CN111991368A

CN111991368A - 一种茶多酚涂层的大豆分离大白-季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法

Info

Publication number: CN111991368A
Application number: CN202010950930.9A
Authority: CN
Inventors: 曹崇江; 姚文一; 程摇蓝
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN111991368B

Abstract

本发明公开了一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白‑季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法，先通过氯化钙与碳酸钠溶液的混合生成碳酸钙微粒作为微胶囊制备的模板，再通过层层自组装的方式，按顺序向碳酸钙的分散液中加入大豆分离蛋白与季铵盐壳聚糖溶液，得到了具有多层包裹结构的壳聚糖‑大豆分离蛋白微胶囊，微胶囊离心洗涤后，用EDTA溶液去除碳酸钙模板，并加入茶多酚溶液进行涂层，最终得到了目标微胶囊。将微胶囊用于葛根素的包埋与体外释放。结果表明：茶多酚涂层的微胶囊对于葛根素在不同PH条件下的的释放具有缓释效果，能提高葛根素的生物利用度。

Description

一种茶多酚涂层的大豆分离大白-季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种茶多酚涂层的大豆分离大白-季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法。

背景技术

葛根素来源于中国传统药食同源的中药材葛根，具有多种生理活性，已作为功能保健成分在市场上销售，但直接服用葛根素对胃部刺激严重且生物利用度较低。

大豆蛋白是一种优质廉价的植物蛋白质，能满足人类营养补给和生长发育的需求，已经广泛应用于食品加工技术领域，由于其等电点4.5左右，所以在生理条件下该蛋白呈现负电性，可以与带有正电荷的生物大分子形成静电复合物从而自组装成微胶囊对食品功能分子进行包埋和递送，目前针对该蛋白在功能分子的递送方面已有大量的研究。

壳聚糖作为自然界唯一的天然阳离子多糖，具有抑菌、抗炎、免疫调节等多种生理活性，同时具备安全无毒可食用的特点，已在食品添加剂领域广泛应用。通过对壳聚糖进行结构修饰得到的季铵盐壳聚糖具有良好的生物安全性和良好的抗菌性、成膜性、阳离子吸附性、吸湿保湿性、絮凝性、抗静电性等性能。其抗菌性能优于壳聚糖及其它壳聚糖衍生物。

利用壳聚糖与大豆分离蛋白在生理条件下通过静电作用可以形成多糖-蛋白质复合物的原理，在生物医学和食品功能领域已经对生物活性成分的包埋递送有了深入的研究。

目前多糖-蛋白复合物在药物递送方面的研究仍然面临着递送过程中药物封装泄露率高的问题，如何提高药物的包封率以及释放过程中的稳定性仍然需要通过进一步的研究来改善，而在食品技术领域，包封材料的安全性也是首先需要考虑的问题。目前通过碳酸钙模板法制备层层自组装的生物大分子微胶囊的方法已经得到了广泛的研究，但是鲜有研究对制备得到的微胶囊再次进行涂层装载的研究。本实验采用天然产物活性分子茶多酚对微胶囊进行了二次涂层，对微胶囊的结构和物理化学性能进行了初步表征，并对微胶囊对模式分子药物的包封、装载、释放等载药性能进行了验证，开发了一种具有PH响应特点的生物微胶囊，为开发生物大分子为基质的药物递送***提供了实验依据。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种茶多酚涂层的大豆分离大白-季铵盐壳聚糖微胶囊的制备方法。

本发明的技术方案是：一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，具体操作步骤如下：

步骤(1.1)、将氯化钙和碳酸钠分别配置成溶液，然后混合搅拌、静置15min、真空抽滤去除上清液，用纯化水洗涤，收集颗粒产物，冷冻干燥后得到碳酸钙微粒；

步骤(1.2)、将碳酸钙颗粒加入至大豆分离蛋白溶液中，搅拌后将混悬液进行真空抽滤，所得颗粒离心洗涤；

步骤(1.3)、将离心洗涤所得的颗粒加入到季铵盐壳聚糖溶液中，搅拌后将混悬液进行真空抽滤，所的颗粒离心洗涤；

步骤(1.4)、重复步骤(1.2)及(1.3)，至碳酸钙模板表面沉积所需聚合物涂覆层数后，将所得样品加入到葛根素溶液当中，搅拌过夜，然后将沉淀离心洗涤，得到装载葛根素的大豆分离蛋白-季铵盐壳聚糖微胶囊；

步骤(1.5)、将装载葛根素的大豆分离蛋白-季铵盐壳聚糖微胶囊收集并分别加入到不同浓度梯度的茶多酚溶液当中，搅拌完成后离心洗涤以去除胶囊表面残留的茶多酚溶液，将离心所得样品进行冷冻干燥，制得干燥的茶多酚涂层的微胶囊；

步骤(1.6)、将干燥的茶多酚涂层的微胶囊分散在EDTA溶液中，以去除CaCO3颗粒，搅拌后洗涤离心，离心洗涤，最终得到载有葛根素的茶多酚涂层的季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白中空微胶囊。

进一步的，在步骤(1.1)中，所述氯化钙和碳酸钠浓度为0.2-0.4mol/L,反应温度为20-40℃，搅拌时间为1-10min，静止时间为10-60min。

进一步的，在步骤(1.2)中，所述碳酸钙与大豆分离蛋白溶液的料液比为1:50-100(w/v)，大豆分离蛋白浓度为0.5-3mg/ml，搅拌时间为1-3h，离心洗涤过程中使用的溶剂为纯化水，离心转速8000-10000rpm，离心时间为5-10min。

进一步的，在步骤(1.3)中，步骤(1.2)中所得沉淀与季铵盐壳聚糖溶液的料液比1:50-100(w/v)，季铵盐壳聚糖浓度为0.5-3mg/ml，搅拌时间为0.5-3h，离心洗涤过程中使用的溶剂为纯化水，离心转速8000-10000rpm，离心时间为5-10min。

进一步的，在步骤(1.4)中，所述得到的沉淀与葛根素溶液的料液比1：50-100(w/v)，葛根素溶液浓度1-4mg/ml，搅拌速度100-500rpm，离心转速8000-10000rpm，离心时间5-10min。

进一步的，在步骤(1.5)中，所述茶多酚溶液的浓度为1-10mg/ml，微胶囊与茶多酚溶液的料液比为1：50-100(w/v)，搅拌转速100-300rpm，搅拌时间1-6h，每次离心时间5-10min，离心速率8000-10000rpm。

进一步的，在步骤(1.6)中，所述料液比为1:50-100(w/v)，EDTA溶液的浓度为0.1-0.5mol/l，搅拌时间0.5-3h，离心速率8000-10000rpm，离心时间5-10min。

本发明以碳酸钙作为微胶囊模板，选取阳离子生物大分子季铵盐壳聚糖和天然阴离子蛋白大豆分离蛋白为微胶囊的两种静电结合组分，通过LBL(层层自组装)的制备方法，在碳酸钙模板表面依次形成4层蛋白-多糖涂层，最终使用EDTA溶液中去除碳酸钙模板。制备得到的微胶囊进一步与茶多酚和葛根素孵育得到葛根素装载，茶多酚涂层的中空微胶囊。

本发明通过以下技术方案实现以上目的：以氯化钙和碳酸钠溶液作为原料制备碳酸钙模板，经过搅拌、静置、沉淀、洗涤干燥后得到碳酸钙颗粒。然后将季铵盐壳聚糖和大豆分离蛋白经过振荡孵育、离心洗涤依次涂敷在碳酸钙表面形成多层结构。所的微胶囊再与EDTA、茶多酚、葛根素经过孵育、洗涤、透析、冷冻干燥后得到具有茶多酚涂层的装载葛根素的大分离蛋白-季铵盐壳聚糖中空微胶囊。葛根素的包封效率在25％～40％，随后通过茶多酚涂层后，葛根素的损失率在10％-20％，去除模板后葛根素的装载率为15％-20％

本发明的有益效果是：本发明制备出的茶多酚涂层的大豆分离蛋白-季铵盐聚糖微胶囊经体外模拟释放试验表明对葛根素的释放具有显著的缓释作用，并且胶囊制备材料安全无毒，生物相容性好。

附图说明

图1是本发明的结构流程图；

图2是本发明中具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的粒径电位图；

图3是本发明中具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的CLSM图像；

图4是本发明中具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的的SEM图；

图5是本发明中具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的体外释放图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

如图1所述；一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，具体操作步骤如下：

实施例：

一、茶多酚涂层的季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的制备：

(1)、将0.3M的碳酸钠溶液和0.3M的氯化钙溶液等体积混合后，在600rpm的转速下搅拌1min，停止搅拌后静置30min，然后真空抽滤去除上清液，收集沉淀得到碳酸钙球形颗粒并用蒸馏水抽滤洗涤3次，洗涤完毕后冷冻干燥；

(2)、将冷冻干燥后的碳酸钙颗粒按照料液比1:100(w/v)加入1mg/ml的大豆分离蛋白溶液中，室温下在200rpm的转速下搅拌1h，停止搅拌将混悬液进行真空抽滤，所得沉淀加入纯化水，离心洗涤3次；取少量样品分散在纯化水中测量Zeta电位。

(3)、将所得沉淀按照料液比1:100(w/v)加入1mg/ml的季铵盐壳聚糖溶液中，室温下200rpm的转速搅拌30min，停止搅拌后将混悬液进行真空抽滤，所的沉淀加入纯化水，离心洗涤3次；取少量样品分在纯化水中测量Zeta电位；

(4)、重复上述步骤(2)、(3)，直至碳酸钙模板表面沉积所需聚合物涂覆层数后，将所得样品按照料液比1:50(w/v)加入到葛根素溶液当中，在300rpm的转速下搅拌过夜，然后将沉淀在10000rpm的转速下离心10min，用纯化水反复洗涤三次，得到装载葛根素的大豆分离蛋白-季铵盐壳聚糖微胶囊；

(5)、将微胶囊收集并按照料液比1:100(w/v)分别加入到不同浓度梯度的茶多酚溶液当中(2.5/5/10mg/ml)，然后在300rpm的转速下搅拌2h，搅拌完成后8000rpm离心5min，洗涤3次以去除胶囊表面残留的茶多酚溶液，将离心所得样品进行冷冻干燥，48h后制得干燥的茶多酚涂层的微胶囊；

(6)、将茶多酚涂层的大豆分离蛋白-季铵盐壳聚糖按照料液比1：100(w/v)分散在0.25M EDTA溶液中，以去除CaCO3颗粒，搅拌1h后洗涤离心，去除过程重复两次后用纯化水离心洗涤三次(1000rpm，5min)；最终得到载有葛根素的茶多酚涂层的季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白中空微胶囊。

二、季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的表征与结构：

(1)、季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的粒径与电位：

研究表明层层自组装法制备以碳酸钙作为模板的微胶囊时，其粒径的大小与分布，Zeta电位电性的转变，均能表明大分子聚电解质在碳酸钙表面的沉积情况；取10mg微胶囊样品，加入1ml的纯化水，分散均匀后使用粒度仪通过DLS动态光散射法测量微胶囊的粒径大小与分布；将样品加入电位池中通过电位仪测量胶囊表面的电位分布；如图2所示，随着微胶囊表面沉积聚电解质层数的增加，整体颗粒粒径呈现增大的趋势，PDI粒径分布系数增大，表明微胶囊粒径分布逐渐开始不均匀，分散性降低；Zeta电位测量结果表明，碳酸钙模板表面呈现正电性，与文献报道一致，随着带有相反电荷的大豆分离蛋白和季铵盐壳聚糖的交替涂层，电位依次发生正负电性的变化，表明聚电解质在微胶囊表面的发生了静电结合。

(2)、季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的CLSM图：

碳酸钙模板表面具有多孔结构，对药物进行装载时，药物被碳酸钙表面沉积的聚电解质吸附后继续向碳酸钙颗粒内部渗透；如图3所示，当水溶性荧光染料罗丹明B在微胶囊中装载后，在525nm的激发波长下，通过激光共聚焦显微镜可以观察到罗丹明B在微胶囊中的分布图像；整体荧光图像呈现球形颗粒状，表明药物在微胶囊中渗透完全，分布较为均匀，可作为水溶性药物分子的优良载体；通过测量罗丹明B溶液的紫外吸收光谱，可以动态监测微胶囊的药物装载过程；图中箭头方向所示为75mins内溶液在525nm处的紫外最大吸收峰的变化趋势，紫外吸收峰强度的降低是因为溶液浓度的减小，表明微胶囊成功装载部分罗丹明B。

三、季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的SEM图像：

扫描电子显微镜可以对微胶囊的表面微观结构进行观察，为了进一步表征和验证制备得到的微胶囊的结构特征，拍摄了微胶囊的SEM图像；如图4所示，碳酸钙模板制备的微胶囊呈现规整的球形结构，季铵盐壳聚糖和大豆分离蛋白在颗粒表面的层层沉积不会影响球形颗粒的表面光滑程度和完整性；通过EDTA溶液去除碳酸钙模板后，微胶囊的表面会塌陷，球形结构会转变为不规则形；然后，经过三种不同浓度的茶多酚溶液涂层后的微胶囊，经过EDTA溶液去除碳酸钙颗粒后，微胶囊表面变得凹凸不平，整体呈现不规则的颗粒状，说明茶多酚的涂层并没有对微胶囊的表面结构产生较大影响。

四、季铵盐壳聚糖-大豆分离蛋白微胶囊的体外模拟释放图：

如图5所述，称取等质量的经过不同浓度茶多酚溶液(0、2.5、5、10mg/ml)涂层的空心微胶囊，分别加入到10ml装有PH＝2,8的柠檬酸缓冲液的离心管中，将装有微胶囊的离心管置于37℃的恒温振荡摇床中以200rpm的转速进行体外释放实，间隔一定的时间从离心管中取200μL的溶液，离心(8000rpm，5min)后去上清液，通过液相色谱仪器，以甲醇和水作为流动相，在紫外波长250nm处检测上清液中葛根素的含量，以观察其释放情况，通过计算得到葛根素在不同PH条件下的累计释放百分数；

茶多酚涂层的微胶囊对装载的药物具有PH响应的特点，对葛根素在不同PH条件下相较于空白组均具有良好的缓释性能；在PH条件下同的情况下，随和茶多酚溶液浓度的增加，涂层后微胶囊对葛根素的缓释性能显著增强；在PH＝2时，8h内未进行茶多酚涂层的微胶囊对葛根素累计释放70％，而对于不同浓度的茶多酚溶液，在酸性条件下的释放速率加快，随茶多酚浓度的增加而减缓葛根素的释放；在碱性条件下由于茶多酚中的多酚类物质自发聚合形成致密的分子层覆盖在微胶囊表面从而导致葛根素的释放速率显著减缓，8h内累计释放百分数均低于30％，具有显著的缓释作用。

最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则；其他的变形也可能属于本发明的范围；因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视为与本发明的教导一致；相应地，本发明的实施例不限于本发明明确介绍和描述的实施例。

Claims

1.一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

步骤(1.3)、将离心洗涤所得的沉淀加入到季铵盐壳聚糖溶液中，搅拌后将混悬液进行真空抽滤，所的沉淀离心洗涤；

2.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.1)中，所述氯化钙和碳酸钠浓度为0.2-0.4mol/L,反应温度为20-40℃，搅拌时间为1-10min，静止时间为10-60min。

3.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.2)中，所述碳酸钙与大豆分离蛋白溶液的料液比为1:50-100(w/v)，大豆分离蛋白浓度为0.5-3mg/ml，搅拌时间为1-3h，离心洗涤过程中使用的溶剂为纯化水，离心转速8000-10000rpm，离心时间为5-10min。

4.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.3)中，步骤(1.2)中所得沉淀与季铵盐壳聚糖溶液的料液比1:50-100(w/v)，季铵盐壳聚糖浓度为0.5-3mg/ml，搅拌时间为0.5-3h，离心洗涤过程中使用的溶剂为纯化水，离心转速8000-10000rpm，离心时间为5-10min。

5.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.4)中，所述得到的沉淀与葛根素溶液的料液比1：50-100(w/v)，葛根素溶液浓度1-4mg/ml，搅拌速度100-500rpm，离心转速8000-10000rpm，离心时间5-10min。

6.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.5)中，所述茶多酚溶液的浓度为1-10mg/ml，微胶囊与茶多酚溶液的料液比为1：50-100(w/v)，搅拌转速100-300rpm，搅拌时间1-6h，每次离心时间5-10min，离心速率8000-10000rpm。

7.根据权利要求1的一种具有茶多酚涂层的大豆分离大白-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于，在步骤(1.6)中，所述料液比为1:50-100(w/v)，EDTA溶液的浓度为0.1-0.5mol/l，搅拌时间0.5-3h，离心速率8000-10000rpm，离心时间5-10min。