CN112007173A - 一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，涉及荧光共轭聚合物纳米技术领域，应用的方法包括：制备荧光共轭聚合物纳米探针，该探针包括一般荧光共轭聚合物纳米探针和近红外荧光共轭聚合物纳米探针；将荧光共轭聚合物纳米探针配制成荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液；应用于对哺乳动物周围神经成像，包括直接暴露方式成像和肌肉注射方式成像。本发明采用的共轭聚合物纳米探针制备工艺简单，应用于周围神经成像，共轭聚合物纳米探针集中于神经外膜及神经束膜标记神经，不损伤神经细胞，生物安全性高；可实现对哺乳动物周围神经的高效可视化，而对神经周围的脂肪组织和皮肤组织无非特异性摄取，有很强的临床应用价值。

Description

一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用

技术领域

本发明涉及荧光共轭聚合物纳米技术领域，尤其涉及一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用。

背景技术

周围神经***的损伤是外科手术中的重大问题，是最令人恐惧的外科手术并发症之一。尤其在恶性肿瘤切除术中，恶性病变周围的生理畸变，增加了周围神经受损的几率。仅在美国每年就有60万例由外科手术造成的神经损伤。周围神经***的损伤极大影响患者的生存质量，对患者生理及心理影响巨大。比如在甲状腺切除术中，喉神经经常受伤，这会导致患者声音改变或丧失或引发呼吸***疾病。在头颈癌中，周围神经***损伤表现为面部神经麻痹，患者容貌异常，导致患者在情感层面和生理层面均受到不同程度的创伤。***切除术的常见副作用是***丛神经损伤，可能导致部分或完全失禁或***功能障碍。医源性神经损伤限制了患者的生存质量并增加医疗支出，虽然经验丰富的外科医生可以在正常解剖情况下轻松识别出主要神经，但先前的创伤，放疗，肿瘤和先前的手术可能会导致纤维化组织沉积和非典型的手术解剖平面，从而使神经辨别具有挑战性。基于以上，直接的神经可视化是避免医源性神经损伤的有效策略。现阶段，超声，肌电图，光学相干断层扫描和共聚焦内窥镜检查已用于辅助术中神经识别。但是，这些技术缺乏特异性，分辨率和广域成像功能使得实时神经检测变得困难。

荧光引导手术(FGS)有效实现术中可视化，操作便捷，成像迅速，成像设备易获得，已成功应用于临床。吲哚菁绿(ICG)和亚甲蓝是美国食品和药物管理局(FDA)批准的可应用于FGS的荧光造影剂。但ICG和亚甲蓝组织特异性差，在周围肌肉、脂肪以及***中有较高的非特异性摄入，无法对周围神经进行高信噪比的可视化。同时，ICG及亚甲蓝易扩散，短时间内即可弥散到周边组织，污染手术窗口，无法实现长时间手术过程中的稳定导航。

除此之外，研究已发现八类神经特异性造影剂，二苯乙烯，香豆素，苯乙烯基吡啶鎓，二苯乙烯基苯(DSB)，三碳菁，神经特异性肽，钠通道选择性肽和恶嗪荧光团，然而，这八类造影剂会导致高非特异性脂肪组织和皮肤组织摄取。其神经荧光强度与脂肪，皮肤和肌肉切开边缘的非特异性摄取相当。同时，对于以上各类造影剂的毒性研究也尚不完全，其安全性尚未可知，比如基于钠通道选择性肽设计的造影剂可能对患者新陈代谢或神经元功能造成一定影响。小分子荧光团可能会穿过血-神经屏障(BNB)。所以***全面的毒性研究以确定各类造影剂的最大耐受量是必须的。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够应用于哺乳动物周围神经成像的方法，所使用的造影剂特异性强，克服现有神经荧光成像造影剂在神经和周围组织中摄取相当的问题，能够中手术过程中稳定导航，且安全性高。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是选择特异性强，能够中手术过程中稳定导航，且安全性高的造影剂，并将其应用于周围神经***的成像的方法。

本发明提供一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用方法，设计制备一种荧光共轭聚合物纳米探针，采用简单便捷的方法对哺乳动物周围神经实现高效的荧光成像，克服现有神经荧光成像造影剂在神经和周围组织中摄取相当的问题，能够实现在手术过程中对周围神经稳定导航，且安全性高。

一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，应用的方法包括以下步骤：

步骤1)制备荧光共轭聚合物纳米探针，荧光共轭聚合物纳米探针包括一般荧光共轭聚合物纳米探针和近红外荧光共轭聚合物纳米探针；

步骤2)将步骤1)得到的荧光共轭聚合物纳米探针配制成荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液；

步骤3)将步骤2)得到的荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液对哺乳动物周围神经成像，成像方式包括直接暴露方式成像和肌肉注射方式成像。

进一步地，步骤1)中一般荧光共轭聚合物纳米探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.1荧光共轭聚合物和表面配体分别溶于四氢呋喃中配置成共轭聚合物储备液和表面配体储备液；

步骤1.2在四氢呋喃中先后加入荧光共轭聚合物的储备液和表面配体的储备液，得到第一溶液体系；荧光共轭聚合物的储备液和表面配体的储备液的质量浓度比为0.8～1.2，水浴超声3～5分钟，得到混合溶液A；

步骤1.3在探头超声或者水浴超声的条件下，将混合液A加入到水相中，得到混合液B；

步骤1.4在混合液B中通入氮气，将混合液B中的有机溶剂除去得到一般荧光共轭聚合物纳米探针。

进一步地，步骤1)中近红外荧光共轭聚合物纳米探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.5荧光共轭聚合物、表面配体和近红外染料分别溶于四氢呋喃中配制成所述共轭聚合物储备液、所述表面配体和所述近红外染料储备液；

步骤1.6在所述四氢呋喃中先后加入所述荧光共轭聚合物的储备液、所述表面配体和近红外染料的储备液，得到第二溶液体系，所述荧光共轭聚合物和所述表面配体的质量浓度比为0.8～1.2，水浴超声3～5分钟，得到混合溶液C；；

步骤1.7在探头超声或者所述水浴超声的条件下，将混合液C加入到水相中，得到混合液D；

步骤1.8在混合液D中通入氮气，将混合液D中的有机溶剂除去，得到近红外荧光共轭聚合物纳米探针。

进一步地，荧光共轭聚合物包括聚[(9,9-二辛基芴基-2,7二基)-(1,4-苯并-{2,1'，3}-噻二唑)]10％苯并噻二唑(y)(PFBT)或聚(9,9-二辛基芴-共-苯并噻二唑)(F8BT)或聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-苯乙炔](MEH-PPV)；表面配体包括氨基端聚甲基丙烯酸甲酯(MMA-NH₂)或苯乙烯-聚乙二醇-羧基(PS-PEG-COOH)；

进一步地，探头超声的功率设置为10％～20％；水浴超声的功率为80～100W。

进一步地，步骤1.5中近红外染料包括2,3-萘酞菁硅双-(三己基甲硅烷基氧化物)(NIR775)；步骤1.6中每2mL的第二反应体系中近红外染料的含量为1～3μg。

进一步地，步骤3)中直接暴露方式成像的步骤如下：

通过外科手术将所述哺乳动物坐骨神经充分暴露；将步骤2)得到的荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液滴于暴露的坐骨神经上，进行孵育；孵育结束后，使用PBS对所述哺乳动物坐骨神经处充分冲洗，使用无尘纸轻轻吸净所述坐骨神经处的液体。

进一步地，荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液浓度为0.025mg/mL～0.25mg/mL；荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液的滴加体积为50μL～100μL；荧光共轭聚合物纳米探针水溶液滴于坐骨神经上的孵育时间为5min～60min。

进一步地，步骤3)肌肉注射方式成像的步骤如下：将荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液用超滤管浓缩2～50倍，对哺乳动物进行麻醉，待麻醉后，在哺乳动物一侧的小腿肌肉注射25～50μL探针溶液，30min～24h后可观察到探针对坐骨神经的清晰显像。

进一步地，荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液浓度为0.025mg/mL～0.25mg/mL。

进一步地，步骤1.1中的共轭聚合物储备液和表面配体储备液浓度为1mg/mL～4mg/mL。

进一步地，步骤1.5中的共轭聚合物储备液和表面配体储备液浓度为1mg/mL～4mg/mL。

进一步地，步骤1.2中第一溶液体系的体积为2mL(四氢呋喃和所述荧光共轭聚合物的储备液和所述表面配体的储备液),水浴超声的功率为80～100W，超声时间为3～5分钟。

进一步地，步骤1.6中第二溶液体系的体积为2mL(四氢呋喃、所述荧光共轭聚合物的储备液、所述表面配体的储备液和近红外荧光染料)。

进一步地，步骤1.3中的水相体积为10mL,探头超声的功率设置为10％～20％，每超声3秒停2秒，总超声时间为1分钟。

进一步地，步骤1.7中的水相体积为10mL,探头超声的功率设置为10％～20％，每超声3秒停2秒，总超声时间为1分钟。

在本发明的较佳实施方式中，实施例1详细说明荧光共轭聚合物纳米探针的制备以及性能表征；

在本发明的另一较佳实施方式中，实施例2详细说明荧光共轭聚合物纳米探针成像哺乳动物周围神经；

在本发明的另一较佳实施方式中，实施例3详细说明共轭聚合物纳米探针与小鼠坐骨神经结合位置的确定结果；

在本发明的另一较佳实施方式中，实施例4详细说明手术显微镜成像模拟临床术中导航过程。

本发明有益的技术效果如下：

(1)本发明提供一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，采用的荧光共轭聚合物纳米探针制备工艺简单；

(2)本发明采用的荧光共轭聚合物纳米探针集中于神经外膜及神经束膜标记神经，不损伤神经细胞，生物安全性高；

(3)本发明采用的荧光共轭聚合物纳米探针可实现对周围神经的高效可视化，而对神经周围的脂肪组织和皮肤组织无非特异性摄取，能够在复杂的手术环境中成功描绘神经形态；

(4)本发明提供一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，对小鼠周围神经成像的直接暴露方式成像，采用荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液滴加-孵育-清洗方法简单，操作便捷，有很强的临床应用价值；

(5)本发明提供一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，对小鼠周围神经成像还可以采用肌肉注射方式，对周围神经简单高效地成像。

(6)本发明提供一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，不仅对小鼠周围神经能简单高效地成像，还可以推广应用到一般哺乳动物，甚至人类的周围神经简单高效地成像。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例1的PFBT-COOH纳米探针和PFBT-NH₂纳米探针的紫外吸收光谱；

图2是本发明的一个较佳实施例1的PFBT-COOH纳米探针和PFBT-NH₂纳米探针的荧光发射光谱；；

图3是本发明的一个较佳实施例1的PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针的水合粒径分布图；

图4是本发明的一个较佳实施例1的PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的水合粒径分布图；

图5是本发明的一个较佳实施例2的PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针孵育小鼠坐骨神经不同时间后小鼠坐骨神经的活体荧光成像图；

图6是本发明的一个较佳实施例2的PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针成像小鼠坐骨神经的离体荧光成像图；

图7是本发明的一个较佳实施例2的PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针孵育小鼠坐骨神经不同时间后坐骨神经的荧光强度比较图；

图8是本发明的一个较佳实施例3的小鼠坐骨神经横切切片图；

图9是本发明的一个较佳实施例3的小鼠坐骨神经纵切切片图；

图10是本发明的一个较佳实施例3的小鼠坐骨神经免疫荧光染色图；

图11是本发明的一个较佳实施例4的模拟手术显微镜成像图；

其中，1-坐骨神经，2-肌肉，3-神经外膜，4-神经束膜。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1荧光共轭聚合物纳米探针的制备以及性能表征

取0.25mL浓度为1mg/mL的聚[(9,9-二辛基芴基-2,7二基)-(1,4-苯并-{2,1'，3}-噻二唑)]10％苯并噻二唑(y)(PFBT)溶液和0.25mL浓度为1mg/mL的氨基端聚甲基丙烯酸甲酯(MMA-NH₂)溶液加入到1.5mL四氢呋喃(THF)中，其中PFBT储存液及MMA-NH₂储存液均由THF作溶剂配置。将混合液水浴超声5分钟。在探头超声条件下，将上述混合液快速转移至10mL的去离子水中，探头超声1分钟。在45℃的条件下，通入N₂ 40分钟除尽溶液中的THF，制备得到0.025mg/mL的PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针。

取0.25mL浓度为1mg/mL的聚[(9,9-二辛基芴基-2,7二基)-(1,4-苯并-{2,1'，3}-噻二唑)]10％苯并噻二唑(y)(PFBT)溶液和0.25mL浓度为1mg/mL的苯乙烯-聚乙二醇-羧基(PS-PEG-COOH)溶液加入到1.5mL四氢呋喃(THF)中，其中PFBT储存液及PS-PEG-COOH储存液均由THF作溶剂配置。将混合液水浴超声5分钟。在探头超声条件下，将上述混合液快速转移至10mL的去离子水中，探头超声1分钟。再在45℃的条件下，通入N₂ 40分钟除尽溶液中的THF，制备得到0.025mg/mL的PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针。

图1、图2分别为PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，图中可以看出PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针在380nm左右有最大吸收，在540nm左右有最大发射，同时PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的最大吸收强度和最大荧光发射强度均高于PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针。

图3是PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针的水合粒径分布图，图4是PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的水合粒径分布图，从图中可以看出两种探针的水合粒径均在60nm左右，同时PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针的平均多分散指数(PDI)为0.108，PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的PDI为0.099，显示出较好的胶体稳定性。

实施例2荧光共轭聚合物纳米探针成像哺乳动物周围神经

荧光共轭聚合物纳米探针对哺乳动物周围神经成像的方式包括直接暴露方式成像和肌肉注射方式成像，分别说明如下：

1.直接暴露方式成像

通过去除覆盖于坐骨神经上的皮肤肌肉和脂肪组织，手术暴露小鼠坐骨神经。分别将荧光共轭聚合物纳米探针水溶液50μL滴于暴露的左坐骨神经和右坐骨神经位点，覆盖手术暴露区域的所有组织(神经，肌肉，脂肪和筋膜)，其中左坐骨神经滴加的是PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针水溶液，右坐骨神经滴加的是PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针水溶液，孵育一定时间后除去各探针水溶液，并用PBS冲洗整个染色区域十次以上，以去除任何未结合的荧光共轭聚合物纳米探针，使用无尘纸轻轻吸净坐骨神经处的液体。染色完成后获取整个染色区域的活体荧光图像。

图5是PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针成像小鼠坐骨神经的活体荧光图，从上至下依次为对照组(PBS孵育)坐骨神经活体荧光成像图，荧光共轭聚合物纳米探针孵育5min坐骨神经活体荧光成像图，荧光共轭聚合物纳米探针孵育30min坐骨神经活体荧光成像图，其中左坐骨神经孵育PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针，右坐骨神经孵育PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针。图5中可以看出，荧光共轭聚合物纳米探针以及其在周围神经成像中的应用方法对坐骨神经1有较好的成像效果，且在周围组织中(肌肉2和脂肪等)无显著非特异性摄取。

图6为对照组和实验组中小鼠坐骨神经在孵育时间为5min、30min和60min的离体荧光成像图，其中Ⅰ部分为对照组坐骨神经在缓冲液PBS中孵育后的离体荧光成像图，Ⅰ部分中左边为左坐骨神经，右边为右坐骨神经；Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ部分为坐骨神经在孵育时间为5min、30min和60min的离体荧光成像图，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ部分中左边为左坐骨神经孵育PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针，右边为右坐骨神经孵育PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针。图6中可以看出,PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针和PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针都可与坐骨神经稳定结合，实现示踪功能。

图7为孵育时间为5min、30min和60min的小鼠坐骨神经处平均荧光强度的量化，从图7中可以看出，在每个孵育时间段，小鼠坐骨神经中PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针的平均荧光强度均高于PFBT-COOH荧光共轭聚合物纳米探针。这与PFBT-NH₂纳米探针更好的脂溶性有关。同时，随着坐骨神经与探针共孵育时间的增加，两种探针在小鼠坐骨神经处的平均荧光强度均有增加。

2.肌肉注射方式成像

将荧光共轭聚合物纳米探针水溶液用超滤管浓缩2～50倍。对小鼠进行麻醉，待麻醉后，用胰岛素针在小鼠一侧的小腿肌肉注射25～50μL探针溶液，30min～24h后可观察到探针对坐骨神经的清晰显像。

实施例3共轭聚合物纳米探针与小鼠坐骨神经结合位置的确定

活体荧光成像结束后，将小鼠坐骨神经取出进行离体切片实验。OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后置于-80℃冰箱，冷冻4小时以上，将组织切成10μm厚的切片，然后进行HE染色，封片后对组织进行荧光成像。

图8、图9、图10为实验组坐骨神经离体组织切片图，图8是小鼠坐骨神经横切面荧光成像及HE染色成像图，图9是小鼠坐骨神经纵切面荧光成像及HE染色成像图，从图片结果中可以看出，探针主要聚集在神经外模3和神经束膜4中而未进入到神经细胞中。图10为坐骨神经免疫荧光染色图，其中DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)标记细胞核，MBP(髓磷脂碱性蛋白)标记神经细胞，PFBT为荧光共轭聚合物纳米探针信号通道，图10显示例荧光共轭聚合物纳米探针在神经外膜3和神经束膜4的聚集，免疫荧光成像结果进一步地证实探针未进入到神经细胞，暗示探针较高的生物安全性。

实施例4手术显微镜成像模拟临床术中导航

为了确认荧光共轭聚合物纳米探针在更具临床意义的环境中成像周围神经的可行性，我们使用荧光立体显微镜测试荧光共轭聚合物纳米探针成像周围神经的能力。具体手术方法如实施例2所述，其中小鼠左坐骨神经和右坐骨神经均孵育PFBT-NH₂荧光共轭聚合物纳米探针30min，相关操作结束后，使用荧光立体显微镜进行成像测试。

图11为模拟手术显微镜成像图，图11分别展示了，对照组(PBS孵育)立体荧光显微镜活体成像图和实验组(荧光共轭聚合物纳米探针孵育)立体荧光显微镜活体成像图,以及坐骨神经离体成像图。从图11中可以看出，手术环境下荧光共轭聚合物纳米探针可以清晰显示坐骨神经的形态及边界，有助于外科医生直观可视化辨别周围神经，具有巨大的临床应用价值。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：

步骤1)制备所述荧光共轭聚合物纳米探针，所述荧光共轭聚合物纳米探针包括一般荧光共轭聚合物纳米探针和近红外荧光共轭聚合物纳米探针；

步骤2)将步骤1)得到的荧光共轭聚合物纳米探针配制成荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液；

步骤3)将步骤2)得到的荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液对哺乳动物周围神经成像，所述成像方式包括直接暴露方式成像和肌肉注射方式成像。

2.如权利要求1所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述步骤1)中所述一般荧光共轭聚合物纳米探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.1所述荧光共轭聚合物和表面配体分别溶于四氢呋喃中配制成共轭聚合物储备液和所述表面配体储备液；

步骤1.2在所述四氢呋喃中先后加入所述荧光共轭聚合物的储备液和所述表面配体的储备液，得到第一溶液体系；所述荧光共轭聚合物和所述表面配体质量浓度比为0.8～1.2，水浴超声3～5分钟，得到混合溶液A；

步骤1.3在探头超声或者所述水浴超声的条件下，将所述混合液A加入到水相中，得到混合液B；

步骤1.4在所述混合液B中通入氮气，将所述混合液B中的有机溶剂除去得到所述一般荧光共轭聚合物纳米探针。

3.如权利要求2所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述步骤1)中所述近红外荧光共轭聚合物纳米探针的制备方法包括以下步骤：

步骤1.5所述荧光共轭聚合物、所述表面配体和近红外染料分别溶于所述四氢呋喃中配制成所述共轭聚合物储备液、所述表面配体储备液和所述近红外染料储备液；

步骤1.6在所述四氢呋喃中先后加入所述荧光共轭聚合物的储备液、所述表面配体储备液和所述近红外染料的储备液，得到第二溶液体系，所述荧光共轭聚合物和所述表面配体的所述质量浓度比为0.8～1.2，所述水浴超声3～5分钟，得到混合溶液C；

步骤1.7在探头超声或者所述水浴超声的条件下，将所述混合液C加入到所述水相中，得到混合液D；

步骤1.8在所述混合液D中通入所述氮气，将所述混合液D中的有机溶剂除去，得到所述近红外荧光共轭聚合物纳米探针。

4.如权利要求2或者3所述的所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述荧光共轭聚合物包括聚[(9,9-二辛基芴基-2,7二基)-(1,4-苯并-{2,1'，3}-噻二唑)]10％苯并噻二唑(y)(PFBT)或聚(9,9-二辛基芴-共-苯并噻二唑)(F8BT)或聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-苯乙炔](MEH-PPV)；所述表面配体包括氨基端聚甲基丙烯酸甲酯(MMA-NH₂)或苯乙烯-聚乙二醇-羧基(PS-PEG-COOH)。

5.如权利要求2或者3所述的所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述探头超声的功率设置为10％～20％；所述水浴超声的功率为80～100W。

6.如权利要求3所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述步骤1.5中所述近红外染料包括2,3-萘酞菁硅双-(三己基甲硅烷基氧化物)(NIR775)；所述步骤1.6中每2mL的所述第二反应体系中所述近红外染料的含量为1～3μg。

7.如权利要求1所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述步骤3)中所述直接暴露方式成像的步骤如下：

通过外科手术将所述哺乳动物坐骨神经充分暴露；将步骤2)得到的荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液滴于暴露的坐骨神经上，进行孵育；所述孵育结束后，使用PBS对所述哺乳动物坐骨神经处充分冲洗，使用无尘纸轻轻吸净所述坐骨神经处的液体。

8.如权利要求7所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液浓度为0.025mg/mL～0.25mg/mL；所述荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液的滴加体积为50μL～100μL；所述荧光共轭聚合物纳米探针水溶液滴于坐骨神经上的孵育时间为5min～60min。

9.如权利要求1所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述步骤3)所述肌肉注射方式成像的步骤如下：将所述荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液用超滤管浓缩2～50倍，对所述哺乳动物进行麻醉，待麻醉后，在所述哺乳动物一侧的小腿肌肉注射25～50μL探针溶液，30min～24h后可观察到探针对所述坐骨神经的清晰显像。

10.如权利要求9所述的一种荧光共轭聚合物纳米探针在周围神经成像中的应用，其特征在于，所述荧光共轭聚合物纳米探针胶体水溶液浓度为0.025mg/mL～0.25mg/mL。

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