CN111996249A - 癌症诊断和病程监控方法 - Google Patents

癌症诊断和病程监控方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于癌症诊断和病程监控的方法。具体而言，本公开提供了通过检测受试者或癌症患者的体液中一种或多种肿瘤微环境相关基因的外泌体mRNA的水平，来预测受试者患癌症的风险或对癌症患者进行病程监控的方法。本公开还提供了用于实施上述方法的试剂盒。

Description

癌症诊断和病程监控方法
技术领域
本公开涉及疾病诊断和预后领域。更具体地，本公开涉及泛癌的早期诊断和预测，以及癌症的病程监控领域。
技术背景
根据全球所有年龄段、性别的人群中所有癌症发病比例的推算数据，2018年，全球预计癌症新发病例将达到1810万，死亡病例达960万。而在这庞大的癌症新发病例中，亚洲占比高达50％；在960万癌症死亡病例中，亚洲占比更是高达70％。在1810万癌症新发病例中，我国新发病例数占380.4万例；而在960万癌症死亡病例中，我国死亡病例数占229.6万例。
从发病的癌种来分，肺癌是全球发病率最高的癌症，高达11.6％，紧随其后的是乳腺癌(同占比11.6％，仅比肺癌少了5000例)、结肠直肠癌(10.2％)、***癌(7.1％)、胃癌(5.7％)。而从各癌种的死亡率来看，死亡率最高的依旧是肺癌(18.4％)，其他癌症的死亡率分别为：结肠直肠癌(9.2％)、胃癌(8.2％)、肝癌(8.2％)、乳腺癌(6.6％)。
现如今我国各地医院的首诊病人中早期确诊癌症的病例不到10％，绝大部分患者都失去了癌症最佳治疗时期。因此，提高癌症早期发现率是至关重要的。WHO也明确指出：早期发现是提高癌症治愈的关键。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
外泌体是一种具有磷脂双分子膜结构的纳米级囊泡，包含亲代细胞的各种组分，包括蛋白、核酸、脂质、碳水化合物等多种物质，广泛分布于血清、唾液、尿液、灌洗液等体液中。外泌体的形成与亲源细胞的状态密切相关，其在肿瘤微环境中含量尤其丰富，与肿瘤的发生发展、免疫逃逸、微环境建立密切相关。外泌体可保护其中的核酸类物质，防止其迅速降解。因此，针对外泌体内容物的检测比传统的肿瘤标志物更具有特异性，以其为基础的肿瘤诊断可在病情发展过程中及时监测标志物的变化，这种检测更易监控且样本更易收集。外泌体的这些优势，使其在肿瘤诊断领域有显著的优势，为肿瘤的无创诊断提供了新的方向。
外泌体中的RNA的种类和分布：miRNA(约40.4％)，piwiRNA(约40.0％)，假基因(约3.7％)，lncRNA(约2.4％)，tRNA(约2.1％)，和mRNA(约2.1％)。基于外泌体癌症诊断检测的现有技术，普遍都是检测外泌体蛋白或外泌体中的miRNA。由于外泌体中的mRNA含量较少，难以被检测到或者难以成为癌症检测中具有临床意义的生物标志物。
发明内容
本发明人令人惊讶的发现，无论是通过常规RT-PCR方法，还是灵敏度更高的检测方法例如ddPCR检测、基于高通量测序的检测例如NGS(Next Generation Sequencing)检测或基因芯片检测，都能够检测外泌体中与肿瘤微环境相关的基因的mRNA水平。更进一步，本发明人发现，受试者或癌症患者的体液外泌体中肿瘤微环境相关基因的mRNA水平具有临床诊断和癌症病程监控的意义。
相应地，一方面，本公开涉及一种检测受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从所述受试者的体液分离外泌体RNA；
b.通过选自常规RT-PCR检测、ddPCR检测、基于高通量测序的检测和基因芯片检测的方法检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在一些实施方案中，从所述受试者的体液分离外泌体RNA包括：
a1.从所述受试者的体液分离外泌体；和
a2.从所述外泌体分离RNA。
可以使用本领域已知的方法从受试者的体液分离外泌体，以及从外泌体分离RNA。
在另一些实施方案中，从所述受试者的体液分离外泌体RNA包括：
a1.对所述体液进行预处理；和
a2.从所述体液直接分离外泌体RNA。
在一些实施方案中，所述常规RT-PCR检测包括：
b1.使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；和
b2.使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行荧光定量PCR，
从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在上述方法的一些实施方案中，步骤b1和b2在一步法PCR反应中完成。在一步法PCR反应中，反应体系包含逆转录酶、聚合酶和相关逆转录反应和PCR反应试剂，并在一个反应体系中完成逆转录和PCR反应。
在上述方法的一些实施方案中，所述荧光定量PCR可以选自高分辨率熔解曲线(HRM)法和探针法。
在一些实施方案中，所述基于高通量测序的检测包括：
b1.使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
b2.使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；
b3.使用所述多重PCR的产物进行建库；和
b4.对建立的文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在上述方法的一些实施方案中，步骤b1和b2在一步法多重PCR反应中完成。在一步法多重PCR反应中，反应体系包含逆转录酶、聚合酶和相关逆转录反应和PCR反应试剂，并在一个反应体系中完成逆转录和PCR反应。
在另一些实施方案中，所述基于高通量测序的检测包括：
b1.使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
b2.对获得的全转录组文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在一些实施方案中，所述基因芯片检测包括：
b1.使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
b2.使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；和
b3.将所述多重PCR的产物与基因芯片进行杂交，从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针。
在上述方法的一些实施方案中，步骤b1和b2在一步法多重PCR反应中完成。
在另一些实施方案中，所述基因芯片检测包括：
b1.使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
b2.将建立的全转录组文库与基因芯片进行杂交从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针。
在上述方法的任意实施方案中，所述内参基因选自β-actin(ACTB)、GAPDH、β2-MG、G6PDH、UBC、Tub、PLA、GUSB、HPRT等。
在涉及使用常规RT-PCR或ddPCR的方法的一些实施方案中，通过计算标志物的mRNA的2–ΔΔCT值来获得所述标志物的外泌体mRNA水平，例如如实施例1中详细描述的。在另一些实施方案中，通过使用标准曲线，将标志物的mRNA定量到拷贝数来获得所述标志物的外泌体mRNA水平。
在RT-PCR方法中，也可以使用半定量PCR方法获得所述标志物的外泌体mRNA水平。半定量PCR方法使用凝胶电泳及凝胶成像和定量分析的方法来对mRNA进行检测。
在另一个方面，本公开涉及一种用于泛癌的诊断的方法，所述方法包括检测受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的步骤。
在一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12或其组合。例如，所述肿瘤微环境相关基因包括选自EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，或全部六种基因。
在一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、VEGFB或其组合。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF，且其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中EGF的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括TGF-β1，且其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中TGF-β1的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括VEGFB，且其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中VEGFB的mRNA的水平下降指示所述受试者具有患癌症的风险。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括MMP9，且其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中MMP9的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括CXCL8，且其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中CXCL8的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险。
在上述诊断方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括CXCL12，且其中与与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中CXCL12的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险。
上述癌症可以是任何种类的癌症，且其具体实例包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌；膀胱癌；骨癌；乳腺癌；腹膜癌；***；胆管癌；绒毛膜癌；肠癌(例如结肠癌和直肠癌)；***癌；消化***癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；胶质母细胞瘤；肝癌；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌症；B细胞淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病等。
在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌。
在上述诊断方法的任意实施方案中，所述体液可以选自血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水和***抽吸液。例如，在一些实施方案中，所述体液是血液。
在上述诊断方法的一些实施方案中，通过本公开的检测受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的方法来检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
优选地，本发明的诊断方法具有至少65％的灵敏度，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％灵敏度。
优选地，本发明的诊断方法具有至少65％的特异性，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％特异性。
在一个方面，本公开涉及一种对癌症患者进行病程监控的方法，所述方法包括比较第一时间点和第二时间点所述患者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的步骤，或者包括比较第一时间点和多个其它时间点所述患者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的步骤，其中所述第二时间点和多个其它时间点在所述第一时间点之后。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12或其组合。例如，所述肿瘤微环境相关基因包括选自EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，或全部六种基因。
在一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、VEGFB或其组合。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中EGF的mRNA的水平下降指示预后良好。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括TGF-β1，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中TGF-β的mRNA的水平下降指示预后良好。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括VEGFB，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中VEGFB的mRNA的水平上升指示预后良好。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括MMP9，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中MMP9的mRNA的水平下降指示预后良好。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括CXCL8，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中CXCL8的mRNA的水平下降指示预后良好。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括CXCL12，且其中相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中CXCL12的mRNA的水平下降指示预后良好。
对其进行病程监控的癌症的具体种类没有限制，且其可以是上文中列出的任何种类的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，所述体液选自血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水和***抽吸液。例如，在一些实施方案中，所述体液是血液。
在上述病程监控的方法的一些实施方案中，患者在所述第一时间点和第二时间点之间接受癌症治疗。在一些实施方案中，所述癌症治疗选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术治疗，或其组合。例如，在一些实施方案中，所述癌症治疗包括手术治疗。
在上述病程监控的方法的任意实施方案中，通过本公开的检测受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的方法来检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
优选地，本发明的病程监控的方法具有至少65％的灵敏度，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％灵敏度。
优选地，本发明的病程监控的方法具有至少65％的特异性，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％特异性。
在一个方面，本公开涉及一种用于泛癌的诊断的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.外泌体RNA提取试剂；和
b.一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂。
在另一个方面，本公开涉及一种用于癌症的病程监控的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.外泌体RNA提取试剂；和
b.一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂。
所述癌症的具体种类没有限制，且其可以是上文中列出的任何种类的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌。
在上述试剂盒的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12，或其组合。例如，所述肿瘤微环境相关基因包括选自EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，或全部六种基因。
在一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、VEGFB或其组合。
在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒还包括外泌体分离试剂，其用于从体液中分离外泌体。
在一些实施方案中，所述外泌体分离试剂用于从选自血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水或***抽吸液的体液中分离外泌体。例如，在一些实施方案中，所述外泌体分离试剂用于从血液中分离外泌体。
在上述试剂盒的一些实施方案中，所述检测试剂用于通过选自基于高通量测序的检测、基因芯片检测、RT-PCR检测和ddPCR检测的方法检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在一些实施方案中，所述检测试剂包括所述肿瘤微环境相关基因的特异性扩增引物和/或探针。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括内参基因的特异性扩增引物和/或探针。例如，所述内参基因可以选自β-actin(ACTB)、GAPDH、β2-MG、G6PDH、UBC、Tub、PLA、GUSB、HPRT等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于PCR反应的一种或多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂包括聚合酶、dNTP、缓冲液和去离子水等。在另一些实施方案方案中，所述试剂包括聚合酶、UNG酶、dNTP、dUTP，缓冲液和去离子水等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于逆转录反应的一种或多种试剂，例如逆转录酶、逆转录引物、dNTP、缓冲液和去离子水等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于逆转录和PCR反应的一种或多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶，聚合酶、dNTP、缓冲液和去离子水等。在另一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶，聚合酶、UNG酶，dNTP、dUTP，缓冲液和去离子水等。
在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒用于实施本公开的用于泛癌的诊断的方法或对癌症患者进行病程监控的方法。
在一个方面，本公开涉及外泌体RNA提取试剂和一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂在制备用于泛癌的诊断的试剂盒中的用途。
在另一个方面，本公开涉及外泌体RNA提取试剂和一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂在制备用于癌症的病程监控的试剂盒中的用途。
在一个方面，本公开涉及外泌体分离试剂、外泌体RNA提取试剂和一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂在制备用于泛癌的诊断的试剂盒中的用途。
在另一个方面，本公开涉及外泌体分离试剂、外泌体RNA提取试剂和一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA的检测试剂在制备用于癌症的病程监控的试剂盒中的用途。
所述癌症的具体种类没有限制，且其可以是上文中列出的任何种类的癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌。
在上述用途的一些实施方案中，所述外泌体分离试剂用于从选自血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水或***抽吸液的体液中分离外泌体。例如，在一些实施方案中，所述外泌体分离试剂用于从血液中分离外泌体。
在上述用途的一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12，或其组合。例如，所述肿瘤微环境相关基因包括选自EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种，或全部六种基因。
在一些实施方案中，所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、VEGFB或其组合。
在上述用途的一些实施方案中，所述检测试剂用于通过选自基于高通量测序的检测、基因芯片检测、RT-PCR检测和ddPCR检测的方法检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
在上述用途的一些实施方案中，所述检测试剂包括所述肿瘤微环境相关基因的特异性扩增引物和/或探针。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括内参基因的特异性扩增引物和/或探针。
例如，所述内参基因可以选自β-actin(ACTB)、GAPDH、β2-MG、G6PDH、UBC、Tub、PLA、GUSB、HPRT等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于PCR反应的一种或多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂包括聚合酶、dNTP、缓冲液和去离子水等。在另一些实施方案方案中，所述试剂包括聚合酶、UNG酶、dNTP、dUTP，缓冲液和去离子水等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于逆转录反应的一种或多种试剂，例如逆转录酶、逆转录引物、dNTP、缓冲液和去离子水等。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于逆转录和PCR反应的一种或多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶，聚合酶、dNTP、缓冲液和去离子水等。在另一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶，聚合酶、UNG酶，dNTP、dUTP，缓冲液和去离子水等。
在上述用途的一些实施方案中，所述试剂盒用于实施本公开的用于泛癌的诊断的方法或对癌症患者进行病程监控的方法。
附图说明
图1显示了使用HRM法检测的各个标志物在来自健康人群和癌症患者的血浆样本中外泌体mRNA水平的差异。左图显示了各个标志物的ROC曲线分析结果，且右图显示了外泌体mRNA水平的散点图。
图2显示了使用HRM检测的各个标志物在来自健康人群、不同种类的癌症患者和炎症患者的血浆样本中外泌体mRNA水平的散点图。
图3显示了使用探针法检测的各个标志物在来自健康人群和癌症患者的血浆样本中外泌体mRNA水平的差异。左图显示了各个标志物的ROC曲线分析结果，且右图显示了外泌体mRNA水平的散点图。
图4显示了使用探针法检测的各个标志物在来自健康人群、乳腺癌患者和乳腺良性增生患者的血浆样本中外泌体mRNA水平的散点图。
图5显示了使用探针法检测的各个标志物在来自配对的癌症患者术前和术后的血浆样本中外泌体mRNA水平变化。
实施例
以下将结合实施例进一步说明本发明的内容。应当理解以下实施例仅是说明性的，而不应被认为是对本发明范围的限制。
实施例1.外泌体mRNA检测方法
在以下实施例中，通过mRNA测定来分析列出的肿瘤微环境相关标志物，该测定被设计为在荧光定量PCR检测平台和ddPCR平台上分别运行。在非癌和癌症血浆外泌体中独立/联合的测试标志物的性能，以便提供标志物的检测诊断性能，以便用于健康人分流、高危人群监控、泛癌的预测和早期诊断，以及癌症病人的病程监控。
采用Lightcycle480平台分析每种标志物的性能，所述标志物包括：
EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8(IL-8)、CXCL12(SDF-1)。
1.血浆处理、血浆外泌体分离及外泌体mRNA的提取
EDTA抗凝管采血5mL，采血后尽快进行血浆分离(在半个小时内进行血浆分离)。血浆分离步骤：800g离心10分钟去除红细胞和白细胞；第二次离心：16000g,离心10分钟。得到的血浆用于立即检测或于-80℃保存。再次检测时，需将血浆解冻。
检测冻存血浆时，于37℃水浴融化。12000rpm离心15min后，用0.8μm的滤膜进行过滤。采用QIAGEN试剂盒(exo-RNeasy Serum/Plasma Midi Kit(50)Cat.No.77044)提取血浆外泌体RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
2.逆转录反应
使用14μl ddH2O洗脱外泌体总RNA后，全部加入逆转录反应体系。使用1μl随机引物，按照以下表1所示的逆转录反应体系进行逆转录反应。逆转录试剂盒购自ThermoScientific(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit#K1621)。
表1.逆转录反应体系
Figure BDA0002405863850000121
3.荧光定量PCR
3.1HRM法
使用ACTB作为内参基因，采用染料法检测血浆外泌体中各标志物mRNA的水平。按照以下表2中所示的方案进行RT-PCR检测生物标志物mRNA的相对水平。
表2.RT-PCR(HRM法)检测方案
Figure BDA0002405863850000122
3.2探针法
使用ACTB作为内参基因，通过MGB类型荧光标记探针来检测cDNA，采用两步探针法检测血浆外泌体中各标志物mRNA的水平。按照以下表3中所示的方案进行RT-PCR检测生物标志物mRNA的相对表达水平。
表3.RT-PCR(探针法)检测方案
Figure BDA0002405863850000131
3.3ddPCR法
用ddPCR supermix forprobes在QX200 Droplet Digital PCR***中进行反应。按照以下表4中所示的方案进行ddPCR检测生物标志物mRNA的相对表达水平。
表4.ddPCR检测方案
Figure BDA0002405863850000132
Figure BDA0002405863850000141
每种标志物的测定在非癌对照组/癌症组血浆外泌体样本中重复两次，同时设立对照组，包括阳性质控对照(标志物阳性的细胞系提取的总RNA，阳性细胞系：H3122/H2228)和阴性质控对照(DNA/未逆转录的RNA)。并分析样本结果。
4.统计分析
样本的mRNA表达水平使用2-ΔΔCT法计算，以ACTB为内参，Ct值含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数，每种mRNA的ct值与浓度存在线性关系，对未检测到者以最高检测循环数50计算。
内参基因均一化样本差异：
ΔCT处理样本＝CT(靶标基因)-CT(内参基因)
ΔCT阳控对照＝CT(阳控对照)-CT(内参基因)
ΔΔCT＝ΔCT处理样本-ΔC阳控对照
最后计算2–ΔΔCT
对癌症/健康人患者血浆样本间肿瘤微环境相关基因的mRNA的表达差异进行分析。使用GraphPad Prism软件，将不同血浆样本进行比较，并以散点图显示。
ROC曲线用于判断个标志物在癌症诊断中的特异性和灵敏度。
实施例2.肿瘤微环境相关基因标志物对癌症和健康人群的区分效果
对临床样本(包括健康人和胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌患者)的血浆外泌体中与肿瘤微环境相关的基因标志物的mRNA进行检测，获得相应实验数据。通过对所述实验数据进行分析，选择适合癌症与健康人群分流、或对泛癌早期诊断和预测具有临床意义的标志物。
入组样本：
血浆样本共收集200例，其中健康人样本来自苏州普瑞迈德医学检验所和安徽铜陵第二人民医院，癌症样本来自上海市胸科医院和河南科技大学第一附属医院。溶血、脂血和其他异常血浆被排除在外。
最终研究入组的血浆样本为140例，包括62例正常对照和78例癌症患者的血浆样本。
检测：
样本处理和RNA提取步骤见实施例1。
检测方法：HRM方法。对于各个标志物分析的样本数如以下表5中所示。
统计方法：计算2–ΔΔCT，详见实施例1。
表5.各个标志物分析的样本数
标志物 总样本数 健康人样本 癌症患者样本
EGF 140 62 78
TGF-β1 98 38 60
VEGFB 111 36 75
MMP9 98 42 56
CXCL8(IL-8) 83 36 47
CXCL12(SDF-1) 57 18 39
结果：
癌症组和健康组的外泌体标志物2–ΔΔCT值比较发现：EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8(IL-8)、CXCL12(SDF-1)的mRNA的水平经ROC分析具有临床诊断意义，t检验有统计学意义(P<0.0001)，检测的灵敏度/特异性(％)分别为80.77/87.10、65.00/71.05、82.67/83.33、76.79/80.95、87.23/80.56和84.62/61.11。具体结果如图1和以下表6中所示。
表6.检测结果
Figure BDA0002405863850000161
实施例3.标志物对不同种类的癌症人群的区分效果
基于实施例2的实验结果，本实施例针对作为癌症与健康人分流的较优标志物组进行进一步检测，所述标志物包括EGF、VEGFB、MMP9、CXCL12(SDF-1)和CXCL8(IL-8)。考察了上述标志物基因的mRNA水平在不同癌种的患者的血浆外泌体中的差异。
入组样本：
收集不同患者及健康人血浆样本共计170例，其中癌症样本80例、正常对照样本62例、炎症样本28例。正常对照样本来自苏州普瑞迈德医学检验所和安徽铜陵第二人民医院，癌症样本来自上海市胸科医院和河南科技大学第一附属人民医院，炎症样本(肠炎、胃炎)来自安徽铜陵市人民医院。溶血、脂血和其他异常血浆被排除在外。
检测：
样本处理和RNA提取步骤见实施例1。
检测方法：HRM方法。对于各个标志物分析的样本数如以下表7中所示。
统计方法：计算2–ΔΔCT，详见实施例1。
表7.各个标志物检测的样本数量
标志物 健康人 肺癌 胃癌 肠癌 乳腺癌 胃炎 肠炎
EGF 62 28 26 9 17 9 18
VEGFB 36 11 37 15 14 9 19
MMP9 42 19 29 9 0 0 0
CXCL8 36 19 20 9 8 0 0
CXCL12 18 0 20 9 8 0 0
结果：
EGF检测四种癌症的特异性均达到87％以上，灵敏度则以乳腺癌(93.75％)和胃癌(80.00％)最高；VEGFB检测四种癌症的灵敏度均达到78％以上，其中肠癌、胃癌的灵敏度最高，达到100％；MMP9检测三种癌症的特异性均在80％以上，灵敏度以肺癌(89.47％)最高，肠癌(44.41％)较低；CXCL8检测四种癌症的特异性均在75％以上，灵敏度以肺癌(89.47％)最高，其次为乳腺癌(87.75％)和胃癌(85％)具体结果如以下表8-12中所示。
表8.EGF在不同癌种中的灵敏度和特异性分析
Figure BDA0002405863850000171
表9.VEGFB在不同癌种中的灵敏度和特异性分析
Figure BDA0002405863850000172
Figure BDA0002405863850000181
表10.CXCL8在不同癌种中的灵敏度和特异性分析
Figure BDA0002405863850000182
表11.MMP9在不同癌种中的灵敏度和特异性分析
Figure BDA0002405863850000183
表12.CXCL12在不同癌种中的灵敏度和特异性分析
Figure BDA0002405863850000184
此外，通过图2中所示的散点图分析，可以看出来自不同种类的癌症患者的血浆外泌体样本、胃肠炎患者样本样本与健康对照样本之间具有明显的区分。上述肿瘤微环境相关基因的mRNA可以作为不同癌种人群、炎症人群和健康人群的有效指标。综合以上结果说明，血浆外泌体中EGF、VEGFB、MMP9、CXCL8(IL-8)的mRNA在不同癌种中表达量具有差异，可以作为癌症筛查和辅助诊断的良好指标，具有重要的临床意义和医用开发价值。
实施例4.标志物的组合对癌症的诊断和预测效果
采用实施例1方法对以上所述标志物观察其单项检查及进行2项及多项的不同组合灵敏度和特异性比较。以下仅举例说明EGF与VEGFB组合，本公开不限于此两种标志物相组合。
入组样本：
所分析样本包括20例健康对照血浆外泌体样本，来自安徽铜陵市第二人民医院；58例癌症血浆外泌体样本，来自上海市胸科医院和河南科技大学第一附属人民医院。
结果判定：
根据实施例2所列cutoff值进行阴阳性判读即：EGF cutoff值>0.224；VEGFBcutoff值≦0.0526。两个标志物中有一项为阳性则结果判读为阳性，若两个均为阴性则结果判读为阴性。
结果：
单项EGF和VEGFB mRNA检测特异性分别为90.00％和100.00％，灵敏度分别为79.31％和81.03％，两项联合检测后，灵敏度明显提高，达到93.10％。此外，两项联检后阴性预测值提高至81.82％，同时总符合率高达92.31％，具体结果见以下表13-15。
表13.EGF单项检测结果
Figure BDA0002405863850000201
表14.VEGFB单项检测结果
Figure BDA0002405863850000202
表15.两项联检(EGF+VEGFB)检测结果
Figure BDA0002405863850000211
综合以上结果，对癌症患者中血浆外泌体标志物的联合检测与单项检测结果比较后发现，两项标志物联合检测在不降低特异性的同时可以明显提高灵敏度与准确率。
实施例5.基于探针检测方法评估标志物对癌症的诊断和预测效果
本方法采用实施例1所述方法进行血浆外泌体RNA提取并进行逆转录。RT-PCR方法采用探针法对大量临床样本(包括健康人和胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌患者)的血浆外泌体mRNA进行检测。基于探针法检测本身存在的优点，通过对所述实验数据进行以下分析，以便准确的检测癌症组及非癌组血浆外泌体mRNA的表达量。
入组样本：
收集不同癌种血浆样本39例，以及正常对照20例。正常对照样本来自苏州普瑞迈德医学检验所和安徽铜陵第二人民医院，癌症样本来自上海市胸科医院和河南科技大学第一附属人民医院。溶血、脂血和其他异常血浆被排除在外。
结果：
通过探针法检测，结果表明EGF、VEGFB、MMP9、CXCL8和CXCL12的血浆外泌体mRNA可以明显区分癌症组和健康组。此外，通过探针法检测的标志物EGF、VEGFB、MMP9、CXCL8和CXCL12的mRNA检测结果与HRM法的结果相似，ROC分析具有临床诊断意义，t检验有统计学意义(P<0.0001)；检测的灵敏度/特异性(％)分别为76.92/90.00、94.87/100.00、97.44/58.97、89.74/100.00和87.18/85.00。具体结果如图3和以下表16中所示。
表16.检测结果(探针法)
Figure BDA0002405863850000221
实施例6.标志物对良性疾病和癌症的区分效果
本实施例研究了标志物的血浆外泌体mRNA在良性腺瘤和癌症之间的表达差异作为用于良恶性鉴别。以下以乳腺癌及乳腺良性增生作为示例性癌症和良性肿瘤。
入组样本：
收集乳腺癌、乳腺纤维腺瘤(良性增生)及健康对照血浆样本共计60例，包括20例乳腺癌样本、20例良性增生样本及20例健康对照样本，所述样本均来自复旦大学附属肿瘤医院。溶血、脂血和其他异常血浆被排除在外。
检测：
样本处理和RNA提取步骤见实施例1。
检测方法：探针方法；
统计方法2–ΔΔCT，详见实施例1。
结果：
对乳腺良恶性疾病鉴别诊断作用分析结果显示EGF、VEGFB、MMP9、CXCL12、CXCL8(IL-8)可以较好区分乳腺良性增生与乳腺癌。如图4中的散点图所示，可以看出几种标志物在乳腺良性增生样本中的外泌体mRNA表达水平与健康对照组的外泌体mRNA表达水平相近。EGF、MMP9、CXCL8、CXCL12在乳腺癌和乳腺良性增生样本中外泌体mRNA表达水平存在显著差异，表明在乳腺癌患者中EGF、MMP9、CXCL8、CXCL12的外泌体mRNA表达会出现异常增高，且明显高于乳腺良性增生患者；VEGFB在乳腺癌中外泌体mRNA表达水平降低，且明显低于健康对照组及良性增生组。各标志物区分乳腺癌和乳腺良性增生的灵敏度和特异性结果如表17所示。从该结果可见，EGF、CXCL8灵敏度高达90％以上，EGF、VEGFB、MMP9、CXCL12的特异性均在80％以上。因此，上述标志物的外泌体mRNA水平对于鉴别诊断具有显著意义和价值。
表17.标志物在乳腺癌与乳腺良性增生样本中的灵敏度和特异性分析(探针法)
Figure BDA0002405863850000231
实施例7.治疗前后血浆外泌体中各标志物的mRNA表达差异
本方法采用实施例1中所述的方法，通过RT-PCR采用探针法对术前术后血浆外泌体mRNA检测，通过标志物EGF、VEGFB、MMP9、CXCL8(IL-8)和CXCL12(SDF-1)的术前术后mRNA相对表达量进行分析，讨论患者血浆外泌体mRNA的表达在癌症患者术前术后的差异，以作为复发预后监控。
入组样本：
样本收集自河南科技大学第一附属医院术前术后配对样本(胃癌、肠癌、乳腺癌等)共计45对，其中包括胃癌术前术后配对样本23对，肠癌术前术后配对样本9对，乳腺癌术前术后配对样本13对。
结果：
标志物EGF、MMP9、CXCL8和CXCL12在术前样本的阳性检出率为99％左右，超过50％的样本在术后标志物mRNA表达量降低：其中EGF术前术后样本共检测45对，术前样本阳性率为100％，术后53.33％的样本mRNA相对表达量降低，其中2–ΔΔCT值降低25％的有10对，2–ΔΔCT值降低50％的有7对；MMP9共检测39对术前术后血浆样本，术前样本阳性率为98％，术后61.54％的样本2–ΔΔCT值降低，其中降低25％有10对；CXCL8共检测30对术前术后血浆样本，术前样本阳性率为99.7％，术后56.67％的样本mRNA相对表达量降低；CXCL12共检测29对术前术后血浆样本，术前阳性率为100％，术后68.97％的样本2–ΔΔCT值降低，其中降低25％有7对。此外，VEGFB在38对术前术后样本检测中有57.89％的患者在术后2–ΔΔCT值升高，31.58％的患者上调50％。对于各个标志物分析的样本数信息如以下表18中所示，且检测结果如图5和表19中所示。
表18.各个标志物分析的配对样本数
Figure BDA0002405863850000241
表19.各个标志物的配对样本检测结果
Figure BDA0002405863850000242
Figure BDA0002405863850000251
由上述结果可见，标志物EGF、MMP9、CXCL8(IL-8)和CXCL12(SDF-1)血浆外泌体mRNA在术后的表达水平总体变化趋势是降低的，表示手术治疗有效；VEGFB在术后样本检测中血浆外泌体mRNA的表达水平升高，证明手术具有效果。因此，监测上述标志物的变化对肿瘤手术效果的判断及病情监测具有重要意义，并且对其进行联合检测临床价值更大。

Claims (12)

1.一种或多种肿瘤微环境相关基因作为检测靶点在制备用于泛癌的诊断或病程监控的试剂盒中的用途，所述试剂盒对受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平进行检测，其特征在于：所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12或其组合，优选地，包括EGF/VEGFB的组合。
2.一种或多种肿瘤微环境相关基因的外泌体mRNA的检测试剂在制备用于泛癌的诊断或病程监控的试剂盒中的用途，所述检测试剂对受试者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平进行检测，其特征在于：所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12或其组合，优选地，包括EGF/VEGFB的组合。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中与来自不具有癌症的个体的对照水平相比，受试者的体液外泌体中EGF、TGF-β1、MMP9、CXCL8或CXCL12的mRNA的水平上升指示所述受试者具有患癌症的风险；或受试者的体液外泌体中VEGFB的mRNA的水平下降指示所述受试者具有患癌症的风险。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中试剂盒或检测试剂通过选自常规RT-PCR检测、ddPCR检测、基于高通量测序的检测和基因芯片检测等方法检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
5.根据权利要求4所述的用途，其中RT-PCR检测、ddPCR检测、基于高通量测序的检测和基因芯片检测方法中，逆转录和PCR可以分别进行或在一步法PCR反应或一步法多重PCR反应中完成；
其中所述基于高通量测序的检测包括：
a1. 使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
a2. 对获得的全转录组文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平；
或其中所述基于高通量测序的检测包括：
b1. 使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
b2. 使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；
b3. 使用所述多重PCR的产物进行建库；和
b4. 对建立的文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平；
其中所述基因芯片检测包括：
c1. 使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
c2. 使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；和
c3. 将所述多重PCR的产物与基因芯片进行杂交，从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针;
或其中所述基因芯片检测包括：
d1. 使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
d2. 将建立的全转录组文库与基因芯片进行杂交从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中病程监控包括比较第一时间点与第二时间点或多个其它时间点所述患者的体液外泌体中一种或多种肿瘤微环境相关基因的mRNA水平的步骤，其中所述第二时间点或多个其它时间点在所述第一时间点之后；进一步优选地：相比于所述第一时间点，在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中EGF、TGF-β、MMP9、CXCL8、CXCL12的mRNA的水平下降指示预后良好，或在所述第二时间点所述患者的体液外泌体中VEGFB的mRNA的水平上升指示预后良好。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述患者在所述第一时间点和第二时间点之间接受癌症治疗，所述癌症治疗选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术治疗，或其组合。
8.如权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌，所述体液选自血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水和***抽吸液等；优选地，体液选自血浆。
9.一种用于泛癌的诊断或癌症的病程监控的试剂盒，所述试剂盒包括：
a. 外泌体RNA提取试剂；和
b. 一种或多种肿瘤微环境相关基因和内参基因的mRNA的检测试剂，所述检测试剂包括所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性扩增引物和/或探针，其中所述肿瘤微环境相关基因包括EGF、TGF-β1、VEGFB、MMP9、CXCL8、CXCL12，或其组合，优选地包括EGF/VEGFB的组合；所述内参基因选自β-actin(ACTB)、GAPDH、β2-MG、G6PDH、UBC、Tub、PLA、GUSB、HPRT等；
c. 任选地还包括外泌体分离试剂，其用于从体液中分离外泌体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述癌症选自肺癌、胃癌、肠癌和乳腺癌；所述体液包括血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水或***抽吸液等，优选地体液选自血浆。
11.如权利要求9或10中所述的试剂盒，其中所述检测试剂用于通过选自常规RT-PCR检测、ddPCR检测、基于高通量测序的检测和基因芯片检测的方法检测所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中RT-PCR检测、ddPCR检测、基于高通量测序的检测和基因芯片检测方法中，逆转录和PCR可以分别进行或在一步法PCR反应或一步法多重PCR反应中完成；
其中所述基于高通量测序的检测包括：
a1. 使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
a2. 对获得的全转录组文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平；
或其中所述基于高通量测序的检测包括：
b1. 使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
b2. 使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；
b3. 使用所述多重PCR的产物进行建库；和
b4. 对建立的文库进行测序以获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平；
其中所述基因芯片检测包括：
c1. 使用所述外泌体RNA作为模板，和随机引物或所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性引物进行逆转录；
c2. 使用所述逆转录的产物作为模板，和所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的扩增引物进行多重PCR；和
c3. 将所述多重PCR的产物与基因芯片进行杂交，从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针;
或其中基因芯片检测包括：
d1. 使用所述外泌体RNA，通过转录组建库；和
d2. 将建立的全转录组文库与基因芯片进行杂交从而获得所述肿瘤微环境相关基因的mRNA水平，
其中所述基因芯片包含所述肿瘤微环境相关基因和内参基因的特异性探针。
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