CN112004936A - 麦角硫因生产方法 - Google Patents

麦角硫因生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112004936A
CN112004936A CN201980027473.1A CN201980027473A CN112004936A CN 112004936 A CN112004936 A CN 112004936A CN 201980027473 A CN201980027473 A CN 201980027473A CN 112004936 A CN112004936 A CN 112004936A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
protein
bacterium
seq
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980027473.1A
Other languages
English (en)
Inventor
仲谷豪
仲岛菜菜实
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagase and Co Ltd
Original Assignee
Nagase and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagase and Co Ltd filed Critical Nagase and Co Ltd
Publication of CN112004936A publication Critical patent/CN112004936A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了用于以低成本以高产率生产麦角硫因的方法和用于所述方法中的细菌。所述方法经设计以生产麦角硫因、其相关物质或这些的混合物，并且特征在于包括在培养基中培养能够生产麦角硫因的肠杆菌科细菌，并且从培养基或培养的细胞中收集麦角硫因、其相关物质或这些的混合物，并且其中所述细菌是经修饰以便降低包含具有5个氨基酸Ser‑Arg‑Gly‑Arg‑Thr（SEQ ID NO：7）的核心序列区的蛋白质的活性的菌株。这种细菌是肠杆菌科细菌，其能够生产麦角硫因，并且经修饰以便降低包含具有5个氨基酸Ser‑Arg‑Gly‑Arg‑Thr（SEQ ID NO：7）的核心序列区的蛋白质的活性。

Description

麦角硫因生产方法
技术领域
本发明涉及使用属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，用于生产麦角硫因或其相关物质或其混合物的方法。本发明通过对具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌进行修饰以降低给定蛋白质的活性，增强了所述细菌的所述能力。
背景技术
麦角硫因是一种含硫氨基酸，并且已知具有各种生理活性，例如抗氧化能力。还提出其抗氧化能力高于维生素C、维生素E、半胱氨酸和谷胱甘肽的抗氧化能力。还已显示麦角硫因具有紫外线吸收效应，黑色素产生抑制活性，对活性氧种类的清除能力，压制皱纹和下垂形成的弹性蛋白酶活性抑制活性，以及压制斑点形成的酪氨酸酶活性抑制活性。因此，麦角硫因是尤其在化妆品和食品工业领域受到大量关注的化合物之一。
麦角硫因在某些微生物，尤其是担子菌纲中很丰富，并且也以痕量存在于植物和动物中。尽管哺乳动物不能生物合成麦角硫因，但提出它们可以通过食用蘑菇（包括担子菌纲），将麦角硫因吸收到体内，并且麦角硫因在许多器官（例如表皮、脑、肝脏、肾脏、脊髓和眼）中积累，以保护细胞。为了生产麦角硫因，已知用于培养和提取微生物如担子菌纲的方法、以及用于有机合成的方法（参照专利参考文献1和2）。然而，由于各种原因，例如其低生产率、用于培养微生物的长时间段、由于其在细胞内的积累而从细胞内提取的复杂制造过程、以及在改善微生物方面的困难，用于从担子菌纲中提取的方法尚未广泛使用。另外，由于各种原因，例如多步反应的复杂性、可能使用有害原料、以及由于使用昂贵原料导致的高成本，有机合成方法尚未广泛使用。已开发了使用过表达麦角硫因生物合成基因的微生物或具有麦角硫因生产能力的微生物（其中组氨酸解氨酶活性得到降低或消除，或者组氨酸解氨酶基因的表达得到降低或消除）的发酵生产方法，但需要用于生产麦角硫因的更有效方法（专利参考文献3）。
[现有技术]
[专利参考文献]
专利参考文献1：JP 2006-160748
专利参考文献2：JP 2007-300916
专利参考文献3：WO2017150304
发明公开内容
（本发明要解决的技术问题）
如上所述，在现有条件下，麦角硫因是昂贵的并且其供应是成问题的。因此，需要用于以低成本以大数量生产麦角硫因的方法。
（解决问题的手段）
本发明人已进行深入研究以解决上述问题，并且结果是，已惊讶地发现，通过修饰具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌，以便降低给定蛋白质的活性，可以显著增加麦角硫因的生产水平，从而完成了本发明。
即，本发明提供了使用属于肠杆菌科的细菌，用于生产麦角硫因或其相关物质或其混合物的方法，并且通过对具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌进行修饰来降低给定蛋白质的活性，增强了所述细菌的所述能力。
因此，本发明提供了下述内容。
[1]一种用于生产麦角硫因或其相关物质或其混合物的方法，其包括在培养基中培养具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌，并且从培养基或通过培养获得的细胞中收集麦角硫因或其相关物质或其混合物，其中所述细菌是经修饰以便具有降低的蛋白质活性的细菌，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区。
[2] [1]的方法，其中所述核心序列区具有以下序列：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）。
[3] [2]的方法，其中所述核心序列区是具有选自下述（1）至（3）的氨基酸残基的序列：
（1）X15aa是Leu或Ile；
（2）X16aa是Ile或Val；
（3）X17aa是Ile或Val。
[4] [1]的方法，其中所述包含核心序列区的蛋白质是BetT蛋白或CaiT蛋白或两者，其中所述BetT蛋白是下文（a）、（b）或（c）的蛋白质，并且其中所述CaiT蛋白是下文（d）、（e）或（f）的蛋白质：
（a）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（b）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（c）包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质；
（d）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（e）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（f）包含与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[5] [1]至[4]中任一项的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
[6] [5]的方法，其中所述麦角硫因生物合成基因包含以下中的任何一种或多种：与耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因，与粟酒裂殖酵母（Shizosaccaromyces pombe）的Egt1或Egt2相对应的基因，与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的Egt1或Egt2相对应的基因，与泥生绿菌（Chlorobium limicola）的eanA或eanB相对应的基因。
[7] [1]至[6]中任一项的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是属于埃希氏菌属（Escherichia）的细菌。
[8] [7]的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是大肠杆菌（Escherichia coli）。
[9]一种具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区。
[10] [9]的细菌，其中所述核心序列区具有以下序列：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）。
[11] [10]的细菌，其中所述核心序列区是具有选自下述（1）至（3）的氨基酸残基的序列：
（1）X15aa是Leu或Ile；
（2）X16aa是Ile或Val；
（3）X17aa是Ile或Val。
[12] [9]的细菌，其中所述包含核心序列区的蛋白质是BetT蛋白或CaiT蛋白或两者，其中所述BetT蛋白是下文（a）、（b）或（c）的蛋白质，并且其中所述CaiT蛋白是下文（d）、（e）或（f）的蛋白质：
（a）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（b）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（c）包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质；
（d）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（e）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（f）包含与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[13] [9]至[12]中任一项的细菌，其中所述细菌是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
[14] [13]的细菌，其中所述麦角硫因生物合成基因包含以下中的任何一种或多种：与耻垢分枝杆菌的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因，与粟酒裂殖酵母的Egt1或Egt2相对应的基因，与粗糙脉孢菌的Egt1或Egt2相对应的基因，与泥生绿菌的eanA或eanB相对应的基因。
[15] [9]至[14]中任一项的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
[16] [15]的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌。
发明效果
本发明已使得能够以低成本以大数量生产具有各种生理活性，例如有力的抗氧化剂活性的麦角硫因。
附图简述
图1是显示了关于麦角硫因发酵生产的测试结果（在培养72小时后）的图，所述麦角硫因发酵生产使用生产麦角硫因的大肠杆菌MG1655/pACG-EGT。“外”和“内”分别指示了培养基中和细胞内的EGT含量。
图2是显示了关于麦角硫因发酵生产的测试结果（在培养96小时后）的图，所述麦角硫因发酵生产使用pACG-EGT引入其内的betT基因破坏的菌株和caiT基因破坏的菌株。“外”和“内”分别指示了培养基中和细胞内的EGT含量。
图3是显示了关于麦角硫因发酵生产的测试结果（培养基中的EGT生产水平的时间过程）的图，所述麦角硫因发酵生产使用pACG-EGT引入其内的betT基因破坏的菌株和caiT基因破坏的菌株。
图4是显示了关于麦角硫因发酵生产的测试结果的图，所述麦角硫因发酵生产使用pACG_egtD-eanB引入其内的betT基因破坏的菌株和caiT基因破坏的菌株，所述图显示了在用pACG_egtD-eanB转化的MG1655、ΔbetT和ΔcaiT菌株的培养物（48小时培养物）中积累的EGT生产水平。
实施本发明的最佳模式
（发明的详细说明）
在第一个方面，本发明涉及用于生产麦角硫因（以下也称为"EGT"）或其相关物质或其混合物的方法，其包括在培养基中培养具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，并且从培养基或通过培养获得的细胞中收集EGT或其相关物质或其混合物，其中所述细菌是经修饰以便具有给定蛋白质的活性降低的细菌。根据本发明，通过进行导致具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌中给定蛋白质的活性降低的修饰，EGT生产水平可以得到显著增加。
根据本发明，对具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌进行修饰，以便增加所述细菌的培养物中的EGT生产水平。具体地，进行所述修饰使得细菌具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区。
如上文提到的包含核心序列区的蛋白质可以是包含以下序列作为核心序列区的蛋白质：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）。核心序列区优选是具有选自下述（1）至（3）的氨基酸残基的序列：
（1）X15aa是Leu或Ile；
（2）X16aa是Ile或Val；
（3）X17aa是Ile或Val。
此外，如上文提到的包含核心序列区的蛋白质可以是包含以下序列作为核心序列区的蛋白质：
X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa
其中X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa和X19aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：9）。核心序列区优选是具有选自下述（1）至（19）的氨基酸残基的序列：
（1）X1aa是Glu、Ser或Gly；
（2）X2aa是Leu、Val或Ser；
（3）X3aa是Phe或Leu；
（4）X4aa是Phe或Tyr；
（5）X5aa是Ala或Gly；
（6）X6aa是Val、Leu或Ile；
（7）X7aa是Ala、Ser或Ile；
（8）X8aa是Trp或Tyr；
（9）X9aa是Ser或Ala；
（10）X10aa是Pro或Ile；
（11）X11aa是Phe或Gln；
（12）X12aa是Val或Met；
（13）X13aa是Gly或Ser；
（14）X14aa是Leu、Met或Ile；
（15）X15aa是Leu或Ile；
（16）X16aa是Ile或Val；
（17）X17aa是Ile或Val；
（18）X18aa是Gln或Glu；
（19）X19aa是Phe或Leu。
包含核心序列区的蛋白质的具体实例包括BetT蛋白和CaiT蛋白，其中所述BetT蛋白是下文（a）、（b）或（c）的蛋白质，并且其中所述CaiT蛋白是下文（d）、（e）或（f）的蛋白质：
（a）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（b）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（c）包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质；
（d）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（e）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（f）包含与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质。
包含核心序列区的蛋白质优选是包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多、95%或更多、或者98%或更多同一性的氨基酸序列的BetT蛋白，包含与SEQ IDNO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多、95%或更多、或者98%或更多同一性的氨基酸序列的CaiT蛋白。
如本文使用的，“一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加”意指1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加，优选1、2、3、4、5或6个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加，更优选1、2、3或4个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加。
如本文使用的，“EGT的相关物质”意指EGT类似物，并且包括氧化的EGT、烷基化的EGT等等。氧化的EGT的具体实例包括麦角硫因次磺酸、麦角硫因亚磺酸、麦角硫因磺酸、二硫化物结合的EGT、混合二硫化物EGT、组氨酸甜菜碱等等。烷基化的EGT的实例包括S-甲基-麦角硫因等等。已报道如上文提到的氧化的EGT和烷基化的EGT经由细胞内代谢反应、或者在培养基中与氧或氧化剂的氧化反应，由麦角硫因生成（在L. Servillo等人，Free.Radic. Biol. Med.，2015，79，228-36，以及R. M. Y. Tang等人，Sci. Rep.，2018，8（1），1601中描述）。另外，EGT类似物包括麦角硒因(selenoneine)等等。
通过对具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌进行上述修饰，即，允许包含给定核心序列区的蛋白质的活性降低的修饰，使得可能显著增加EGT生产水平。
用于本发明的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌是经修饰以便具有降低的蛋白质活性的细菌，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ IDNO：7）作为其一部分的核心序列区；经修饰以便具有降低的蛋白质活性的细菌，所述蛋白质包含以下序列作为核心序列区：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）；或经修饰以便具有降低的蛋白质活性的细菌，所述蛋白质包含以下序列作为核心序列区：
X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa
其中X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa和X19aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：9）；优选经修饰以便具有降低的BetT蛋白或CaiT蛋白或包含与BetT蛋白或CaiT蛋白的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质的活性的细菌。与其亲本菌株相比，BetT蛋白或CaiT蛋白的活性降低率优选为50%或更少，更优选25%或更少，甚至更优选10%或更少。具有BetT蛋白或CaiT蛋白的活性消除的细菌是最优选的。具有BetT蛋白或CaiT蛋白的活性消除的细菌是其中完全没有检测到BetT蛋白或CaiT蛋白的活性的细菌。换言之，具有BetT蛋白或CaiT蛋白的活性降低或消除的细菌是其中BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达得到降低或消除的细菌。与其亲本菌株相比，BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达降低率优选为50%或更少，更优选25%或更少，甚至更优选10%或更少。具有BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达消除的细菌是最优选的。具有BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达消除的细菌是其中完全没有检测到BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达的细菌。BetT蛋白或CaiT蛋白的活性以及BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达可以通过已知方法进行测量，所述已知方法例如RNA印迹、RT-PCR、实时PCR和蛋白质印迹。
用于降低或消除BetT蛋白或CaiT蛋白的活性的方法、以及用于降低或消除BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的表达的方法也是已知的，并且包括但不限于例如通过同源重组、突变处理、基因组编辑等敲除或敲减BetT蛋白或CaiT蛋白的基因，向细菌施用抑制BetT蛋白或CaiT蛋白的物质等等。另外，本发明中待使用的细菌可以是其中BetT蛋白或CaiT蛋白的活性由于天然突变而降低或消除的细菌。
用于本发明的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌优选是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
EGT生物合成基因是编码涉及EGT生物合成的酶的基因。涉及EGT生物合成的酶和EGT生物合成基因是已知的，并且对于一些基因，其核苷酸序列也是已知的。本领域技术人员可以适当地选择此类EGT生物合成基因。待增强的EGT生物合成基因包括但不限于，例如与耻垢分枝杆菌的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因中的一种或多种，与粟酒裂殖酵母的Egt1或Egt2相对应的基因中的任一种或两者，与粗糙脉孢菌的Egt1或Egt2相对应的基因中的任一种或两者，与泥生绿菌的eanA或eanB相对应的基因中的任一种或两者。关于分枝杆菌属（Mycobacterium）的EGT生物合成基因，可以参考F. P. Seebeck，J. Am.Chem. Soc.，2010，132，6632-6633。关于裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）的EGT生物合成基因，可以参考T. Pluskal等人，PLOS ONE.，2014，9（5），e97774。关于脉孢菌属（Neurospora）的EGT生物合成基因，可以参考W. Hu等人，Org. Lett.，2014，16，5382-5385。另外，关于链霉菌属（Streptomyces）的EGT生物合成基因，可以参考S. Nakajima等人，J.Biosci. Bioeng.，2015，120，294-298。关于绿菌属（Chlorobium）的EGT生物合成基因，可以参考R. Burn等人，Angew. Chem. Int. Edit.，2017，56，12508–12511。关于各种微生物的EGT生物合成基因，可以参考G. W. Jones等人，Gene，2014，549，161-170。
“增强基因的表达”意指给定基因的表达水平高于亲本菌株的表达水平。表达水平优选是亲本菌株或野生菌株的表达水平的两倍或更多倍，更优选五倍或更多倍，甚至更优选十倍或更多倍。基因表达的定量可以通过已知方法执行，所述已知方法例如RNA印迹或实时PCR。
“相对应的基因”是相对于编码催化在给定微生物的EGT生物合成途径中的反应的酶的基因，编码催化在EGT生物合成途径中与给定微生物中的反应相同或相似的反应的酶的另一种微生物的基因。给定的基因和相对应的基因可以具有相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列。例如，给定的基因和相对应的基因可以具有50%或更多、70%或更多、80%或更多、或者90%或更多的核苷酸序列同一性。此外，由给定的基因编码的酶蛋白和由相对应的基因编码的酶蛋白可以具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。例如，由给定的基因编码的酶蛋白和由相对应的基因编码的酶蛋白可以具有50%或更多、70%或更多、80%或更多、或者90%或更多的氨基酸序列同一性。
EGT生物合成基因的表达可以通过使用用于增强基因表达的已知方法得到增强。最常用的方法是将EGT生物合成基因置于具有有力表达的启动子的控制下。例如，EGT生物合成基因的表达可以通过以下得到增强：将掺入适合于表达EGT生物合成基因的启动子和EGT生物合成基因的表达载体引入微生物内，或者通过同源重组将EGT生物合成基因掺入宿主基因组内等。对于载体，可以使用质粒载体或病毒载体。当构建载体时，可以适当地选择和使用载体的组成成分元件，例如启动子、终止子、标记物基因例如药物抗性基因或代谢酶基因。用于将基因引入细菌内的方法也是已知的。待引入的基因可以直接引入细菌内，或在掺入载体内之后引入细菌内。用于引入基因的方法的实例包括脂转染、磷酸钙、使用聚合物、电穿孔、粒子枪等，并且可以根据引入基因的细菌类型和待引入的基因，适当地选择这些方法。为了增强EGT生物合成基因的表达，还可以通过缺失基因组上的特定基因或区域，来诱导内源性EGT生物合成基因的表达。
用于增强EGT生物合成基因表达的方法并不限于上述方法。另外，用于本发明中的细菌可以是由于天然突变而具有EGT生物合成基因的增强表达的细菌。EGT生物合成基因的增强表达可以通过已知方法确认，所述方法例如RNA印迹或实时PCR。可替代地，可以通过实际培养细菌，并且定量细胞内部或外部（在培养液中）产生的EGT，来确认EGT生物合成基因的增强表达。
待就其在细菌中的表达而被增强的EGT生物合成基因可以具有一种类型或者两种或更多种类型。编码涉及EGT生物合成的多重酶的一组基因可以作为簇引入细菌内。可以引入来自不同属或物种的微生物的EGT生物合成基因，以增强表达，或者可以引入来自相同属或物种的微生物的EGT生物合成基因，以增强表达。优选引入来自相同属或相关属的EGT生物合成基因，以增强表达。优选引入来自相同物种或相关物种的EGT生物合成基因，以增强表达。更优选引入来自相同物种的EGT生物合成基因，以增强表达。
用于本发明的具有EGT产生能力的属于肠杆菌科的细菌包括但不限于埃希氏菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和沙门氏菌属（Salmonella）的细菌。特别优选的肠杆菌包括埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、泛菌属(例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis))等等的那些。
在本发明的用于生产EGT的方法中，属于肠杆菌科的细菌的培养可以通过普通方法进行。具体地，可以使用LB培养基、2×YT培养基、NZY培养基、M9培养基、SOC培养基、YPD培养基等等。上述培养基可以用于产生EGT，但待使用的培养基并不限于此。产生的EGT可以在细胞内部积累，或者可以在细胞外部（在培养液中）分泌和积累。
细胞内部的EGT或从细胞中释放的EGT可以通过已知方法进行收集。例如，可以使培养物经受固液分离例如离心或过滤，并且可以通过溶剂提取、热水提取、破碎处理等等，从细胞内部获得EGT提取物。从EGT提取物或培养物上清液中，可以通过已知的色谱法，如离子交换色谱法、疏水色谱法和凝胶过滤色谱法获得EGT。
在第二个方面，本发明涉及具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其根据本发明经修饰以便具有给定蛋白质的降低活性。
根据本发明经修饰以便具有给定蛋白质的降低活性的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌是具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区；具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包含以下序列作为核心序列区：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）；或具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包含以下序列作为核心序列区：
X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa
其中X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa和X19aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：9）；优选具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的BetT蛋白或CaiT蛋白或包含与BetT蛋白或CaiT蛋白的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质的活性。BetT蛋白或CaiT蛋白的活性降低如上所述。
根据本发明经修饰以便具有给定蛋白质的降低活性的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌优选是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
根据本发明经修饰以便具有给定蛋白质的降低活性并且经修饰以便增强EGT生物合成基因的表达的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌优选是但不限于，通过增强与耻垢分枝杆菌的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因中的一种或多种，与粟酒裂殖酵母的Egt1或Egt2相对应的基因中的任一种或两者，或者与粗糙脉孢菌的Egt1或Egt2相对应的基因中的任一种或两者，经修饰以便增强EGT生物合成基因的表达的细菌。
根据本发明经修饰以便具有给定蛋白质的降低活性的具有EGT生产能力的属于肠杆菌科的细菌可以是但不限于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属和沙门氏菌属的细菌，并且最优选埃希氏菌属例如大肠杆菌、泛菌属例如菠萝泛菌等等。
本发明通过下述实施例更详细地且具体地加以解释，所述实施例并不预期限制本发明的范围。除非另有说明，否则使用在用于分子生物学和应用微生物学的标准方案集合中描述的方法、或者其改良或改变的方法进行实验。另外，除非另有说明，否则“%”表示“w/v%”。
[实施例1]
用于EGT生产（egt1-2）的载体的构建：
为了在大肠杆菌中生产EGT，构建了用于EGT生产的下述载体。作为EGT生物合成基因，使用来自粟酒裂殖酵母的egt1（SPBC1604.01：SEQ ID NO：1）和egt2（SPBC660.12c：SEQ IDNO：2）。使用含有序列表中所示的EGT生物合成基因egt1和egt2的载体作为模板，使用表1中所示的引物扩增egt1和egt2。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
作为表达载体，使用pACG，其中将具有p15A复制起点的表达载体的启动子修饰为来自大肠杆菌的gapA基因的启动子，并且将药物抗性标记物改变为四环素抗性基因。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Takara Bio Inc.），将egt1和egt2的PCR产物连接到紧接pACG的启动子下游的HindIII-BamHI位点，以构建作为用于EGT生产的载体的pACG-EGT。In-Fusion反应根据由Takara Bio Inc.提供的方案来执行。
MG1655菌株（ATCC保藏号：700926）用作大肠杆菌的野生菌株，并且使用构建的pACG-EGT执行转化，以得到EGT生产菌株（MG1655/pACG-EGT）。
[实施例2]
在大肠杆菌中测试EGT生产：
使用实施例1中构建的EGT生产菌株MG1655/pACG-EGT，进行用于EGT发酵生产的测试。通过将空载体pACG引入MG1655菌株内获得的MG1655/pACG用作对照菌株。将MG1655/pACG和MG1655/pACG-EGT的各自甘油原液加入试管中，所述试管含有在3 mL LB培养基（在1L培养基中多聚蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g）中的四环素（最终浓度为10 μg/mL），使其经受在37℃下以200 rpm的振荡培养15-18小时，直至达到稳定期，以得到预培养液。此外，将预培养液加入在500 mL带挡板培养瓶中的50 mL 2 × TY培养基（在1 L培养基中多聚蛋白胨16 g、酵母提取物10 g、NaCl 5 g、葡萄糖5%、L-组氨酸5 mM、L-胱氨酸2.5 mM、L-甲硫氨酸5 mM、四环素10 μg/mL）中，以得到OD=0.4，通过在37℃下以160 rpm振荡96小时使其经受充分培养。
如下所述执行EGT的定量。在充分培养期间，在培养开始后的24、48、72和96小时，收集1 mL培养液，以评估培养样品。在测量收集的培养液的微生物细胞浊度（OD600）之后，以14000 rpm执行离心10分钟，以将细胞外培养液和沉淀物（细胞）分开。使沉淀物经受热水提取（60℃，10分钟），以提取细胞内组分，用作细胞内样品。通过HPLC测量细胞内样品和分开的细胞外培养液（细胞外样品）中的EGT含量。HPLC测量的条件如下表2中所示，并且基于在约10分钟的保留时间生成的EGT峰值执行定量。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
作为培养测试的结果，在培养72小时后，EGT生产未由对照菌株MG1655/pACG得到确认，但EGT的峰值可以在MG1655/pACG-EGT培养液和细胞内提取物中得到确认，以确认EGT合成基因依赖性EGT生产（图1）。
[实施例3]
在ΔbetT和ΔcaiT中测试EGT生产：
接下来，使用betT和caiT的各自基因破坏菌株，进行用于EGT发酵生产的测试。通过同源重组的已知方法，使用分别含有betT基因和caiT基因的上游序列和下游序列的反选择载体（包括sacB基因和药物抗性基因），以破坏大肠杆菌MG1655菌株中的相应基因，构建了betT基因破坏菌株（ΔbetT）和caiT基因破坏菌株（ΔcaiT）。对于上文提到的破坏菌株的构建，可以参考M. S. Donnenberg和J. S. Kaper，Infect. Immun.，1991，4310-4317，H.Mizoguchi等人，Biosci. Biotechnol. Biochem.，2007，71（12），2905–2911等等。用pACG-EGT转化构建的ΔbetT和ΔcaiT，以得到ΔbetT/pACG-EGT和ΔcaiT/pACG-EGT。作为对照菌株，在下述培养测试中使用实施例2中构建的MG1655/pACG-EGT。
如实施例2中所述执行培养和EGT分析。作为培养测试的结果，在培养开始后96小时，在培养液中的EGT生产水平导致与野生菌株相比，在两种基因破坏菌株中细胞内和细胞外均令人惊讶地显著增加，ΔbetT/pACG-EGT增加到约8.6倍（细胞内12.3倍），并且ΔcaiT/pACG-EGT增加到约4.6倍（细胞内3.75倍）（图2和3）。
[实施例4]
用于EGT生产（egtD-eanB）的载体的构建：
使用来自厌氧细菌的EGT合成基因构建用于生产的载体。除由egtD基因编码的酶之外，由在厌氧细菌中发现的eanB基因编码的酶在大肠杆菌中的表达，允许利用来自硫代硫酸根离子的硫生物合成EGT。对于egtD基因，使用通过密码子优化来自天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）的氨基酸序列而获得的核苷酸序列（SEQ ID NO：12），所述天蓝色链霉菌被分类到与耻垢分枝杆菌相同的放线菌目（Actinomycetales）内，并且对于eanB基因，使用通过密码子优化来自厌氧细菌泥生绿菌的氨基酸序列而获得的核苷酸序列（SEQ ID NO：13）。上述两种基因是人工合成的。对于载体，使用实施例1中构建的pACG-EGT。用限制性酶HindIII-BamHI处理载体pACG-EGT，以切割egt1基因，并且通过连接将人工合成的egtD基因与HindIII-BamHI位点相连。对于egtD基因克隆的载体进一步用NheI-XbaI进行处理，以切割egt2，并且通过连接将eanB基因与NheI-XbaI位点相连，以构建pACG_egtD-eanB，其中egtD-eanB克隆到gapA启动子的下游。
[实施例5]
使用用于EGT生产（egtD-eanB）的载体测试EGT生产：
用实施例4中构建的pACG_egtD-eanB转化三种大肠杆菌菌株，MG1655以及实施例3中制备的ΔbetT和ΔcaiT，并且将所获得的菌株用于下述EGT生产测试中。
在如实施例2中所述的充分培养条件下，使用10 mM硫代硫酸钠代替2.5 mM胱氨酸，进行使用制备的三种菌株的生产测试。结果，即使当egtD-eanB基因在用于EGT生产的载体中使用时，与野生菌株相比，在培养开始后48小时，EGT生产率在ΔbetT和ΔcaiT菌株中得到显著改善（图4）。
SEQ ID NO：1是来自粟酒裂殖酵母的egt1基因（SPBC1604.01）的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是来自粟酒裂殖酵母的egt2基因（SPBC660.12c）的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是用于扩增来自粟酒裂殖酵母的egt1基因（SPBC1604.01）的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是用于扩增来自粟酒裂殖酵母的egt1基因（SPBC1604.01）的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是用于扩增来自粟酒裂殖酵母的egt2基因（SPBC660.12c）的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是用于扩增来自粟酒裂殖酵母的egt2基因（SPBC660.12c）的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是核心序列区共有的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是核心序列区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是核心序列区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是BetT蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是CaiT蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是对于大肠杆菌通过密码子优化来自天蓝色链霉菌的EgtD蛋白的氨基酸序列而获得的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是对于大肠杆菌通过密码子优化来自泥生绿菌的EanB蛋白的氨基酸序列而获得的核苷酸序列。
工业适用性
本发明的用于生产麦角硫因或其相关物质或其混合物的方法，允许以低成本以大数量生产具有各种生理活性，例如有力的抗氧化剂活性的麦角硫因。
Figure IDA0002737034930000011
Figure IDA0002737034930000021
Figure IDA0002737034930000031
Figure IDA0002737034930000041
Figure IDA0002737034930000051
Figure IDA0002737034930000061
Figure IDA0002737034930000071
Figure IDA0002737034930000081
Figure IDA0002737034930000091
Figure IDA0002737034930000101

Claims (16)

1.一种用于生产麦角硫因或其相关物质或其混合物的方法，其包括在培养基中培养具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，并且从培养基或通过培养获得的细胞中收集麦角硫因或其相关物质或其混合物，其中所述细菌是经修饰以便具有降低的蛋白质活性的细菌，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区。
2.权利要求1的方法，其中所述核心序列区具有以下序列：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）。
3.权利要求2的方法，其中所述核心序列区是具有选自下述（1）至（3）的氨基酸残基的序列：
（1）X15aa是Leu或Ile；
（2）X16aa是Ile或Val；
（3）X17aa是Ile或Val。
4.权利要求1的方法，其中所述包含核心序列区的蛋白质是BetT蛋白或CaiT蛋白或两者，其中所述BetT蛋白是下文（a）、（b）或（c）的蛋白质，并且其中所述CaiT蛋白是下文（d）、（e）或（f）的蛋白质：
（a）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（b）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（c）包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质；
（d）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（e）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（f）包含与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
6.权利要求5的方法，其中所述麦角硫因生物合成基因包含以下中的任何一种或多种：与耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因，与粟酒裂殖酵母(Shizosaccaromyces pombe)的Egt1或Egt2相对应的基因，与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的Egt1或Egt2相对应的基因，与泥生绿菌(Chlorobium limicola)的eanA或eanB相对应的基因。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。
8.权利要求7的方法，其中所述具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。
9.一种具有麦角硫因生产能力的属于肠杆菌科的细菌，其经修饰以便具有降低的蛋白质活性，所述蛋白质包括包含5个氨基酸残基：Ser-Arg-Gly-Arg-Thr（SEQ ID NO：7）作为其一部分的核心序列区。
10.权利要求9的细菌，其中所述核心序列区具有以下序列：
Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg
其中X15aa、X16aa和X17aa是任意氨基酸残基（SEQ ID NO：8）。
11.权利要求10的细菌，其中所述核心序列区是具有选自下述（1）至（3）的氨基酸残基的序列：
（1）X15aa是Leu或Ile；
（2）X16aa是Ile或Val；
（3）X17aa是Ile或Val。
12.权利要求9的细菌，其中所述包含核心序列区的蛋白质是BetT蛋白或CaiT蛋白或两者，其中所述BetT蛋白是下文（a）、（b）或（c）的蛋白质，并且其中所述CaiT蛋白是下文（d）、（e）或（f）的蛋白质：
（a）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（b）包含SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（c）包含与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质；
（d）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质；
（e）包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的蛋白质，其中一个至几个氨基酸残基被取代、缺失、***或添加；
（f）包含与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有90%或更多同一性的氨基酸序列的蛋白质。
13.权利要求9至12中任一项的细菌，其中所述细菌是经修饰以便增强麦角硫因生物合成基因的表达的细菌。
14.权利要求13的细菌，其中所述麦角硫因生物合成基因包含以下中的任何一种或多种：与耻垢分枝杆菌的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相对应的基因，与粟酒裂殖酵母的Egt1或Egt2相对应的基因，与粗糙脉孢菌的Egt1或Egt2相对应的基因，与泥生绿菌的eanA或eanB相对应的基因。
15.权利要求9至14中任一项的细菌，其中所述细菌是属于埃希氏菌属的细菌。
16.权利要求15的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌。
CN201980027473.1A 2018-02-23 2019-02-19 麦角硫因生产方法 Pending CN112004936A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018031164 2018-02-23
JP2018-031164 2018-02-23
PCT/JP2019/006089 WO2019163767A1 (ja) 2018-02-23 2019-02-19 エルゴチオネインの製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112004936A true CN112004936A (zh) 2020-11-27

Family

ID=67686798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980027473.1A Pending CN112004936A (zh) 2018-02-23 2019-02-19 麦角硫因生产方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11098330B2 (zh)
EP (1) EP3751001B9 (zh)
JP (1) JP6948453B2 (zh)
CN (1) CN112004936A (zh)
ES (1) ES2948261T3 (zh)
TW (1) TWI820088B (zh)
WO (1) WO2019163767A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114262702A (zh) * 2021-12-31 2022-04-01 西南大学 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法
CN114667346A (zh) * 2019-11-27 2022-06-24 南京纽邦生物科技有限公司 EanB酶突变体及其应用
CN115851655A (zh) * 2022-12-30 2023-03-28 华熙生物科技股份有限公司 酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法
CN116790538A (zh) * 2023-06-07 2023-09-22 深圳希吉亚生物技术有限公司 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6864131B1 (ja) * 2020-03-04 2021-04-28 長瀬産業株式会社 Ｌ−エルゴチオネイン含有組成物
CN114107326A (zh) * 2020-09-01 2022-03-01 中国科学院微生物研究所 两个麦角硫因合成蛋白质及其在麦角硫因合成中的应用
US20240141396A1 (en) 2021-03-01 2024-05-02 Nagase & Co., Ltd. Ergothioneine production method
JP7240565B2 (ja) * 2021-04-14 2023-03-15 長瀬産業株式会社 Ｌ－エルゴチオネイン含有組成物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015168112A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Conagen, Inc. Microbial ergothioneine biosynthesis
JP2016502859A (ja) * 2012-12-21 2016-02-01 ピンフア リウ 代謝工学によるエルゴチオネイン生産法
WO2016121285A1 (ja) * 2015-01-30 2016-08-04 キッコーマン株式会社 エルゴチオネイン生産能が増強された形質転換糸状菌及びエルゴチオネインの製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2707087B1 (fr) 1993-06-28 1995-10-13 Bioxytech Nouveau procédé de préparation de l'ergothionéine.
JP2007300916A (ja) 2006-04-10 2007-11-22 Manabu Nukina エルゴチオネインの製造方法
JP6263672B1 (ja) * 2016-02-29 2018-01-17 長瀬産業株式会社 エルゴチオネインの発酵生産
JP6758703B2 (ja) * 2016-06-21 2020-09-23 国立大学法人 岡山大学 エルゴチオネインの産生方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016502859A (ja) * 2012-12-21 2016-02-01 ピンフア リウ 代謝工学によるエルゴチオネイン生産法
WO2015168112A1 (en) * 2014-04-29 2015-11-05 Conagen, Inc. Microbial ergothioneine biosynthesis
WO2016121285A1 (ja) * 2015-01-30 2016-08-04 キッコーマン株式会社 エルゴチオネイン生産能が増強された形質転換糸状菌及びエルゴチオネインの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARY W等: "The evolutionary history of the genes involved in the biosynthesis of the antioxidant ergothioneine", 《GENE》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114667346A (zh) * 2019-11-27 2022-06-24 南京纽邦生物科技有限公司 EanB酶突变体及其应用
CN114667346B (zh) * 2019-11-27 2023-05-09 南京纽邦生物科技有限公司 EanB酶突变体及其应用
CN114262702A (zh) * 2021-12-31 2022-04-01 西南大学 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法
CN114262702B (zh) * 2021-12-31 2023-12-08 西南大学 麦角硫因合成基因在谷氨酸棒杆菌中重建麦角硫因代谢途径中的应用及其方法
CN115851655A (zh) * 2022-12-30 2023-03-28 华熙生物科技股份有限公司 酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法
CN116790538A (zh) * 2023-06-07 2023-09-22 深圳希吉亚生物技术有限公司 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用
CN116790538B (zh) * 2023-06-07 2024-04-02 深圳希吉亚生物技术有限公司 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3751001A4 (en) 2021-11-17
US20200385769A1 (en) 2020-12-10
TW201936925A (zh) 2019-09-16
EP3751001C0 (en) 2023-06-07
JPWO2019163767A1 (ja) 2020-12-17
EP3751001A1 (en) 2020-12-16
EP3751001B1 (en) 2023-06-07
WO2019163767A1 (ja) 2019-08-29
TWI820088B (zh) 2023-11-01
EP3751001B9 (en) 2023-10-04
JP6948453B2 (ja) 2021-10-13
ES2948261T3 (es) 2023-09-07
US11098330B2 (en) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112004936A (zh) 麦角硫因生产方法
JP6263672B1 (ja) エルゴチオネインの発酵生産
Schmitz et al. A tungsten‐containing active formylmethanofuran dehydrogenase in the thermophilic archaeon Methanobacterium wolfei
Kim et al. Isolation and characterization of a hybrid respiratory supercomplex consisting of Mycobacterium tuberculosis cytochrome bcc and Mycobacterium smegmatis cytochrome aa3
US20040235123A1 (en) Production of alpha-lipoic acid
KR20220003035A (ko) 에르고티오네인의 생산 방법
ITRM20070398A1 (it) Procedimento per la preparazione di acido gamma-ammino butirrico (gaba) mediante batteri lattici (lab) su surplus agro-alimentari.
CN102952813B (zh) 蓝色天然染料的合成方法及提取工艺
Davoudi et al. Identification of Surf1 as an assembly factor of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex of Actinobacteria
WO2022185873A1 (ja) エルゴチオネインの製造方法
CN110938606B (zh) HpaBC基因、突变体及其应用
Sinha et al. Production, purification and kinetic characterization of L-asparaginase from Pseudomonas fluorescens
KR20050108387A (ko) Ｌ-세린 대사에 관여하는 단백질을 암호화하는 코리네형박테리아의 뉴클레오티드 서열 및 미생물에 의한 ｌ-세린의제조 방법
CN117460821A (zh) 生产透明质酸的重组细胞
WO2022185872A1 (ja) エルゴチオネインの製造方法
WO2024038903A1 (ja) オボチオールａもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法
WO2020213374A1 (ja) ペルオキシダーゼの組換え生産
CN117677676A (zh) 在酵母中生产甜菜素的方法
Xiao A Novel Epimerase Catalyzing Multiple Isomerization of Amino Acid Residues of Ribosomal Peptide
CN117737093A (zh) 一种催化合成松油醇的基因、单萜合成酶及其在生产松油醇中的应用
CN117460835A (zh) 生产肝素前体的重组细胞
KR20130062654A (ko) 락토바실러스 헬베티커스에서 유래하는 신규한 시나모일 에스터라제
KR20190110490A (ko) 신규한 프로모터 및 이의 용도
WO2007035693A2 (en) Isonitrile biosynthetic genes and uses thereof
Ishchenko The effect of 5, 6-dimethylbenzimidazole on vitamin B12 synthesis and protein production in Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201127

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication