CN115820857B - 一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒。本发明基于由RP11‑556O9.4、RP11‑417E7.1、RPS3AP23、RP11‑559M23.1、CTD‑2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880组成的标志物组合，提供了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒、综合诊断模型和综合诊断***。通过检测所述标志物组合的表达量，利用所述综合诊断模型，可将胃癌(包括胃癌早期)患者与健康人区分开来，也可将胃癌与胃癌前病变患者区分开来，有利于胃癌的早发现和正确治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒。
背景技术
随着群众卫生意识的增强和社会医疗条件的提高，近年来胃癌的发生率总体有所下降，但其死亡率仍居高不下，其中的一个原因在于群众对胃癌的早筛意识不强或不愿通过胃镜等有创检查手段进行筛查。此外，胃癌是一个多步骤癌变的过程，其从正常胃黏膜上皮发展成胃癌的过程中会出现慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、胃溃疡、胃息肉等表现，这些都是胃癌前病变的范畴。但目前可用于鉴别胃癌前病变和胃癌的标志物并不多，缺乏无创鉴别胃癌前病变和胃癌的方法，且胃癌前病变和胃癌早期的病症表现差别不明显，致使大多数患者早期不重视，没有针对胃癌早期进行正确的治疗，等到确诊时已是进展期胃癌，而进展期胃癌患者的治疗效果不佳。因此，提供可鉴别胃癌前病变和胃癌，以及可进行胃癌早期诊断的标志物具有重要价值，有利于胃癌的早筛查以及患者的正确治疗。
液体活检是一种非侵入性的检测手段，可以通过对血液及其他体液中的循环肿瘤细胞、循环游离肿瘤DNA、循环游离肿瘤RNA和细胞外囊泡等对癌症进行早期发现和治疗分层。外泌体是细胞(包括癌细胞)释放到周围生物液体中的小泡，其具有拷贝数多、更易检测的优势；同时，外泌体在血浆和尿液等生物液体中非常稳定，即使在疾病的早期阶段也可以分离出来进行临床评估。因此，以外泌体为基础的生物标志物已迅速应用于临床领域，可通过检测外泌体中所含有肿瘤衍生物质，如DNA、RNA(包括长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA))、蛋白质和脂质进行癌症诊断。
现已公开的以外泌体为基础的胃癌生物标志物中，长链非编码RNA和环状RNA均有，但是鲜有将两者结合起来对胃癌进行判断的报道。且多数胃癌生物标志物仅能用于诊断受试者是否已经患有胃癌，对于如何区分早期胃癌和正常人、胃癌和胃癌前病变的研究不够深入，不利于患者的正确治疗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何丰富可用于胃癌前病变及胃癌早期诊断的生物标志物，提供一种用于诊断胃癌或用于鉴别胃癌和胃癌前病变的试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别胃癌前病变和胃癌或用于胃癌诊断的标志物组合。
本发明的第二个目的是提供检测所述标志物组合表达量的试剂在制备用于胃癌诊断的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供检测所述标志物组合表达量的试剂在制备用于鉴别胃癌和胃癌前病变的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒。
本发明的第五个目的是提供一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的的综合诊断模型。
本发明的第六个目的是提供一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的的综合诊断***。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种用于鉴别胃癌前病变和胃癌或用于胃癌诊断的标志物组合，包括7个lncRNA和1个circRNA。
具体地，所述标志物组合由RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880组成，其cDNA序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示；其中，RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9和LINC00567为lncRNA，hsa_circ_0047880为circRNA。
本发明通过分别检测胃癌患者和健康人血清外泌体，以及胃癌组织和癌旁组织中的标志物组合，即通过检测上述样本中的RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达量并进行对比发现，上述标志物在胃癌患者血清外泌体中的表达量显著高于健康人，在胃癌组织中的表达量也显著高于癌旁组织。
同时，本发明以所述标志物组合，即以RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880为目标标志物建立了一个综合诊断模型，对所述模型的诊断效能进行分析发现，利用该模型可诊断胃癌，将胃癌患者与健康人区分开；即使是受试者处于胃癌早期阶段，也可以将其与健康人区分开，表明可通过检测本发明所述标志物组合的表达量进行胃癌诊断，进行胃癌的早期大规模筛查。除用于诊断胃癌外，本发明还发现利用所述综合诊断模型可鉴别胃癌和胃癌前病变。
因此，本发明请求保护检测所述标志物组合表达量的试剂在制备用于胃癌诊断的产品中的应用。
本发明还请求保护检测所述标志物组合表达量的试剂在制备用于鉴别胃癌和胃癌前病变的产品中的应用。
具体地，所述标志物组合为RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880。
在所述标志物组合的基础上，本发明还提供了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒，所述试剂盒中含有检测所述标志物组合表达量的试剂。
在本发明所公开的所述标志物组合的序列的基础上，可通过荧光定量PCR等方法对其进行定量检测。
具体地，本发明所述试剂盒中含有检测所述标志物组合表达量的荧光定量PCR引物。
作为一种可选择的实施方式，所述用于检测RP11-556O9.4的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.9～10所示；用于检测RP11-417E7.1的荧光定量PCR引物的序列如SEQ IDNO.11～12所示；用于检测RPS3AP23的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.13～14所示；用于检测RP11-559M23.1的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.15～16所示；用于检测CTD-2339L15.3的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.17～18所示；用于检测DGCR9的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.19～20所示；用于检测LINC00567的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.21～22所示；用于检测hsa_circ_0047880的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.23～24所示。
本发明还提供了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的综合诊断模型，所述模型是以RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880组成的标志物组合为目标标志物。
具体地，本发明所述模型采用如下方程式计算综合诊断指数(combineddiagnostic score，cd-score)：
cd-score＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量。
具体地，当所述模型用于诊断胃癌，用于区分胃癌患者和健康人时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
若受试者已经出现了胃部症状，但仅从症状表现无法区分其是胃癌还是胃癌前病变时，可利用本发明所述综合诊断模型进行判断。即当受试者已经出现了胃部症状，用所述模型鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
本发明还提供了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的综合诊断***，其包括以下模块：
(1)分别定量检测样本中RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880表达量的模块；
(2)综合诊断指数计算模块：cd-score＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量；
(3)结果判断模块：当用于诊断胃癌时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
当用于鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于由7个lncRNA和1个circRNA组成的用于鉴别胃癌前病变和胃癌或用于诊断胃癌的标志物组合，即基于由RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880组成的标志物组合，提供了一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒、综合诊断模型和综合诊断***。通过检测所述标志物组合的表达量，利用所述综合诊断模型，可将胃癌(包括胃癌早期)患者与健康人区分开来，也可将胃癌与胃癌前病变患者区分开来。即本发明提供了一种无创的用于鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒和方法，对胃癌的早发现和正确治疗具有重要意义。
附图说明
图1为用实施例1中构建的综合诊断模型在各集合的ROC曲线和在训练集的最佳截断值；其中，Training set为训练集，Testing set为测试集，External validation为外部验证集；Best cut-off为最佳截断值；AUC为曲线下面积。
图2为本发明所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子在胃癌患者和健康人血清样本外泌体中的表达情况；其中，从上至下，从左至右依次为RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况；T代表胃癌患者样本，N代表健康人样本。
图3为本发明所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子在胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中的表达情况；其中，从上至下，从左至右依次为RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况；T表示胃癌组织样本，N表示癌旁组织样本。
图4为用实施例1中构建的综合诊断模型在区分胃癌早期患者和健康人样本时的ROC曲线及截断值；其中，AUC为曲线下面积。
图5为用实施例1中构建的综合诊断模型在区分胃癌(Tumor)患者和胃癌前病变(PL)患者样本时的ROC曲线及截断值；其中，AUC为曲线下面积。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中所用胃癌患者的血清样本、胃癌组织和癌旁组织(癌旁组织指距离癌切缘5cm以上的正常组织)来自于中山大学肿瘤防治中心或中山大学附属第六医院，患者知情并同意使用。
实施例1以外泌体为基础的胃癌生物标志物的筛选及综合诊断模型的建立
1、以外泌体为基础的胃癌生物标志物的筛选
(1)选取37例胃癌患者和20例健康人的血清样本，以及20例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织(样本来自于中山大学肿瘤防治中心)，使用血清外泌体抽提试剂盒(货号：C10110-2)提取外泌体后，再用TRIzolTM试剂分别提取血清外泌体和组织中的RNA；
(2)利用RNA-seq的高深度测序方法检测步骤(1)中所提取的全部样本的RNA的表达，鉴定已有以及新发现的lncRNA和circRNA)，筛选在胃癌患者血清外泌体中相比健康人血清外泌体中高表达的lncRNA和circRNA，以及在胃癌组织中相比癌旁组织高表达的lncRNA和circRNA，取两者lncRNA的交集，再结合TCGA数据库中胃癌组织中高表达的lncRNA，得到候选的lncRNA标记物；取两者circRNA分子的交集得到候选的circRNA标记物；
(3)设计步骤(2)所得lncRNA和circRNA分子的特异性荧光定量PCR引物；
(4)另选取36例胃癌患者和36例健康人的血清样本，以及24例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织(样本来自于中山大学肿瘤防治中心)，使用TRIzolTM试剂提取样本RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA(货号：RR037A；该试剂盒适用于lncRNA和circRNA；在对血清外泌体RNA进行反转录时需额外添加外参(ExternalStandard Kit(λpolyA)for qPCR，货号3789)，10μL反转录体系添加500ng RNA和0.1ngλpolyA)，分别得到血清外泌体和组织的cDNA，反转录过程参照试剂盒说明书进行；利用步骤(3)中设计的特异性引物，通过荧光定量PCR的方法，对步骤(2)中筛选出的lncRNA和circRNA进行验证，进一步筛选出胃癌血清外泌体和胃癌组织一致性升高的lncRNA和circRNA分子；
(5)基于步骤(4)筛选到的lncRNA和circRNA，分别对训练样本、验证样本和外部验证样本进行实时荧光定量PCR检测，生成三个独立样本的数据集，其中训练和验证样本来自同一批中山大学肿瘤防治中心的522例胃癌病人和460例健康人，比例为7:3，外部验证样本来自中山大学附属第六医院的153例胃癌病人和103例健康人。
2、数据的分析和模型的建立：
(1)在训练数据集中，通过多因素逻辑回归建模，运用Stepwise法，对步骤(5)所得荧光定量PCR结果进行筛选。本发明从候选的lncRNA和circRNA分子中挑选出了7个lncRNA和1个circRNA分子；7个lncRNA分别为RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9和LINC00567；1个circRNA为hsa_circ_0047880。
RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的信息如表1所示，其cDNA序列如依次如SEQ ID NO.1～8所示。后续用标志物组合中的lncRNA和circRNA分子表示上述7个lncRNA和1个circRNA分子。
用于检测标志物组合中的lncRNA和circRNA分子的荧光定量PCR引物序列依次如SEQ ID NO：9～24所示(表2)。
表1用于诊断胃癌的lncRNA和circRNA分子标志物
表2荧光定量PCR引物
使用Promega的实时荧光定量PCR试剂盒(qPCR Master Mix，货号：A6001)对上述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子进行定量，PCR反应检测体系为10μL。除所用的引物序列不同外，定量检测标志物组合中的lncRNA和circRNA分子的RT-qPCR扩增反应体系和反应程序均相同，具体如下所示：
反应体系
反应程序：
95℃10min；95℃15sec，60℃，1min，重复循环50次；40℃，30s；4℃保存。
2、在训练集中确定上述标志物组合中的lncRNA和circRNA的系数，其线性方程如下所示：
综合诊断指数(cd-score)＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量；使用该综合诊断指数在提供的验证队列和外部验证队列的血清外泌体样本进行验证。
3、综合诊断模型的诊断效能
本发明通过多因素逻辑回归建模，运用Stepwise法，用所述标志物组合中的lncRNA和circRNA构建了一个综合诊断模型，其线性方程如下所示：
综合诊断指数(cd-score)＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量。
利用上述线性方程，本发明计算出了每个样本(训练样本、验证样本和外部验证样本)的综合诊断指数(cd-score)，并根据模型在不同截断值时的灵敏度和特异度变化绘制了对应集合的ROC曲线。本发明构建的综合诊断模型在各集合的ROC曲线和在训练集的最佳截断值如图1所示；其中，训练集(Training set)的ROC曲线下面积为0.961，测试集(Testing set)的ROC曲线下面积为0.976，外部验证集(External validation)的ROC曲线下面积为0.939。本模型在训练集的最佳截断值(Best cut-off)为0.331，将集合中的样本分为阳性(即诊断为胃癌患者)和阴性(即健康人)，此时诊断的灵敏度为91.9％，特异度为90.0％。具体地，诊断过程为样本的cd-score大于Best cut-off时，即诊断为胃癌；样本的cd-score小于Best cut-off时，即诊断为健康人。
上述结果表明，本发明所述的综合诊断模型可有效的对胃癌进行诊断，即可通过检测受试者血清外泌体样本中的RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达量，分析其表达水平的改变进行胃癌的诊断，提高了胃癌诊断的简便性和准确性，对受试者的进一步诊治具有重大意义。
实施例2标志物组合中的lncRNA和circRNA在胃癌和健康人血清外泌体中的表达水平对比
1、实验方法
选取36例胃癌患者血清样本和36例健康人血清样品(来自中山大学肿瘤防治中心)，提取胃癌患者和健康人血清外泌体RNA后，反转录为cDNA，通过RT-qPCR检测标志物组合中的lncRNA和circRNA的表达量。提取外泌体、提取RNA、反转录及RT-qPCR检测所用引物、反应体系和反应程序均同实施例1。
2、实验结果
本发明所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子在胃癌患者和健康人血清样本外泌体中的表达情况如图2所示；图2中从上至下，从左至右依次为RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况，图中T代表胃癌患者样本，N代表健康人样本。由图2可知，RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880在胃癌患者血清外泌体中的表达量高于健康人，且差异均显著。
实施例3标志物组合中的lncRNA和circRNA在胃癌和癌旁组织中的表达水平对比
1、实验方法
选取24例胃癌组织与其癌旁组织样品(来自中山大学肿瘤防治中心)，提取胃癌组织和癌旁组织RNA后，反转录为cDNA，通过RT-qPCR检测标志物组合中的lncRNA和circRNA的表达量。提取组织RNA、反转录及RT-qPCR检测所用引物、反应体系和反应程序均同实施例1。
2、实验结果
本发明所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子在胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中的表达情况如图3所示；图3中从上至下，从左至右依次为RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况，图中T代表胃癌组织样本，N代表癌旁组织样本。由图3可知，RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880在胃癌组织中的表达量高于癌旁组织，且差异均显著。
实施例4区分胃癌早期患者和健康人
为验证通过检测所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子的表达情况能否区分Ⅰ、Ⅱ期的胃癌患者和健康人，进行胃癌早期诊断，本实施例从与实施例1同批的样本中选取了47例Ⅰ期胃癌样本和171例Ⅱ期胃癌样本(根据胃癌AJCC第8版pTNM分期确定为Ⅰ、Ⅱ期)，以及460例健康人的血清样本(为实施例1同批所有的健康人血清样本)，对所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子的表达量进行了RT-qPCR检测；反应所用引物同表2，反应体系及反应程序同实施例1。
在获得表达量数据后，用实施例1中的综合诊断模型计算上述样本的综合诊断指数并根据模型在不同截断值下的灵敏度和特异度变化绘制ROC曲线。绘制所得的ROC曲线如图4所示，由图4可知，ROC曲线下面积为0.955，选取0.331为cut-off值，将样本分为阳性(即诊断为I、II胃癌)和阴性(即诊断为健康人)，此时诊断的灵敏度为97.2％，特异度为71.7％。
上述结果表明，利用RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880能区分Ⅰ、Ⅱ期的胃癌患者和健康人，有助于胃癌的早期诊断。
实施例5鉴别胃癌前病变和胃癌
为验证通过检测RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况能否区分胃癌(Tumor)和胃癌前病变(precancerous lesions，PL)，本实施例从中山大学肿瘤防治中心另外收取了144例胃癌患者(根据胃癌AJCC第8版pTNM分期，本实施例中的胃癌患者具体为36例I期、22例II期、61例III期和25例IV期患者)和73例胃癌前病变患者(本实施例中的胃癌前病变包括胃溃疡、肠上皮化生、胃息肉、慢性萎缩性胃炎和非典型增生，这些诊断均基于美国消化内镜委员会ASGE于2015年发表的指南(PMID:25935705)定义的胃癌前病变，样本均通过病理诊断)的血清外泌体样本，对所述标志物组合中的lncRNA和circRNA分子的表达量进行了RT-qPCR检测；反应所用引物同表2，反应体系及反应程序同实施例1。
在获得表达量数据后，用实施例1中的综合诊断模型计算上述样本的综合诊断指数并绘制ROC曲线，用综合诊断模型对样本进行判断。绘制所得的ROC曲线如图5所示，由图5可知，ROC曲线下面积为0.675，模型在本实施例中的最佳cut-off(Best cut-off)值为0.732，此时用模型来对样本进行诊断的灵敏度为68.7％，特异度为65.8％。具体地，诊断过程为样本的cd-score大于Best cut-off时，即诊断为胃癌；样本的cd-score小于Best cut-off时，即诊断为胃癌前病变。
上述结果表明，利用RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880构建的综合诊断模型能区分胃癌(包括胃癌I、II期)和胃癌前病变患者，有助于患者的正确治疗。
实施例6用于诊断胃癌或用于鉴别胃癌和胃癌前病变的试剂盒
本发明还提供了一种用于诊断胃癌或用于鉴别胃癌和胃癌前病变的试剂盒，所述试剂盒中含有检测RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880表达量的试剂。所述试剂为检测RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达情况的荧光定量PCR引物和荧光定量PCR反应所需试剂。
具体地，所述荧光定量PCR引物的序列如实施例1表2所示(即SEQ IDNO.9～24所示)，其反应体系和反应程序同实施例1。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒和实施例1中所述综合诊断模型诊断胃癌的方法，包括以下步骤：
S1.采集血清样本，提取外泌体RNA并反转录为cDNA，以所得cDNA为模板，用SEQ IDNO.9～24所示荧光定量PCR引物进行qPCR反应，定量检测RP11-556O9.4、RPS3AP23、RP11-417E7.1、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的表达量；
S2.计算综合诊断指数，线性方程为：cd-score＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量。
当所述模型用于诊断胃癌，用于区分胃癌患者和健康人时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
若受试者已经出现了胃部症状，但仅从症状表现无法区分其是胃癌还是胃癌前病变时，可利用本发明所述综合诊断模型进行判断。即当受试者已经出现了胃部症状，用所述模型鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
基于上述试剂盒及方法，本发明还提供了一种用于诊断胃癌或用于鉴别胃癌和胃癌前病变的综合诊断***，其包括以下模块：
(1)分别定量检测样本中RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880表达量的模块；
(2)综合诊断指数计算模块：综合诊断指数＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量；
(3)结果判断模块：当用于诊断胃癌时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
当用于鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.检测用于鉴别胃癌和胃癌前病变或用于胃癌诊断的标志物组合表达量的试剂在制备用于胃癌诊断的产品中的应用，其特征在于，所述标志物组合由RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880组成；所述RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880的基因序列依次如SEQ ID NO.1～8所示。
2.检测权利要求1中所述的标志物组合表达量的试剂在制备用于鉴别胃癌和胃癌前病变的产品中的应用。
3.一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测权利要求1中所述的标志物组合表达量的荧光定量PCR引物；所述用于检测RP11-556O9.4的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.9～10所示；用于检测RP11-417E7.1的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.11～12所示；用于检测RPS3AP23的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.13～14所示；用于检测RP11-559M23.1的荧光定量PCR引物的序列如SEQID NO.15～16所示；用于检测CTD-2339L15.3的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.17～18所示；用于检测DGCR9的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.19～20所示；用于检测LINC00567的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.21～22所示；用于检测hsa_circ_0047880的荧光定量PCR引物的序列如SEQ ID NO.23～24所示。
4.一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的综合诊断模型，其特征在于，所述模型是以权利要求1中所述的标志物组合为目标标志物；所述模型采用如下方程式计算综合诊断指数，即cd-score：
cd-score＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量。
5.根据权利要求4所述综合诊断模型，其特征在于，当所述模型用于诊断胃癌时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
当所述模型用于鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
6.一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的综合诊断***，其特征在于，包括以下模块：
(1)分别定量检测样本中RP11-556O9.4、RP11-417E7.1、RPS3AP23、RP11-559M23.1、CTD-2339L15.3、DGCR9、LINC00567和hsa_circ_0047880表达量的模块；
(2)综合诊断指数计算模块：cd-score＝-2.31858+0.11316*has_circ_47880表达量+3.15386*DGCR9表达量+1.48516*LINC00567表达量+5.13114*CTD-2339L15.3表达量-1.25785*RP11.417E7.1表达量-0.47492*RP11.556O9.4表达量+1.22980*RP11.559M23.1表达量-0.09542*RPS3AP23表达量；
(3)结果判断模块：当用于诊断胃癌时，以0.331作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为阳性，即为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为阴性，即为健康人；
当用于鉴别胃癌和胃癌前病变时，以0.732作为截断值，若计算所得综合诊断指数高于截断值，则诊断结果为胃癌；若所得综合诊断指数低于截断值，则诊断结果为胃癌前病变。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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