 - Google Patents

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Abstract

萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法，本发明涉及异构体的分离和检测技术领域，通过在毛细管电泳缓冲液中加入环糊精，并构建合适的毛细管电泳分离条件，通过粘度矫正的方法来精确表征萘衍生物异构体的净迁移率差异，实现了萘衍生物异构体的有效分离，并准确测定了不同萘衍生物异构体与环糊精的结合常数；其具有分离效果好、灵敏度高、准确性好等特点，也可用于其他化合物异构体的分离分析，并有望延伸应用于药物异构体的分离，及其与靶点相互作用的研究。

Description

萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法
技术领域
本发明涉及异构体的分离和检测技术领域，具体涉及萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法。
背景技术
目前，用于分离异构体化合物的常用分析方法有化学衍生法、酶拆分法和色谱拆分法等，但往往存在操作步骤繁琐、成本较高、无法自动化和适用范围有限等问题。毛细管电泳(CE)具有诸多优点，包括样品消耗少、容易自动化、分析时间短和分离效率高，且无须对目标分子进行衍生化或固定化，有效避免由于分子结构改变而导致的***误差。近年来，CE被广泛应用于异构体和手性药物，以及生物分子的分离分析。
环糊精(CD)是一类由葡萄糖聚合而成的环状低聚糖化合物，作为具有圆台型空腔结构的刚性分子，具有内部疏水，外部亲水的独特结构，这使得CD能与众多客体分子形成包合物，被广泛应用于异构体和手性拆分领域。因此，CD作为一类CE分离常用的添加剂，被用于异构体和手性药物的分离分析。然而，电泳缓冲液的组成，如缓冲液的种类、浓度、pH值、添加剂的种类及含量等，都会影响电泳迁移率的大小，因此常规的亲和毛细管电泳法无法有效解决结果重现性和准确性差的问题。
萘衍生物作为一种很重要的化工中间体，在塑料、染料、医药和农药等方面都有着重要的应用。目前，国内外尚未有应用毛细管电泳法分离萘衍生物异构体以及分析检测其与环糊精相互作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理的萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法，通过在毛细管电泳缓冲液中加入环糊精，并构建合适的毛细管电泳分离条件，通过粘度矫正的方法来精确表征萘衍生物异构体的净迁移率差异，实现了萘衍生物异构体的有效分离，并准确测定了不同萘衍生物异构体与环糊精的结合常数；其具有分离效果好、灵敏度高、准确性好等特点，也可用于其他化合物异构体的分离分析，并有望延伸应用于药物异构体的分离，及其与靶点相互作用的研究。
为达到上述目的，本发明所述的萘衍生物异构体分离的方法，其步骤如下：
步骤1、配制40mM的缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入环糊精，超声脱气20-40min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；
步骤2、量取步骤1所得的电泳缓冲液10mL，加入0.00125mmol萘衍生物和50μL的电渗流标记物，配制得到浓度为0.125mM的萘衍生物样品溶液；
步骤3、将步骤2中配制的萘衍生物样品溶液采用毛细管电泳仪，在步骤1制得的电泳缓冲液中进行检测，根据得到的毛细管电泳谱图中各组分信号峰的保留时间，可确定各种萘衍生物异构体已实现基线分离。
进一步地，所述的步骤1中的缓冲溶液为硼砂缓冲液。
进一步地，所述的步骤1中的环糊精为β-环糊精或HP-β-环糊精。
进一步地，所述的步骤2中的萘衍生物为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠中的两种或多种。
进一步地，所述的毛细管电泳采用高效毛细管电泳仪，其电泳条件为：进样压力为0.5psi，进样时间为5.0s，分离电压为10kV，分离时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有相同环糊精浓度的电泳缓冲液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min；实验中的电渗流标记物为甲醇。
本发明所述的萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其步骤如下：
步骤A、改变电泳缓冲液中环糊精的浓度，并加入萘衍生物和电渗流标记物，从而配制得到不同浓度的萘衍生物样品溶液；所述的电泳缓冲液与萘衍生物样品溶液中含有相同浓度的环糊精；
步骤B、将不同浓度的萘衍生物样品溶液采用毛细管电泳仪，在不同浓度的电泳缓冲液中进行检测，得到不同环糊精浓度下的毛细管电泳谱图；
步骤C、分别对不同环糊精浓度下所得的毛细管电泳谱图进行分析，确定萘衍生物和电渗流标记物的迁移率；
步骤D、粘度校正：通过在毛细管中注入一段电渗流标记物，并用恒定的压力推动其通过毛细管，分别测定电渗流标记物在不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间；所述电渗流标记物为甲醇，缓冲溶液中的环糊精为β-环糊精或HP-β-环糊精，测定的浓度范围为0-20mM或0-80mM；所述毛细管电泳参数为：进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，推动压力为5.0psi，检测时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃；每次进样前，使用含有相同环糊精浓度的缓冲溶液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min；
根据公式(1)可以计算出萘衍生物的粘度校正后净迁移率：
Figure BDA0002667049970000041
其中，t和t0分别为甲醇在缓冲溶液和不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间，μapp为测得的萘衍生物在不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的迁移率，μeof为电渗流的迁移率，即甲醇的迁移率；
步骤E、结合常数的计算：根据公式(2)，以
Figure BDA0002667049970000042
对[C]进行非线性拟合，得到结合常数K；
Figure BDA0002667049970000043
其中，[C]为电泳缓冲液中环糊精的浓度，
Figure BDA0002667049970000044
为萘衍生物的粘度校正后净迁移率；μep,A和μep,AC分别为萘衍生物及其与环糊精结合的复合物的迁移率，计算时无需求解。
进一步地，所述的步骤A中的β-环糊精的浓度范围为0-20mM，HP-β-环糊精的浓度范围为0-80mM。
进一步地，所述的步骤A中的缓冲溶液为硼砂缓冲液。
进一步地，所述的步骤A中的电渗流标记物为甲醇。
进一步地，所述的步骤A中的萘衍生物为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠中的一种或多种。
进一步地，所述的步骤A中的环糊精为β-环糊精或HP-β-环糊精。
采用上述结构后，本发明的有益效果是：本发明提供了一种萘衍生物异构体分离及其与环糊精结合常数测定的方法，通过在毛细管电泳缓冲液中加入环糊精，并构建合适的毛细管电泳分离条件，通过粘度矫正的方法来精确表征萘衍生物异构体的净迁移率差异，实现了萘衍生物异构体的有效分离，并准确测定了不同萘衍生物异构体与环糊精的结合常数；其具有分离效果好、灵敏度高、准确性好等特点，也可用于其他化合物异构体的分离分析，并有望延伸应用于药物异构体的分离，及其与靶点相互作用的研究。
附图说明：
图1是实施例1中萘衍生物混合样品在不同浓度β-环糊精缓冲液中的毛细管电泳图(其中，标记1-4分别为为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠的流出峰)。
图2是实施例1中电渗流标记物出峰附近流出曲线的放大图。
图3是实施例1中1-萘磺酸钠的净迁移率与β-环糊精浓度的关系图。
图4是实施例1中2-萘磺酸钠的净迁移率与β-环糊精浓度的关系图。
图5是实施例1中2,6-萘二磺酸二钠的净迁移率与β-环糊精浓度的关系图。
图6是实施例1中1-萘乙酸钠的净迁移率与β-环糊精浓度的关系图。
图7为实施例2中萘衍生物混合样品在不同浓度HP-β-环糊精缓冲液中的毛细管电泳图(其中，标记1-4分别为为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠的流出峰)。
图8为实施例2中1-萘磺酸钠的净迁移率与HP-β-环糊精浓度的关系图。
图9为实施例2中2-萘磺酸钠的净迁移率与HP-β-环糊精浓度的关系图。
图10为实施例2中2,6-萘二磺酸二钠的净迁移率与HP-β-环糊精浓度的关系图。
图11为实施例2中1-萘乙酸钠的净迁移率与HP-β-环糊精浓度的关系图。
图12为实施例3中1-萘磺酸钠与β-环糊精相互作用的分子模拟图。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
步骤1、配制40mM的硼砂缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入0-20mM的β-环糊精，超声脱气30min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；步骤2、用步骤1配制的电泳缓冲液配制浓度为0.125mM的萘衍生物样品溶液(含有相同浓度的1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠)；步骤3、将步骤2配制的萘衍生物样品溶液在毛细管电泳条件下，使用步骤1制得的电泳缓冲液使萘衍生物异构体实现基线分离，所述的毛细管电泳条件为:所用仪器为PA800 plus毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，进样压力为0.5psi，进样时间为5.0s，分离电压为10kV，分离时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有相同环糊精浓度的电泳缓冲液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min；实验中的电渗流标记物为甲醇。实验结果如图1和图2所示，1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠互为同分异构体，在不加β-环糊精的硼砂缓冲溶液中无法分离，同时出峰，保留时间为15.70min。2,6-萘二磺酸二钠比1-萘磺酸钠多一个磺酸根基团，迁移速率更慢，在25min内并未观察到信号峰，1-萘乙酸钠比1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠的迁移速率快，保留时间为13.28min。随着β-环糊精的加入，各个组分的保留时间均减少，表明β-环糊精与各个组分均发生了相互作用。当β-环糊精为5mM时，1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠的保留时间分别为14.83min和10.17min，达到基线分离。
随着β-环糊精浓度的增加(0-20mM)，各个组分的保留时间逐渐减少，而电渗流标记物的保留时间逐渐增加，说明的加入导致电泳缓冲液的粘度增加，可能会影响各个组分的迁移率。为了准确获得各个组分的净迁移率，需要对粘度进行校正。
电泳迁移率的粘度校正：配制40mM的硼砂缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入0-20mM的β-环糊精，超声脱气30min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；通过在毛细管中注入一段电渗流标记物(甲醇)，并用恒定的压力推动其通过毛细管，分别测定电渗流标记物在不同β-环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间t。所述的毛细管电泳条件为:进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，推动压力为5.0psi，检测时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有相同β-环糊精浓度的电泳缓冲液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min。根据公式(1)计算出各个萘衍生物的粘度校正后净迁移率
Figure BDA0002667049970000081
结合常数的计算：缓冲液中β-环糊精的浓度为[C]，计算每个[C]下各个萘衍生物的净迁移率，根据公式(2)，以
Figure BDA0002667049970000082
对[C]进行非线性拟合，得到拟合曲线如图3-图6所示，各个萘衍生物的结合常数K见表1。
表1萘衍生物与β-环糊精相互作用的结合常数
Figure BDA0002667049970000083
实施例2：
步骤1、配制40mM的硼砂缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入0-80mM的HP-β-环糊精，超声脱气30min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；步骤2、用步骤1配制的电泳缓冲液配制浓度为0.125mM的萘衍生物样品溶液(含有相同浓度的1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠)；步骤3、将步骤2配制的萘衍生物样品溶液在毛细管电泳条件下，使用步骤1制得的电泳缓冲液使萘衍生物异构体实现基线分离，所述的毛细管电泳条件为:所用仪器为PA800 plus毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，进样压力为0.5psi，进样时间为5.0s，分离电压为10kV，分离时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有与样品溶液相同环糊精浓度的缓冲溶液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min；实验中的电渗流标记物为甲醇。实验结果如图7所示，1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠互为同分异构体，在不加HP-β-环糊精的硼砂缓冲溶液中无法分离，同时出峰，保留时间为15.70min。2,6-萘二磺酸二钠比1-萘磺酸钠多一个磺酸根基团，迁移速率更慢，在25min内并未观察到信号峰，1-萘乙酸钠比1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠的迁移速率快，保留时间为13.28min。随着HP-β-环糊精的加入，各个组分的保留时间均减少，表明HP-β-环糊精与各个组分均发生了相互作用。当HP-β-环糊精为50mM时，1-萘磺酸钠和2-萘磺酸钠的保留时间分别为11.53min和9.94min，达到基线分离。
随着HP-β-环糊精浓度的增加(0-80mM)，各个组分的保留时间先减少后增加，而电渗流标记物的保留时间逐渐增加，说明的加入导致电泳缓冲液的粘度增加，可能会影响各个组分的迁移率。为了准确获得各个组分的净迁移率，需要对粘度进行校正。
电泳迁移率的粘度校正：配制40mM的硼砂缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入0-80mM的HP-β-环糊精，超声脱气30min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；通过在毛细管中注入一段电渗流标记物(甲醇)，并用恒定的压力推动其通过毛细管，分别测定电渗流标记物在不同HP-β-环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间t。所述的毛细管电泳条件为:进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，推动压力为5.0psi，检测时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有相同HP-β-环糊精浓度的缓冲溶液以压力(30.0psi)冲洗毛细管5min。根据公式(1)计算出各个萘衍生物的粘度校正后净迁移率
Figure BDA0002667049970000101
结合常数的计算：缓冲液中HP-β-环糊精的浓度为[C]，计算每个[C]下各个萘衍生物的净迁移率，根据公式(2)，以
Figure BDA0002667049970000102
对[C]进行非线性拟合，得到拟合曲线如图8-图11所示，各个萘衍生物的结合常数K见表2。
表2萘衍生物与HP-β-环糊精相互作用的结合常数
Figure BDA0002667049970000103
实施例3：
为了验证该方法的有效性，通过Hyperchem软件的分子模拟计算萘衍生物与β-环糊精的相互作用。首先，利用Hyperchem软件分别构建萘衍生物和β-环糊精分子，所有分子的结构均在一个立体框(大小为2×2×2nm3，最大水分子数为265，溶剂和溶质原子之间的最小距离为
Figure BDA0002667049970000104
)中进行半经验法(AM1)优化。1-萘磺酸钠与β-环糊精的相互作用模拟图如图12所示，其中水分子充斥在立体框的周围，灰色球棍模型表示β-环糊精分子和1-萘磺酸钠分子，结果表明1-萘磺酸钠进入β-环糊精的输水空腔并发生结合。
通过分子模拟计算，将设定的立体框中复合物在水中的能量减去游离萘衍生物在水中的能量，可得到结合能。这里采用相对能量来评估各个萘衍生物与β-环糊精的结合能力，即将结合能最小的复合物定义为0％的体系，结合能最大的复合物定义为100％的体系，并由此计算其他复合物的相对比重。结果如表3所示，通过模拟计算确定萘衍生物与β-环糊精的相对结合能，表明1-萘磺酸钠的相对结合能为0％，2-萘磺酸钠的相对结合能为100％，2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠的相对结合能分别为88.92％和68.83％。与本发明得到的实验结果相比较，整体趋势是一致的，按照与β-环糊精的结合能力强弱顺序依次为：2-萘磺酸钠>2,6-萘二磺酸二钠>1-萘乙酸钠>1-萘磺酸钠。由此结果证明了本发明中的分析方法对测定萘衍生物异构体与环糊精相互作用的有效性。
表3萘衍生物与β-环糊精相互作用的分子模拟和实验结果比较
Figure BDA0002667049970000111
经分析，这是由于2-萘磺酸钠的疏水性基团可深深地嵌插在β-环糊精的腔内中，留下亲水性的磺酸基团在β-环糊精的腔外，结合能力最强。而1-萘磺酸钠由于官能团的位置发生了变化，疏水性的萘环只能浅浅地***β-环糊精的腔内，并且由于磺酸基团的空间位阻较大，导致β-环糊精对其的包合作用十分微弱，比对空间位阻小的1-萘乙酸钠的更弱。2,6-萘二磺酸二钠由于带有两个磺酸钠官能团，空间位阻变大，亲水能力变强，因此β-环糊精对其的包合作用变弱，导致结合能力小于2-萘磺酸钠。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.萘衍生物异构体分离的方法，其特征在于：其步骤如下：
步骤(1)、配制40mM的缓冲溶液，pH为9.2，在所述的缓冲溶液中加入环糊精，超声脱气20-40min，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得溶液为电泳缓冲液；
步骤(2)、量取步骤(1)所得的电泳缓冲液10mL，加入0.00125mmol萘衍生物和50μL的电渗流标记物，配制得到浓度为0.125mM的萘衍生物样品溶液；
步骤(3)、将步骤(2)中配制的萘衍生物样品溶液采用毛细管电泳仪，在步骤(1)制得的电泳缓冲液中进行检测，根据得到的毛细管电泳谱图中各组分信号峰的保留时间，可确定各种萘衍生物异构体已实现基线分离。
2.根据权利要求1所述的萘衍生物异构体分离的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的缓冲溶液为硼砂缓冲液。
3.根据权利要求1所述的萘衍生物异构体分离的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的环糊精为β-环糊精或HP-β-环糊精。
4.根据权利要求1所述的萘衍生物异构体分离的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的萘衍生物为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠中的两种或多种。
5.根据权利要求1所述的萘衍生物异构体分离的方法，其特征在于：所述的毛细管电泳采用高效毛细管电泳仪，其电泳条件为：进样压力为0.5psi，进样时间为5.0s，分离电压为10kV，分离时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃。每次进样前，使用含有相同环糊精浓度的电泳缓冲液以压力冲洗毛细管5min；实验中的电渗流标记物为甲醇。
6.萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其特征在于：其步骤如下：
步骤(A)、改变电泳缓冲液中环糊精的浓度，并加入萘衍生物和电渗流标记物，从而配制得到不同浓度的萘衍生物样品溶液；所述的电泳缓冲液与萘衍生物样品溶液中含有相同浓度的环糊精；
步骤(B)、将不同浓度的萘衍生物样品溶液采用毛细管电泳仪，在不同浓度的电泳缓冲液中进行检测，得到不同环糊精浓度下的毛细管电泳谱图；
步骤(C)、分别对不同环糊精浓度下所得的毛细管电泳谱图进行分析，确定萘衍生物和电渗流标记物的迁移率；
步骤(D)、粘度校正：通过在毛细管中注入一段电渗流标记物，并用恒定的压力推动其通过毛细管，分别测定电渗流标记物在不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间；所述电渗流标记物为甲醇，缓冲溶液中的环糊精为β-环糊精或HP-β-环糊精，测定的浓度范围为0-20mM或0-80mM；所述毛细管电泳参数为：进样压力为1.0psi，进样时间为5.0s，推动压力为5.0psi，检测时间为25min，检测波长为214nm，柱温为20℃；每次进样前，使用含有相同环糊精浓度的缓冲溶液以压力冲洗毛细管5min；
根据公式(1)可以计算出萘衍生物的粘度校正后净迁移率：
Figure FDA0002667049960000021
其中，t和t0分别为甲醇在缓冲溶液和不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的保留时间，μapp为测得的萘衍生物在不同环糊精浓度的电泳缓冲液中的迁移率，μeof为电渗流的迁移率，即甲醇的迁移率；
步骤(E)、结合常数的计算：根据公式(2)，以
Figure FDA0002667049960000022
对[C]进行非线性拟合，得到结合常数K；
Figure FDA0002667049960000031
其中，[C]为电泳缓冲液中环糊精的浓度，
Figure FDA0002667049960000032
为萘衍生物的粘度校正后净迁移率；μep,A和μep,AC分别为萘衍生物及其与环糊精结合的复合物的迁移率，计算时无需求解。
7.根据权利要求6所述的萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其特征在于：所述的步骤(A)中的β-环糊精的浓度范围0-20mM，HP-β-环糊精的浓度范围为0-80mM。
8.根据权利要求6所述的萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其特征在于：所述的步骤(A)A中的缓冲溶液为硼砂缓冲液。
9.根据权利要求6所述的萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其特征在于：所述的步骤(A)中的电渗流标记物为甲醇。
10.根据权利要求6所述的萘衍生物异构体与环糊精结合常数测定的方法，其特征在于：所述的步骤(A)中的萘衍生物为1-萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、2,6-萘二磺酸二钠和1-萘乙酸钠中的一种或多种。
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