CN111989094A - 用于治疗急性脑损伤的化合物 - Google Patents

用于治疗急性脑损伤的化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN111989094A
CN111989094A CN201980011451.6A CN201980011451A CN111989094A CN 111989094 A CN111989094 A CN 111989094A CN 201980011451 A CN201980011451 A CN 201980011451A CN 111989094 A CN111989094 A CN 111989094A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
aryl
branched
ipr
straight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980011451.6A
Other languages
English (en)
Inventor
A·B·克莱因
A·N·克拉克森
J·M·霍尔顿
U·勒斯
R·P·克劳森
B·弗吕隆德
P·韦伦多夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobenhavns Universitet
Otago Innovation Ltd
Original Assignee
Kobenhavns Universitet
Otago Innovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kobenhavns Universitet, Otago Innovation Ltd filed Critical Kobenhavns Universitet
Publication of CN111989094A publication Critical patent/CN111989094A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/74—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C69/757—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/167—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the nitrogen of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. lidocaine, paracetamol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/235—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids having an aromatic ring attached to a carboxyl group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C201/00—Preparation of esters of nitric or nitrous acid or of compounds containing nitro or nitroso groups bound to a carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/40—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/62—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atom of at least one of the thio groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/42—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C59/54—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups containing six-membered aromatic rings and other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/42—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C59/56—Unsaturated compounds containing hydroxy or O-metal groups containing halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/732—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids of unsaturated hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/02—Systems containing two condensed rings the rings having only two atoms in common
    • C07C2602/14—All rings being cycloaliphatic
    • C07C2602/32—All rings being cycloaliphatic the ring system containing at least eleven carbon atoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及根据式I的化合物，其中当R5为H且R1和R2形成环体系时，则所述化合物选自以下式II或式IV的化合物，或者当R2为H且R1和R5形成环体系时，则所述化合物具有式III

Description

用于治疗急性脑损伤的化合物
发明领域
本发明涉及适合用于治疗急性脑损伤的新化合物。本发明还涉及已知化合物如化合物A、B、C和D用于治疗急性脑损伤的用途。
发明介绍
由于血流减少的发作如中风、创伤或神经变性疾病对脑或脊髓(称为中枢神经***，CNS)的损伤导致行为功能的丧失且恢复有限。功能的丧失通常以两种方式发生。第一种是，损伤在受损的中心造成完全损害，导致控制身体功能如运动、感觉、记忆或语言的神经回路的损害。第二种是，损伤引起邻近损伤部位的神经回路(称为梗死灶周围皮层)的部分损害，并使这些回路的功能丧失。
中风从性质上可以是缺血性或出血性的，它是世界范围内的主要健康问题，经常导致长期失能。随着人口老龄化，中风患者的数量将增加，对社会造成了重大的社会和经济负担。迄今为止，唯一可用的医学疗法是施用组织纤溶酶原激活物(tPA)，即溶栓治疗，其必须在中风发作后4.5小时的时间窗内给予。因此，对于能够在脑缺血早期阻止神经元死亡的神经保护性化合物，存在巨大的未满足的需求。
现有技术的现状
药物中风治疗中的现有技术限于急性静脉内施用溶栓药物tPA。tPA通过溶解血凝块和开通脑血管起作用。tPA因为通过在急性损伤后恢复血流并防止脑中缺血性细胞死亡的扩大而起作用，因此是一种"神经保护性"疗法。tPA在功能恢复中产生适度的行为益处，但治疗窗非常窄。tPA必须在患者中风后4.5小时内递送，否则与tPA施用相关的风险将超出任何潜在益处。目前，这个时间窗阻碍了所有中风患者中约90％的患者施用tPA。此外，这种治疗仅在中风患者的亚群中有效。例如，tPA不是出血性中风后的适当治疗选择，因为药物"破裂凝块"的特性可加剧这种类型中风的出血。因此，非常需要扩展治疗的窄治疗窗并促进神经功能改善的化合物。
发明描述
对保护CNS免受由创伤和局部脑低灌注或全身性低灌注(例如中风、伴有心脏停搏的血液动力休克、心力衰竭或手术期间)的状况引起的神经变性或损伤的药剂的高度未满足的需要，已经促使研究人员寻找新的可成药的靶标。靶向N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和/或具有抗炎性质的化合物在临床前模型中已显示出有希望的结果，并已导致广泛的临床测试。遗憾的是，几乎所有这些化合物都没有通过临床试验，血凝块溶解剂仍然是唯一批准的药学治疗。各种tPA治疗的缺点包括相当有限的治疗窗(其为中风后4.5小时内)以及可能的出血性畸形。由于缺血性中风的发生和医疗关注之间通常存在延迟，这种类型的治疗通常受到禁忌。因此，需要其他化合物以便在缺血性中风后在临床相关的时间框内停止和预防神经元死亡。
GHB(γ-羟基丁酸)是天然存在的GABA(γ-氨基丁酸)代谢物和神经调节物，其以微摩尔浓度存在于哺乳动物的脑中。GHB(羟丁酸钠)既在临床上用作嗜睡症的处方药，又用作娱乐性药物(例如***(Fantasy))。GHB显示出与GABAB受体的低亲和力(毫摩尔)结合和与神经元中特异性蛋白的高亲和力(纳摩尔至微摩尔)结合。由GABAB受体介导的，GHB的一种公认的药理学作用是降低体温(Kaupmann等，2003)。相比之下，与高亲和力结合位点相关的神经生理和药理作用仍然未知，原因是尚未弄懂该结合位点的精确分子身份。
本发明提供了具有以下通式(式I)的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002614849150000021
其中，当R5为H且R1和R2形成环体系时，则所述化合物选自下列式II或式IV的化合物
Figure BDA0002614849150000031
其中
n是0或1；
X选自O或NH；
Y是NH、O、S、CH2；
R3选自H；直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基、支链己基；-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure BDA0002614849150000032
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基或己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；-C(＝O)-C1-C6-烷基，其中烷基是直链或支链的，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure BDA0002614849150000033
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基或己基；尤其是，R12选自H、-Me、-Et、-iPr、-iBu；
R6和R7彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；C1-8烷基包括Me、Et、Pr、Bu、戊基、己基、庚基、辛基–烷基为直链或支链的；
或者，当R2为H且R1和R5形成环体系时，则所述化合物具有式III
Figure BDA0002614849150000041
其中
n是0或1；
X为O或NH；
m是0或1；
R3选自H；直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基、支链己基；苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure BDA0002614849150000042
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基或己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；-C(＝O)-C1-C6-烷基，其中烷基是直链或支链的，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure BDA0002614849150000051
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基或己基；尤其是，R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R13和R14彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；C1-8烷基包括直链或支链的Me、Et、Pr、Bu、戊基、己基、庚基、辛基–烷基是直链或支链的；
条件是所述化合物不是下列之一：
Figure BDA0002614849150000052
其中R’是COOH，R”是H，R”’是OCH3，或
其中R’是COOH，R”是CH3，R”’是OH。
在本发明范围内的有同分异构体、互变异构体、对映异构体、外消旋形式或其混合物以及氘化衍生物。因此，例如式I的化合物可以以R或S形式存在，所有这些形式以及外消旋混合物都包括在本发明的范围内。
在本发明上下文中，术语直链或支链C1-C6-烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基和其他支链戊基、己基和支链己基。术语直链或支链C1-C8-烷基包括如上所述的直链或支链C1-C6-烷基和庚基、支链庚基、辛基和支链辛基。
特别感兴趣的化合物是那些，其中
i)所述化合物具有式II或式III，并且其中n为0；
ii)所述化合物具有式IV，并且n为1；
iii)R3和R4之一是H；
iv)R3和R4都是H；
v)所述化合物具有式III，并且R13为H，且R14在1位或2位；
vi)所述化合物具有式III，并且R13为H，且R14选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基或-CH＝CH-芳基；
vii)所述化合物具有式III，并且R13为H，且R14选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-芳基；
viii)所述化合物具有式III，其中R13为H，且R14选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-苯基；
ix)R3选自
Figure BDA0002614849150000061
或者R4选自
Figure BDA0002614849150000062
x)R3是
Figure BDA0002614849150000063
xi)所述化合物具有式II，并且R4是H且R3是
Figure BDA0002614849150000071
xii)所述化合物具有式III，其中n＝0，R3为H，X为O，R4为H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，R14为H；
xii)所述化合物具有式III，其中n＝0，R3选自H、-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu和Ph；X是O，R4是H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，R14是H；
xvv)所述化合物具有下列结构之一
Figure BDA0002614849150000072
Figure BDA0002614849150000081
Figure BDA0002614849150000091
*这些化合物仅医药用途在本发明的范围内。
本发明还涉及式(I)的化合物用于医药中。
必然地，对于化合物A、B、C和/或D，排除所述医药用途。
更具体地说，本发明涉及式(I)的化合物，用于治疗本文所定义的急性脑损伤。
本发明公开了3-羟基-1-环戊烯甲酸(A)，(Wellendorph等，2005)，这是一种内部开发的GHB类似物，具有对抗急性脑损伤的神经保护性质。预期式(I)的化合物具有相似的神经保护性质。然而，与GHB相反，A对GABAB结合位点不显示任何亲和性(Klein等，2016；Wellendorph等，2005)，因此不具有镇静作用，该作用成为GHB的一个问题。A仅结合那个"尚未弄懂的"高亲和力位点。该结合位点已经用放射性标记形式的(E,RS)-6,7,8,9-四氢-5-羟基-5H-苯并环庚-6-亚基乙酸(NCS-382，B)(称为3H-B)探测过。最近，本申请发明人已经开发了放射性标记形式的A(3H-A)(Vogensen等，2013)，并且使用它，表征并显示3H-A结合主要限于小鼠、大鼠和猪的皮层和海马体脑区(Klein等，2016)。本申请发明人已经表明，A的钠盐在外周给药后容易进入脑(Thiesen等，2015)，并在体内特异性结合该高亲和力靶标，在给药高达500mg/kg的剂量后在啮齿类动物中没有明显观察到急性毒性或镇静作用。
本发明进一步公开了(E)-2-(5-羟基-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(2)，这是内部开发的一种新型的B类似物，具有对抗急性脑损伤的神经保护性质。本申请发明人进一步表明2和相关的类似物1、3-10与由3H-A和3H-B探测到的"尚未弄懂的"高亲和力位点结合并穿过细胞膜。
本申请发明人发现，A对中风后最小化细胞损伤的程度和改善功能恢复具有显著作用。具体地，在诱导梗死后3-7天，施用A引起梗死尺寸的减小和运动功能的剂量依赖性改善。在本文的实施例中，在诱发局灶性中风后30分钟、3、6或12小时，将A施用至运动皮层。令人惊奇地，并且对于A在急性脑损伤治疗的临床应用中至关重要的是，即使在诱导梗死后长达12小时给药时，A对梗死尺寸和运动性能都具有显著作用。类似地，当在诱导损伤后3或6小时，以钠盐形式外周给药时，2提供显著的神经保护作用。
A和2的神经保护潜能的潜在机制仍是推测性的。众所周知，GHB降低体温，并降低神经元中的氧和葡萄糖消耗。这种机制也已经在临床研究中被证明可用作中风后治疗。然而，应当注意的是，已经报道了具有轻度的低体温反应并提供了显著保护的GABA调节物，如氯美噻唑，仅延迟但不阻止导致细胞死亡的级联事件。这凸显了需要监测药物诱导的低体温症(hypothermia)，并排除可能诱导这种反应的药物或受体***，例如GABAB。GHB对体温的控制已显示是由GABAB受体介导(Kaupmann等，2003)，并且与GHB不同，A不与GABAB受体结合(Wellendorph等，2005)。与此一致，本申请发明人表明，A在高剂量时不降低小鼠的体温，这凸显了低体温症与A的神经保护活性无关。另一方面，总体中央葡萄糖代谢率降低似乎是非GABAB介导的作用。考虑到化合物2能够结合相同的高亲和力结合位点，因此预期其通过类似的机制起作用。
在靶向中风的药物开发计划中，一个充分研究的方法是使用免疫调节化合物。不断积累的证据支持了促炎反应的激活和梗死尺寸之间的关联。同样，已发现血脑屏障(BBB)的破坏使缺血性中风后的结果恶化，原因可能是浸润淋巴细胞和嗜中性粒细胞的进入增加。为了研究A是否能减少脑缺血的这些有害后果，本申请发明人考察了所选炎症性标记物以及BBB破坏物、胞外蛋白酶MMP9(中风研究中熟知的一种药物靶标)的表达水平。证实了先前关于MMP9在中风后(12和72小时)严重上调的发现，本申请发明人观察到A显著降低了这种上调。此外，当研究缺血性中风后合并A治疗情况下炎症性标记物的表达时，本申请发明人可以确认，中风期间发生的脑损伤驱动持久的炎症性反应，A能够抑制该炎症性反应。
本申请发明人最近鉴定了GHB、A、B和GHB相关类似物(包括已知的化合物2-((2,6-二氯苯基)氨基)-5-羟基苯基乙酸(C)和新化合物1和2)的高亲和力结合位点的分子性质，其为钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CAMK2A)。CAMK2A是十二聚体酶，是突触后致密区中最丰富的蛋白之一(总蛋白的2-6％)。CAMK2A参与许多作用，包括磷酸化和突触活性的调节，并且在长时程增强和记忆形成中起关键作用。此外，CAMK2A蛋白表达在缺血性中风后在梗死灶周围区域中上调。已知CAMK2A磷酸化α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(AMPA)和NMDA受体两者，并且考虑到它与缺血性中风有关，CAMK2A是一个有前途的药物靶标(Coultrap等，2011)。在中风和全脑缺血的临床前模型中直接调节CAMK2A活性，产生了显著的神经保护作用。使用抑制性肽Tat-CN21调节CAMK2A已经显示出了在中风后治疗中的前景(Vest等，2007)，并且CN21已经显示出了对缺血诱导的该激酶Thr286(pThr286)残基的自磷酸化的增加的抑制作用(Ahmed等，2017)。然而，除了与肽的一般用途相关的稳定性和细胞渗透性以及生物利用度的潜在问题之外，Tat-肽还已知引起高血压。显然，将CAMK2A的调节作为脑缺血中的靶标并非微不足道(Coultrap等，2011)。例如，在小鼠敲除模型中完全消除CAMK2A似乎加重了缺血性中风后的脑损伤(Waxham等，1996)。本申请发明人假设，A的功能机制来自于其与CAMK2A活性的直接相互作用和调节，例如，如CN21所见的预防缺血后pThr286的自磷酸化。然而，本申请发明人获得的数据表明，A、2和CN21的结合位点之间存在巨大差异。虽然已知CN21直接与CAMK2A的T-位点相互作用(Vest等，2007)，但预期化合物A和相关GHB类似物结合到CAMK2A的激酶结构域、调节结构域或中心结构域。考虑到不存在CAMK2A的选择性小分子非肽配体，所提供的化合物也可以代表新的作用机制。
A和相关类似物的物理化学特性、它们的快速吸收、进入脑以及在腹膜内给药后几分钟内与靶标结合，使得这些小分子非常令人感兴趣。预期式I、II、III和IV的化合物也具有可接受的物理化学性质。
本申请发明人在此证明，A和新的类似物2显示了显著的神经保护性质，因此有希望作为减少急性脑损伤后神经元死亡的候选物。
定义：
急性脑损伤
本文所用的术语"急性脑损伤"是指以急性方式损害脑组织并且还启动破坏性神经毒性作用级联的原发性脑损伤或缺血性损伤。实例包括创伤性脑损伤、中风、蛛网膜下出血、新生儿缺氧-缺血脑病或相关的子宫内并发症、伴有心脏停搏的血液动力休克以及手术期间的或作为心力衰竭的结果的全身性低灌注。
本发明化合物(也称为GHB相关类似物)
本文所用的术语"GHB相关类似物"是指本发明的化合物，其具有共同的GHB相关结构(式I)并结合至CAMK2A中的独特位点，例如本发明的A、B、C、1、2或其他化合物。
自磷酸化
本文所用的术语"自磷酸化"是指CAMK2A在残基Thr286、Thr305和Thr306上的磷酸化。
CAMK2A
本文所用的术语"CAMK2A"是指IIα型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶。
脑葡萄糖代谢率(CMRglc)
本文所用的术语"CMRglc"是指通过14C-2-脱氧葡萄糖放射自显影测量的脑葡萄糖代谢的变化。
出血性
本文所用的术语"出血性"是指涉及脑内或周围出血的中风。
缺血
本文所用的术语"缺血"是指组织的血液供应的中断，其限制氧和葡萄糖的递送。
神经保护性
本文所用的术语"神经保护性"是指化学物质保护神经细胞不受损害(例如由脑的急性损伤诱导的神经细胞损害)的能力。
梗死灶周围
本文所用的术语"梗死灶周围"是指梗死灶周围的区域。
永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)局灶性缺血
本文所用的术语"pMCAO"是指流向由大脑中动脉供血的区域所限定的区域的动脉血流的永久性中断。
光亲和标记
本文所用的术语"光亲和标记"是指在UV光刺激下共价结合至其靶标的化学探针的UV光诱导的活化。
光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血(Photothrombotic focal ischemia)
本文所用的术语"光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血"是指通过与腹膜内注射递送的光敏染料的光化学反应引入皮层梗死的方法。
重组
本文所用的术语"重组"是指已转染入HEK293T细胞并在其中表达为蛋白质的DNA序列。
创伤性脑损伤(TBI)
本文所用的术语"创伤性脑损伤"是指对脑的急性损害，其可导致脑的正常功能受到破坏。
附图说明
图1：使用A)3H-B或B、C、D)3H-A进行放射性标记，GHB相关类似物A、B、C、1-10以纳摩尔的亲和力结合到高亲和力的前脑结合位点。该结合位点不识别已知的肽CN21。
图2：化合物A不结合GABAB受体，而GHB结合。
图3：化合物A在小鼠中不产生GABAB受体介导的低体温症，而GBL(GHB)产生。
图4：GHB前药GBL(200mg/kg)导致不是由GABAB受体介导的脑葡萄糖利用的降低。
图5：在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血诱导3天之后30分钟较早地给小鼠给药(i.p.)时，化合物A(175mg/kg)显著减小梗死尺寸。
图6：在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血诱导3天之后30分钟较早地给小鼠给药(i.p.)时，化合物A(17.5或175mg/kg)显著改善了A)网格行走或B)圆筒任务中受影响肢体的运动性能。
图7：A)在光化学诱导的血栓形成性局灶性损伤产生3天之后3、6或12小时较早地给小鼠施用(i.p.)时，化合物A(175mg/kg)显著减小梗死尺寸。B)90mg/kg的剂量具有类似的神经保护作用。
图8：在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血损伤产生3天之后3、6或12小时较早地给小鼠给药(i.p.)时，化合物A(175mg/kg)显著改善了受影响肢体在A)网格行走或B)中的运动性能。
图9：当A)在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血损伤产生7天后3或6小时(175mg/kg)较早地给小鼠给药(i.p.)时，化合物2显著减小梗死尺寸，并且B、C)显著改善了在损伤后第7天测量的网格行走和圆筒任务中的运动性能。D)类似地，在50mg/kg、3小时时的情况下，化合物2减少了梗死尺寸，并且E、F)改善了在损伤后第7天测量的网格行走和圆筒任务中的运动性能。
图10：当在光化学诱导的血栓形成性局灶性损伤后A、B、C)3天或者D)12小时测量时，化合物A显著减少分子标记物CD14和MMP9的表达。
图11：当在光化学诱导的血栓形成性局灶性损伤后4小时测量时，化合物A显著降低促炎细胞因子IL-6的血浆表达水平。
图12：当pMCAO局灶性损伤产生3天后30分钟较早地对小鼠给药(i.p.)时，化合物A(175mg/kg)显著减小梗死尺寸。
图13：当pMCAO局灶性损伤产生2-3天后30分钟较早地给药时，化合物A(175mg/kg)改善了感觉运动损伤。效果见于A、B)旋转杆、C)握力和D)Hargreaves试验中。
图14：3H-A放射性配体与前脑区域的特异性结合证实了A的脑穿透和靶点募集(target engagement)。小鼠在切开脑前30分钟用放射性配体(每只小鼠5MBq)注射(i.p.)并进行放射自显影。
图15：CAMK2A是哺乳动物脑中GHB的高亲和力结合位点，这是通过A)光亲和标记和蛋白质组学鉴定的，并通过B)Western印迹和C、D)放射性配体结合研究得到验证。
图16：GHB以及类似物A、B、C、1和2直接与在HEK293T细胞中瞬时表达的重组CAMK2A结合。
图17：化合物A和2的细胞摄取是由它们对tsA201细胞中内源存在的质子偶联转运蛋白的底物活性介导的。
图18：对进行了光化学诱导的血栓形成法的小鼠的组织进行的离体pThr286自磷酸化试验表明，化合物A减少了过多的自磷酸化。
实施例
材料和方法
大鼠脑膜结合试验
根据以前公开的方案，使用从大鼠皮层制备的粗突触膜，在3H-A、3H-B或3H-GABA结合试验(针对GABAB)中评价化合物(Wellendorph等，2005，和Klein等，2016)。对于3H-A和3H-B结合，将膜与渐增浓度的测试化合物，或者对于非特异性结合与1-10mM GHB一起，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0或pH 7.4)中在96孔配体平板中于0-4℃温育1小时。温育后，使用96孔Packard细胞收集器(PerkinElmer)通过GF/C单滤器(PerkinElmer，Boston，MA，USA)快速过滤，以及用冰冷的结合缓冲液快速洗涤三次，将microscint闪烁液(PerkinElmer)加入经干燥的滤器中，并在Packard TopCount微板闪烁计数器(PerkinElmer)中定量滤器结合的放射活性的量。对于GABAB受体结合试验，将膜与浓度渐增的测试化合物，或者对于非特异性结合与100μM巴氯芬(Sigma)一起，在含有2.5mM CaCl2和40μM异去甲槟榔次碱(isoguvacine)(Sigma)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，在48孔装置中于室温下孵育1小时。使用Brandell 48-孔收集器，通过经过浸泡在0.1％聚乙烯亚胺中的GF/C滤器(Whatman)快速过滤，并通过用冰冷的结合缓冲液快速洗涤，终止结合反应。向经干燥的滤器中加入Optifluor闪烁液(PerkinElmer)，并在Tricarb 4910TR闪烁计数器(PerkinElmer)上测定计数。数据表示为(相对于对照)的特异性结合％，IC50或Ki值分别通过非线性回归曲线拟合和Cheng-Prusoff方程计算。
温度记录
在实验前将小鼠用腹膜内盐水注射(0.9％盐水)预处理4天，以使实验当天的应激最小。实验在安静的房间中进行，其中在实验前使小鼠不受干扰至少两小时。i.p.注射后，将小鼠留在它们的笼子中2小时，记录核心体温，然后实施安乐死。用温度计(DM852型；ELLAB Instruments；Copenhagen，丹麦)经由润滑的热敏电阻探头(PRA-22002-A型，直径2.2mm；ELLAB Instruments)直肠测量核心体温。在尾基部抓住小鼠并测量，直到获得稳定的温度测量结果。
葡萄糖代谢研究
使用rCMRglc半定量指数(irCMRglc)(其避免了在整个实验中需要进行血液取样)，在有意识的***GABAB(1)受体敲除小鼠(Kaupmann等，2003)中测量局部脑葡萄糖代谢率(rCMRglc)。GBL(200mg/kg)或盐水腹膜内注射后10分钟，用溶解在0.4ml盐水中的5μCi 14C-2-脱氧葡萄糖(比活性为54.1mCi/mmol，Sigma，UK)腹膜内注射小鼠。45分钟后，通过颈椎脱臼法对小鼠实施安乐死，将脑速冻并储存在-80℃直至切片。在对应于前囟的2.68、1.34、0.74、-1.7、-3.08和-5.68mm处收集20μm的冠状切片，并解冻封固在载玻片(FischerScientific，丹麦)上。通过利用14C-微米级(14C-microscales)(Amersham，UK)将切片暴露于盒中的14C-敏感板(Science Imaging Scandinavia AB，Nacka，瑞典)五天，产生放射自显影图像。最后，在BAS-2500扫描仪(Fujifilm Europe GmbH，Düsseldorf，德国)上扫描成像板。通过使用ImageJ测量像素密度来计算额叶皮层和海马体中的特异性和非特异性结合，并使用校准表将其转化为nCi。
光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血小鼠模型
所有程序都是按照由Otago大学动物研究委员会所提出的实验室动物的护理和使用指南以及实验室动物护理和使用指南(NIH出版号85-23，1996)进行的。所有体内研究都得到了Otago大学动物伦理委员会的批准，并根据ARRIVE(Animal Research:Reporting InVivo Experiments)指南进行了报告。光化学诱导的皮层损害模型类似于临床上与中风和创伤性脑损伤(TBI)相关的急性脑损伤的情况。如以前所述(Clarkson等，2010)，在重～23-30g的雄性C57BL/6J小鼠(8-10周)中通过光化学诱导血栓形成法(photothrombosis)诱导局灶性缺血。在用异氟烷(在O2中含2％至2.5％)麻醉下，将小鼠置于立体定向装置中，通过中线切口暴露颅骨，清除***并干燥。将与40x物镜相连的提供2mm直径照明的冷光源(KL1500 LCD，Zeiss，Auckland，新西兰)置于前囟侧面1.5mm处。然后，腹膜内施用0.2mlRose Bengal(Sigma-Aldrich，Auckland，新西兰；在生理盐水中为10mg/ml)。5分钟后，使光线通过所暴露的完整颅骨对脑部进行光照15分钟，同时使用加热垫(Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA)将体温保持在37.0±0.3℃。将皮肤粘合，并在唤醒阶段期间将动物留在放置在加热垫上的笼中。将小鼠关在12小时的光照/黑暗循环下，随意获取食物和水。此外，每天监测小鼠并称重。
用于体内研究的化合物来源和化合物的制备
如以前所述(Vogensen等，2013)，内部合成A的钠盐。GHB的钠盐、GHB前药γ-丁内酯(GBL)、NCS-382(B)、双氯芬酸和4'-羟基双氯芬酸购自Sigma-Aldrich，而C获自Carbosynth或SantaCruz(Berkshire，UK)。CN21肽从Genscript获得。
对于体内研究，将所有化合物溶解在无菌盐水和H2O的混合物中以获得等渗性(0.9％)，并以10mg/ml、10μl溶液/克小鼠体重施用。在光化学诱导的血栓形成性中风的诱导后30分钟、3、6或12小时，进行化合物的注射(i.p.)。在相同的时间点(30分钟、3、6或12小时)，溶媒组接受相应体积的盐水(0.9％)。
光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血模型中的行为评估
如以前所述(Clarkson等，2010)，使用圆筒和网格行走任务来确定前肢运动性能。分别在缺血性损伤之前1周和之后3天或7天的测试前和测试后阶段测试所有动物。对行为进行评分的观察者对治疗组是不知情的。
永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)局灶性缺血模型
使用年龄匹配的年轻成年的(7-8周)雄性C57BL/6J小鼠(Taconic)进行pMCAO研究。将小鼠关在单独的日间照明下的笼中，并自由获取食物(1314Altromin)和水。根据丹麦动物伦理委员会批准的指南，在手术前使小鼠适应7天。
局灶性脑缺血是由左侧大脑中动脉(MCA)远端部分的永久阻塞造成的。通过注射Hypnorm(柠檬酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮10mg/ml；Jansen-Cilag)、Stesolid(5mg/ml安定；Dumex)和蒸馏水(1:1:2；0.20ml/10g体重，s.c.)的混合物麻醉小鼠。将小鼠放置在37±0.5℃的温热加热垫上，切开从眼到耳的皮肤。将腮腺和颞肌的上部推开，在MCA的远端部分钻一小孔。通过电凝使MCA阻塞，用4.0尼龙缝线缝合开口。手术后，给小鼠注射1ml等渗盐水，并用软膏涂敷它们的眼睛。使小鼠在28℃的恢复室中从手术中恢复。对于手术后疼痛的治疗，手术后立即开始对小鼠皮下供给0.15ml 1:30稀释的Temgesic(储备液：0.3mg/ml丁丙诺啡(Buprenorphinm)；Reckit&Colman，UK)三次，每次间隔8小时。
pMCAO模型中的行为评估
为了评估感觉运动损伤，在中风后2-3天，在旋转杆、握力和Hargreaves试验中测试动物。
旋转杆(LE8200，Panlab)通过评估动物保持在旋转杆上的时间来测量啮齿动物的运动性能。在中风后48小时，历经5分钟的时间段，杆旋转从0加速至40转/分钟(rpm)，在四次重复试验中测试小鼠，每次间隔20分钟(静息时间)。在手术之前，对小鼠预训练以在4rpm旋转杆上停留30秒。通过测定使小鼠松开其抓握所需的最大力，利用握力计(BIO-GT-3，BIOSEB)研究小鼠的神经肌肉功能。使小鼠抓住金属格栅，然后在水平面上向后拉。将施加到格栅上的力记录为峰值张力。在pMCAO之前(基线)和之后3天，测量单个(右和左)和总的(两个)前爪握力。每只小鼠在五个连续试验中进行测试，最高的握力记录为得分。热痛觉过敏(后爪从正常无害的热源中缩回)用Hargreaves测试装置测试。记录每个后肢五次刺激的潜伏时间，其间至少中断2分钟。除去最低和最高反射潜伏期得分，计算左和右的平均值并作图。
体内研究的统计分析
所有分析均在GraphPad 6.0(San Diego，CA，USA)中进行。所有数据以平均值+/-SEM表示。当对两个组进行比较时，使用未配对t检验，而当对超过两个组进行比较时，进行单向ANOVA并使用Holm-Sidak作为事后检验。对于行为分析，使用双向ANOVA并使用Bonferroni作为事后检验(光化学诱导的血栓形成性缺血数据)或重复测量双向ANOVA(pMCAO数据)。
组织学评估
为了定量梗死的面积，将动物先用盐水灌注，然后用4％多聚甲醛(PFA)灌注，解剖出脑并浸没在4％PFA中进行固定后过夜。然后将脑移至30％蔗糖溶液中并保持在4℃直至处理。将脑切成30μm切片，在防冻培养基中自由漂浮。如Lie等(2017)所述，封固切片，甲苯酚紫染色，并且通过测量整个梗死灶的每第6个切片来确定梗死体积。所有分析由对治疗组不知情的观察者进行。来自pMCAO研究的脑在CO2(气体)中快速冷冻，并加工成六个平行系列的切片(30μm)。将单独的系列收集在载玻片上，用于梗死尺寸分析或收集在Eppendorf管中并用于qPCR。将载玻片储存在-80℃下直至进一步处理，然后如对光化学诱导的血栓形成性光化学法所述进行甲苯酚紫染色和定量。
qPCR
收集梗死灶周围区域的组织，并在中风后12-72小时速冻，按照生产商的说明，使用RNA微型试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用Turbo无DNA试剂盒(Ambion)用DNAse处理所提取的RNA，所有都按照制造商的方案。在标准PCR仪上使用qScriptTM cDNA SuperMix(QuantaBiosciences，Gaithersburg，MD，USA)进行逆转录(25℃5分钟，42℃30分钟，85℃5分钟)，并将cDNA储存在-20℃直至进一步处理。
qPCR在混合有PerfeCTa SYBR Green FastMix(Quanta Biosciences)、无核酸酶的水(Qiagen，West Sussex，UK)和引物(TAG Copenhagen A/S(Copenhagen，丹麦)的96孔板(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)中进行。采用95℃30秒的初始变性步骤，然后进行40个95℃5秒、60℃15秒和72℃10秒的循环，进行PCR。为了确保单一产物扩增，进行由95℃60秒、55℃30秒和95℃30秒组成的解离曲线分析。使用Agilent Mx3005P qPCR***(Agilent Technologies)进行qPCR，并使用相应的MxPro软件测定Ct值。使用2(参考Ct-靶标Ct)计算ΔCt值。
引物序列：
SEQ ID NO 1 CD14(F)AATCTACCGACCATGGAGC
SEQ ID NO 2 CD14(R)ACTTTCCTCGTCTAGCTCG
SEQ ID NO 3 IL-6(F)CTCTGGGAAATCGTGGAAAT
SEQ ID NO 4 IL-6(R)CCAGTTTGGTAGCATCCATC
SEQ ID NO 5 MMP9(F)CAGCCGACTTTTGTGGTCTTC
SEQ ID NO 6 MMP9(R)CGGCCGTAGAGACTGCTTCTI
SEQ ID NO 7 GFAP(F)GGAGATGCGGGATGGTGAG
SEQ ID NO 8 GFAP(R)ACCACGTCCTTGTGCTCCTG
SEQ ID NO 9 Rpl13a(F)GGAGGGGCAGGTTCTGGTAT
SEQ ID NO 10 Rpl13a(R)TGTTGATGCCTTCACAGCGT
SEQ ID NO 11 SDHA(F)GCCCATGCCAGGGAAGATTA
SEQ ID NO 12 SDHA(R)TGTTCCCCAAACGGCTTCTT
血浆中细胞因子的定量
使用LEGENDplex测定试剂盒根据制造商的说明书(BioPlex，BioLegend，SanDiego，CA，USA)进行MCP-1(单核细胞趋化因子蛋白-1)、IL-6(白细胞介素-6)和IL-1a(白细胞介素-1a)的检测。
大鼠脑的GHB高亲和力结合位点的光亲和标记和富集
粗突触膜以0.125mg/ml的浓度与600nM 4-(4-((3-叠氮基-5-(叠氮基甲基)苄基)氧基)苯基)-4-羟基丁酸(SBV3)在4℃黑暗中温育60分钟。对于竞争实验，加入0.1nM-10μM化合物C。然后将膜转移到非组织培养物处理的聚苯乙烯板上，并使用设定为高强度(302nm，8W，M-20V)的UVP Benchtop透照器在室温下照射4分钟。随后用1x PBS洗掉过量的SBV3并离心。对于Staudinger Bertozzi连接，将膜在1x PBS中重悬至浓度为0.5mg/ml，并用0.1％SDS和1mM EDTA在37℃溶解15分钟。加入EZ-LinkTM膦-PEG3-生物素(ThermoFisherScientific)至终浓度为200μM，并将反应在37℃振荡60分钟。在链霉亲和素亲和富集之前，使用PD MiniTrap G25旋转柱(GE Healthcare，Pittsburgh，PA，USA)除去过量的EZ-LinkTM膦-PEG3-生物素。
使用PierceTM高容量链霉亲和素琼脂糖(ThermoFisher Scientific)富集生物素化的蛋白质。将溶解的膜稀释至终浓度为0.01％SDS，并与树脂一起在室温下旋转温育30分钟。富集后进行严格的洗涤程序(用10CV 1x PBS、0.01％Tween洗涤3x 1分钟，以及用10CV1x PBS、0.01％Tween洗涤3x 10分钟)。通过在剧烈振荡下在补充有100μM DTT的1xNuPAGETM LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific)中100℃下煮沸10分钟，洗脱生物素化的蛋白质。将洗脱液上样到NuPAGETM 4-12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisher Scientific)上，并在175V下运行50分钟。根据制造商的说明用GelCodeTM蓝染料(ThermoFisherScientific)对凝胶染色。切下70kDa和25kDa标记物之间的凝胶段(PageRulerTM预染的蛋白质梯，10-180kDa，ThermoFisher Scientific)，并切成1×1mm的立方体。通过使用70ng/条带的内切蛋白酶Lys-C(Sigma-Aldrich)在37℃过夜和175ng/条带的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)在37℃持续8小时，进行凝胶内消化。将肽提取物上样到内部填充的C18STAGE Tips上，并用2×20μl 40％乙腈、0.5％乙酸的水溶液洗脱到96孔微量滴定板中，随后在真空离心机中除去有机溶剂并在2％乙腈、0.5％乙酸、0.1％TFA的水溶液中重构肽。
质谱分析
在与配备有纳电喷雾源的Q-Exactive HF仪器(ThermoFisher Scientific)偶联的Easy-nLC 1000上分析所有样品。肽在内部用1.9μm C18珠(Dr.Maisch，德国)填充的15cm分析柱(75μm内径)上分离。使用集成柱温箱(PRSO-V1，Sonation GmbH，Biberach，德国)将柱温保持在40℃。通过在0.5％乙酸中的不断增加的乙腈的线性梯度，以250nl/min的流速分离肽35min。Q-Exactive HF质谱仪以数据依赖性采集模式操作。将喷雾电压设定为2kV，S-lens RF水平设定为50，加热毛细管温度设定为275℃。所有实验以数据依赖性采集模式进行，以根据其强度自动分离和片段化前10个多电荷前体。之前的靶离子被动态排除40秒，并且所有实验都使用正极性模式获得。全扫描分辨率设定为在m/z 200下为60.000，质量范围设定为m/z 350-1400。全扫描离子目标值是3E6，这允许100ms的最大填充时间。使用1.3m/z分离宽度和28的标准化碰撞能量，以用于平行获取的最佳设定获取高能量碰撞解离(HCD)片段扫描。HCD片段扫描的目标值设定为1e5，最大填充时间为45ms，并以60.000分辨率分析。
使用MaxQuant软件(v.1.5.5.1)处理原始LC-MS/MS数据，并针对大鼠和小鼠UniProt数据库(2017年3月13日下载)进行检索。此外，纳入默认的污染物蛋白质数据库，并且对其的任何命中从进一步分析中排除。半胱氨酸的脲甲基化反应被规定为固定的修饰；将丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化、甲硫氨酸的氧化、从谷氨酰胺形成焦谷氨酸和蛋白质N-末端乙酰化设定为可变的修饰。
使用Perseus(v.1.5.6.0,Max-Planck Institute of Biochemistry,Departmentof Proteomics and Signal Transduction,Munich)、Microsoft Office Exel和GraphPadPrism(v.7.0)进行进一步的数据分析。使用MaxQuant进行数据库检索后，使用Perseus处理proteingroups.txt文件：排除仅通过位点鉴定的或来自反向数据库的命中。然后将数据输出到GraphPad Prism，并使用"One site–Fit logIC50"函数对所有蛋白质进行非线性回归。将Top的最佳拟合值和R2值相对于彼此作图以鉴定具有竞争性剂量依赖性行为的蛋白质。
3H-A与HEK293T细胞中表达的重组CAMK2的结合
使用具有GlutaMax、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的Dulbecco's改良Eagle培养基，使用标准条件培养HEK293T，并在37℃在95％O2和5％CO2的潮湿气氛中孵育。根据制造商的方案，使用PolyFect(Qiagen，West Sussex，UK)，用大鼠CAMK2A(Origene构建体RR201121)或大鼠CAMK2B(Origene构建体RR200520)转染细胞。转染后48小时，通过用冰冷的1×PBS洗涤细胞并通过刮取收获来制备全细胞匀浆。收集细胞并以1000×g离心10分钟。将细胞沉淀重悬于冰冷的1×PBS中，并在弹头混合器中使用2×1mm锆珠(zirkoniumbeads)以最大速度匀浆20秒(NextAdvance，NY，USA)。匀浆通过离心(10分钟，4℃，14.000×g)澄清。使用Bradford蛋白质测定法测定蛋白质浓度。将150-200μg蛋白质与5nM 3H-A和测试化合物一起以1ml总体积在0-4℃下温育1小时。用1-10mM GHB测定非特异性结合。然后通过加入冰冷的丙酮(4x测定体积)、涡旋并在-20℃温育1小时，来沉淀蛋白质。将蛋白质迅速通过GF/C单滤器(Whatman)过滤并洗涤。经干燥的滤器加入闪烁液并在Tricarb 2100闪烁计数器(Packard)上测量放射性。
tsA201细胞中MCT介导的GHB类似物的摄取
利用tsA201细胞中MCT的内源表达，使用细胞可渗透的pH敏感染料2′,7′-二(2-羧基乙基)-5(6)-羧基荧光素乙酰氧基甲基酯(BCECF-AM)(Molecular Probes)测量摄取。在测定前一天，将细胞铺板(50,000个细胞/孔)在黑色的涂有聚-D-赖氨酸的底部透明的96孔板(VWR，Radnor，PA，USA)中。在测定当天，除去培养基，通过加入50μl BCECF AM/孔(1.6μM)的缓冲液(补充有20mM HEPES、1mM CaCl2、1mM MgCl2和1.8mM丙磺舒的HBSS，pH7.4)装载细胞，并在37℃避光温育45分钟。然后用100μl缓冲液洗涤细胞两次，并在FlexStation3读数器(Molecular Devices)中于37℃测定细胞板。在添加配体之后，在485/444nm激发之后，在538nm记录发射的荧光2分钟。通过尼日利亚菌素校准曲线将荧光485/444nm转化为细胞内pH。
解剖的小鼠组织中pThr286自磷酸化
与用于光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血的标准方案一起，在损伤后30分钟，用盐水或175mg/kg A(i.p.)处理小鼠。损伤后3小时，处死小鼠，解剖出脑，并立即浸没在补充有1％磷酸酶和蛋白酶抑制剂(磷酸酶抑制剂混合物3#P0044(Sigma)、磷酸酶抑制剂混合物2#P5726(Sigma)和完全EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)的冰冷PBS中5分钟。解剖出梗死灶核心区域的皮层组织(即前囟右侧1.5mm，包括初级运动皮层，直径为2mm)，并在干冰上速冻。使用补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1×RIPA缓冲液和弹头混合器(Bullet Blender)进行组织匀浆。通过Western印迹分析，比较CAMK2A的总水平(使用抗CAMK2A，#NB100-1983，Novus Biologicals定量的)和磷酸化的CAMK2A的水平(pThr286：#12716S，CellSignalling Technology；山羊抗兔HRP：#PI-1000X0126，Vector)，来评估自磷酸化。将pThr286CAMK2A和CaMK2A的水平相对于参考蛋白(抗-GAPDH，#NB300-221，NovusBiologicals)的信号标准化。随后，采用pThr286 CAMK2A的标准化信号和总CAMK2A表达的比值来检测自磷酸化的变化。用冷却的CCD照相机(FluorChem HD2***，ProteinSimple)获得条带的数字图像，并用ImageStudioLite(LI-COR Biosciences)进行密度计分析。
化学合成
除非另有说明，以下实施例中使用的所有试剂均得自商业来源。
通用化学方法
通式IIIa的化合物可以如下所述根据实施例1-3的方法由适当的取代的6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮制备。
Figure BDA0002614849150000241
通式IVa的化合物可以如下所述在无机碱的存在下通过铜催化由2-(2-碘-5-甲氧基苯基)乙酸乙酯和适当的取代的苯胺、苯酚或苯硫酚(X＝N、O或S)制备。X＝CH2可以使用合适的取代的苄基卤通过钯催化的交叉偶联反应由2-(2-碘-5-甲氧基苯基)乙酸乙酯制备。保护基可以被BBr3裂解。
Figure BDA0002614849150000242
实施例1
(E)-2-(2-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(1)的合成
步骤1：在室温下，向NaOH(368mg，9.1mmol)在H2O(4.6ml)和乙醇(10ml)中的溶液中加入2-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)(400mg，1.6mmol)和乙醛酸一水合物(495mg，6.6mmol)在水(10ml)中的混合物。将混合物在室温下搅拌直至溶解，然后回流加热4小时。冷却后，真空除去EtOH，残留的水溶液用Et2O(2×15ml)洗涤，并用HCl调节pH至1，用EtOAc(2×20ml)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并蒸发。残余物通过柱色谱法(DCM/MeOH 9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到369mg(75％)(E)-2-(2-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸，为棕色固体。
步骤2：在氮气气氛下，将CeCl3 7H2O(231mg，0.6mmol)和(E)-2-(2-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(183mg，0.6mmol)溶解在MeOH(30ml)中。在0℃下向该溶液中缓慢加入NaBH4(351mg，9.3mmol)。在室温下搅拌反应4小时，然后真空蒸发溶剂。向残留物中加入H2O(50ml)，用HCl将pH调至1。水相用DCM(3×30ml)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。通过柱色谱法纯化(DCM+1％AcOH)，得到(E)-2-(2-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(120mg，65％)，为白色固体。1H NMR(600MHz,甲醇-d4),δ:7.39-7.36(d,J＝8.2Hz,1H),7.35-7.32(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),7.26-7.25(d,J＝2.0Hz,1H),6.00(s,1H),5.25(s,1H),3.50-3.45(ddd,J＝11.9,6.9,4.3Hz,1H),3.07-3.00(m,J＝14.2,9.1,2.6Hz,1H),2.81-2.71(m,J＝27.5,13.1,9.2,3.5Hz,2H),1.86-1.79(m,J＝13.7,9.3,7.0,4.5,2.5Hz,1H),1.74-1.66(m,J＝13.6,9.3,4.4,2.7Hz,1H)。13[C]NMR(151MHz,甲醇-d4),δ:168.8,162.4,142.3,140.3,131.8,129.0,127.4,120.5,114.2,76.3,29.5,29.3,27.5。
实施例2
(E)-2-(5-羟基-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(2)的合成
步骤1：将苯基硼酸(101mg，0.8mmol)和K2CO3(173mg，1.2mmol)加入到2-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)(100mg，0.4mmol)在DMF(16ml)和H2O(8ml)中的溶液。将溶液在氮气气氛下搅拌10分钟，然后加入四(三苯基膦)钯(96mg，0.08mmol)，并将混合物在氮气气氛下再搅拌10分钟。将反应物回流加热24小时。真空蒸发DMF，然后加入H2O(160ml)，用Et2O(80ml)萃取水相。有机相用H2O(160ml)和盐水(2×80ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 9:1)纯化，得到2-苯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(65mg，68.8％)，为黄色油。
步骤2：使用NaOH(59mg，1.4mmol)在H2O(0.7ml)和乙醇(10ml)中的溶液、2-苯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(65mg，0.2mmol)和乙醛酸一水合物(79mg，1.0mmol)在H2O(5ml)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH 9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-氧代-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(47mg，59％)，为黄色固体。
步骤3：使用CeCl3 7H2O(145mg，0.3mmol)、(E)-2-(5-氧代-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(116mg，0.3mmol)、MeOH(20ml)和NaBH4(145mg，5.9mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法纯化(DCM+1％AcOH)，得到(E)-2-(5-羟基-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(92mg，80％)，为白色固体。1H NMR(600MHz,甲醇-d4),δ:7.61-7.56(d,J＝7.4Hz,2H),7.53-7.50(d,J＝7.9Hz,1H),7.47-7.42(dd,J＝7.9,2.0Hz,2H),7.42-7.37(t,J＝7.7Hz,1H),7.35-7.33(d,J＝2.0Hz,1H),7.32-7.27(t,J＝7.4Hz,1H),6.03(s,1H),5.33(s,1H),3.55-3.39(m,1H),3.24-3.04(m,1H),2.96-2.73(m,2H),1.91-1.67(m,2H)。13[C]NMR(151MHz,甲醇-d4),δ:170.4,164.1,142.1,141.8,141.7,141.2,129.7,129.3,128.2,127.9,127.8,126.1,115.4,78.5,35.4,30.8,29.3。
实施例3
(E)-2-(5-羟基-2-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸钠(2的钠盐)的合成
如下制备2的钠盐：将2(85.4mg，0.290mmol)溶于乙醇(2ml)中，加入NaOH(aq)(282μl，0.296mmol，0.5M Tritisol)。真空除去溶剂，得到产物(90mg，99％)，为白色固体。
实施例4
(E)-2-(5-羟基-2-((E)-苯乙烯基)-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(3)的合成
步骤1：将苯乙烯(8.4ml，6.0mmol，2eq)和三乙胺(5.5ml，39.7mmol，19eq)加入到2-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)的CH3CN(15ml)溶液中。将溶液在氮气气氛下搅拌5分钟，然后加入四(三苯基膦)钯(725mg，0.4mmol)，并将混合物在氮气气氛下再搅拌5分钟。将反应回流加热22小时，加入饱和的NH4Cl水溶液(10ml)，然后用EtOAc(2×20ml)萃取。合并的有机相用H2O和盐水洗涤，经MgSO4干燥并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 9.8:0.2)纯化，得到(E)-2-苯乙烯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(229mg，52％)，为微黄色粘性油。
步骤2：使用NaOH(152mg，10mmol)在H2O(1.9ml)和乙醇(7ml)中的溶液、(E)-2-苯乙烯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(100mg，0.3mmol)和乙醛酸一水合物(140mg，5mmol)在H2O(5ml)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-氧代-2-((E)-苯乙烯基)-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(121mg，50％)，为黄色固体。
步骤3：使用CeCl3 7H2O(70mg，0.1mmol)、(E)-2-(5-氧代-2-((E)-苯乙烯基)-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(63mg，0.1mmol)、MeOH(20ml)和NaBH4(74mg，1.9mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法(DCM+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-羟基-2-((E)-苯乙烯基)-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(30mg，49％)，为白色固体。1H NMR(600MHz,甲醇-d4),δ:7.55-7.50(d,J＝6.9Hz,2H),7.45-7.37(m,2H),7.36-7.30(m,J＝7.0Hz,2H),7.30-7.27(d,J＝5.2Hz,1H),7.25-7.19(m,J＝7.3,6.8Hz,2H),6.01(s,1H),5.29(s,1H),3.50-3.40(m,1H),3.18-3.01(m,J＝14.1,7.7,3.4Hz,1H),2.97-2.71(m,2H),1.91-1.68(m,2H)。13[C]NMR(151MHz,甲醇-d4),δ:170.6,164.3,141.6,141.5,138.8,138.1,129.6,129.5,129.3,128.8,127.7,127.4,125.7,115.4,78.6,35.3,30.7,29.3。
实施例5
(E)-2-(2-氯-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(4)的合成
Figure BDA0002614849150000271
步骤1：使用NaOH(1.48g，37.1mmol)在H2O(18mL)和EtOH(40mL)中的溶液、2-氯-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)(1.20g，6.18mmol)和乙醛酸一水合物(2.28g，24.7mmol)在H2O(40mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-氧代-2-氯-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(764mg，49％)，为白色固体。
步骤3：使用CeCl3 7H2O(735mg，3.0mmol)、(E)-2-(5-氧代-2-氯-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(740mg，3.0mmol)、MeOH(150mL)和NaBH4(1.1g，30mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法(DCM+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-羟基-2-氯-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(402mg，52％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,甲醇-d4),δ:7.44-7.43(d,J＝8.25Hz,1H),7.20-1.18(dd,J＝2.29,8.25Hz,2H),7.11-7.10(d,J＝2.29Hz,1H),6.00(s,1H),5.27(s,1H),3.49-3.45(m,1H),3.07-3.02(m,1H),2.81-2.73(m,2H),1.86-1.80(m,1H),1.74-1.68(m,1H)。13[C]NMR(151MHz,甲醇-d4),δ:170.3,164.0,143.5,141.2,133.9,130.3,128.7,127.4,115.6,77.8,35.0,30.9,29.0。
实施例6
(E)-2-(2-碘-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(5)的合成
Figure BDA0002614849150000281
步骤1：将2-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)(826mg，3.5mmol)、双(三丁基锡)(4.0g，6.9mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(400mg，0.3mmol)在无水甲苯(35mL)中的混合物在氩气气氛下回流加热3小时。真空蒸发溶剂至干燥。对粗产物进行步骤2。
步骤2：将2-(三丁基锡基)-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(1068g，2.4mmol)的THF(50mL)溶液冷却至0℃，滴加碘(905g，3.6mmol)的THF(35mL)溶液。在0℃下1小时后，通过加入饱和的Na2S2O3水溶液淬灭反应。用饱和NaHCO3水溶液中和，并用EtOAc萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 4:1)纯化，得到产物(272mg，27％)，为无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:7.66(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.61(d,J＝1.7Hz,1H),7.43(d,J＝8.1Hz,1H),2.90-2.84(t,J＝7.2,5.3Hz,2H),2.75–2.68(m,2H),1.93–1.75(m,4H)。13C NMR(100.6MHz,CDCl3),δ:205.3,143.2,138.7,138.3,136.1,130.3,99.9,40.9,32.3,25.2,20.9。
步骤3：使用NaOH(215.0mg，5.2mmol)在H2O(3mL)和EtOH(6mL)中的溶液以及2-碘-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(272mg，0.95mmol)和乙醛酸一水合物(354mg，3.8mmol)在H2O(7mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-氧代-2-碘-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(151mg，46％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,甲醇-d4),δ:7.77(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.72(d,J＝1.7Hz,1H),7.47(d,J＝8.1Hz,1H),6.68(s,1H),2.82-2.76(dt,J＝6.8,4.8Hz,4H),2.07–1.98(p,2H)。13C NMR(100.6MHz,甲醇-d4),δ:198.2,169.3,153.3,143.7,139.6,137.6,137.5,131.7,126.5,102.0,31.8,26.2,24.2。
步骤4：使用CeCl3 7H2O(158mg，0.4mmol)、(E)-2-(5-氧代-2-碘-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(145mg，0.4mmol)、MeOH(20mL)和NaBH4(160mg，4.2mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法(DCM+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(2-碘-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(113mg，77％)，为白色固体。1H NMR(600MHz,甲醇-d4)δ:7.55(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.46(d,J＝1.9Hz,1H),7.23(d,J＝8.1Hz,1H),5.99(s,1H),5.24(s,1H),3.50-3.45(ddd,J＝11.8,6.9,4.3Hz,1H),3.04-2.98(ddd,J＝14.2,9.1,2.6Hz,1H),2.80–2.71(m,2H),1.86-1.79(m,J＝13.6,6.9,4.5,2.5Hz,1H),1.73-1.65(m,J＝13.5,9.3,4.3,2.7Hz,1H)。13C NMR(151MHz,甲醇-d4),δ:170.3,163.8,143.8,142.4,139.3,136.8,129.0,115.7,93.4,77.8,34.9,30.9,29.0。HPLC(254nm):100％。
实施例7
(E)-2-(2-氟-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(6)的合成
Figure BDA0002614849150000291
步骤1：在室温下向2-(三丁基锡基)-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(1017mg，2.3mmol)的丙酮(35mL)溶液中加入Ag2O(31mg，0.1mmol)、NaHCO3(397mg，4.5mmol)和F-TEDA-BF4(1204mg，3.4mmol)。将反应混合物在回流下搅拌6小时。冷却至室温后，将反应混合物在硅藻土短垫上过滤并真空蒸发。对粗产物进行下一步。
步骤2：使用NaOH(221mg，5.5mmol)在H2O(8mL)和EtOH(16mL)中的溶液以及2-氟-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(179mg，1.0mmol)和乙醛酸一水合物(370mg，4.0mmol)在H2O(16mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(5-氧代-2-氟-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸。对粗产物进行下一步。MS(M/z)：C13H11FO3(M-1)计算值：234.1，实测值：(M)H-：233.0。
步骤3：使用CeCl3 7H2O(235.7mg，0.6mmol)、(E)-2-(5-氧代-2-氟-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(135mg，0.6mmol)、MeOH(30mL)和NaBH4(218mg，5.6mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。将粗产物通过制备HPLC纯化，得到(E)-2-(2-氟-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(23.2mg，17％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,CD3OD),δ:7.44(dd,J＝8.5,5.9Hz,1H),6.89(td,J＝8.5,2.7Hz,1H),6.84(dd,J＝9.6,2.7Hz,1H),5.98(s,1H),5.26(s,1H),3.46–3.38(ddd,J＝12.1,6.9,4.7Hz,1H),3.13–3.04(ddd,J＝14.2,8.8,3.4Hz,1H),2.85–2.73(m,2H),1.86–1.70(m,2H)。13C NMR(100.6MHz,甲醇-d4),δ:170.4,164.6,164.1,162.2,144.1,144.0,138.3,129.3,129.2,117.3,117.1,115.7,113.7,113.5,78.1,35.1,30.6,29.1。19F NMR(376.4MHz,甲醇-d4),δ:-118.3(s,1F)。MS(m/z):C13H13FO3(M-1)-计算值：236.2，实测值：235.0(M)H-。HPLC(254nm):95.5％。
实施例8
(E)-2-(2-甲基-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(7)的合成
Figure BDA0002614849150000301
步骤1：使用NaOH(6.71g，167.7mmol)在H2O(80mL)和EtOH(40mL)的溶液、2-甲基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Murineddu等，2005)(4.84g，27.8mmol)和乙醛酸一水合物(10.28g，111.7mmol)在H2O(40mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(2-甲基-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(5.42g，85％)，为黄色固体。
步骤2：使用CeCl3 7H2O(6.35g，17.0mmol)、(E)-2-(2-甲基-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(3.56g，15.5mmol)、MeOH(150mL)和NaBH4(8.79g，232.3mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。在通过柱色谱法(DCM/MeOH 30:1+1％AcOH)纯化后用EtOAc重结晶，得到(E)-2-(5-羟基-2-甲基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(1.56g，43％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,甲醇-d4),δ:7.29(d,J＝7.7Hz,1H),7.00(dd,J＝7.8,1.9Hz,1H),6.90(s,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),3.40-3.33(m,1H),3.09-3.03(m,1H),2.85-2.80(m,1H),2.76-2.69(m,1H),2.27(s,3H),1.82-1.72(m,2H)。13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ170.4,164.8,141.2,139.1,138.4,131.5,128.1,127.6,115.3,79.0,35.2,30.5,29.4,21.0。HPLC(254nm):100％。UPLC-MS:m/z＝231.4[M-H]-。
实施例9
(E)-2-(1-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(8)的合成
Figure BDA0002614849150000311
步骤1：使用NaOH(194mg，4.8mmol)在H2O(3mL)和EtOH(7mL)中的溶液、1-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Gruber等，1983)(192mg，0.8mmol)和乙醛酸一水合物(299mg，3.2mmol)在H2O(7mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH 9.5:0.5+1％AcOH)进行粗纯化，得到粗品(E)-2-(1-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(172mg，73％)，为黄色固体。
步骤2：使用CeCl3 7H2O(236mg，0.6mmol)、(E)-2-(1-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(166mg，0.6mmol)、MeOH(8mL)和NaBH4(214mg，5.6mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过制备HPLC(梯度为30-55％B，洗脱液A(H2O/TFA，100:0.1)和洗脱液B(MeCN/H2O/TFA，90:10:0.1)，流速为20mL/分钟，历经9分钟)纯化，得到(E)-2-(1-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(92mg，55％)，为白色固体。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ:7.48(d,J＝8.7Hz,2H),7.09(t,J＝7.8Hz,1H),6.04(s,1H),5.37(s,1H),3.52–3.35(m,2H),3.07–3.00(m,1H),2.69–2.62(m,1H),1.87–1.78(m,1H),1.69–1.57(m,1H)。13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ:170.3,163.8,145.0,139.9,132.9,129.0,126.5,125.5,115.8,77.5,32.5,30.8,27.5。HPLC(254nm):98％。ESI-MS:m/z＝295.0,297.0[M-H]-。
实施例10
(E)-2-(1-苯基-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(9)的合成
Figure BDA0002614849150000321
步骤1：使用苯基硼酸(255mg，2.1mmol)、K2CO3(436mg，3.1mmol)、1-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Gruber等，1983)((247mg，1.0mmol)、四(三苯基膦)钯(239mg，0.2mmol)在DMF(24mL)和H2O(16mL)中的溶液，如实施例2(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc9:1)进行粗纯化，得到粗品1-苯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(220mg，90％)，为黄色油。
步骤2：使用NaOH(214mg，5.3mmol)在H2O(3mL)和EtOH(8mL)中的溶液、1-苯基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(210mg，0.9mmol)和乙醛酸一水合物(329mg，3.6mmol)在H2O(5mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。粗品(E)-2-(5-氧代-1-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸不经任何纯化用于下一步骤。
步骤3：使用CeCl3 7H2O(362mg，1.0mmol)、(E)-2-(5-氧代-1-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(258mg，0.9mmol)、MeOH(14mL)和NaBH4(338mg，8.9mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过制备HPLC(梯度为30-72％B，洗脱液A(H2O/TFA，100:0.1)和洗脱液B(MeCN/H2O/TFA，90:10:0.1)，流速为20mL/分钟，历经10分钟)纯化，得到(E)-2-(5-羟基-1-苯基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(106mg，40％(2步骤的总收率))，为白色固体。1H NMR(600MHz,甲醇-d4)δ:7.50(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.42–7.36(m,2H),7.36–7.30(m,1H),7.25–7.19(m,3H),7.09(dd,J＝7.6,1.4Hz,1H),6.07(s,1H),5.40(s,1H),3.47(ddd,J＝12.5,6.4,4.6Hz,1H),3.00(ddd,J＝14.5,9.1,2.7Hz,1H),2.69(tdd,J＝11.6,9.3,3.7Hz,2H),1.77–1.71(m,1H),1.65–1.58(m,1H)。13C NMR(151MHz,甲醇-d4)δ:170.6,164.5,143.6,143.4,143.0,138.3,130.4,130.3,129.1,127.9,127.0,126.3,115.3,78.1,30.9,29.6,28.9。HPLC(254nm):100％。UPLC-MS:m/z＝293.0[M-H]-。
实施例11
(E)-2-(3-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(10)的合成
Figure BDA0002614849150000331
步骤1：使用NaOH(246mg，6.0mmol)在H2O(3mL)和EtOH(7mL)中的溶液、3-溴-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-5-酮(Gruber等，1983)(237mg，1.0mmol)和乙醛酸一水合物(366mg，4.0mmol)在H2O(7mL)中的混合物，如实施例1(步骤1)所述进行。通过柱色谱法(DCM/MeOH 9.5:0.5+1％AcOH)纯化，得到(E)-2-(3-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(259mg，89％)，为黄色固体。
步骤2：使用CeCl3 7H2O(356mg，1.0mmol)、(E)-2-(3-溴-5-氧代-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(256mg，0.9mmol)、MeOH(10mL)和NaBH4(332mg，8.7mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过制备HPLC(梯度为30-55％B，洗脱液A(H2O/TFA，100:0.1)和洗脱液B(MeCN/H2O/TFA，90:10:0.1)，流速为20mL/分钟，历经9分钟)纯化，得到(E)-2-(3-溴-5-羟基-5,7,8,9-四氢-6H-苯并[7]轮烯-6-亚基)乙酸(139mg，54％)，为白色固体。1HNMR(600MHz,甲醇-d4)δ:7.64(d,J＝2.2Hz,1H),7.28(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.01(s,1H),5.28(s,1H),3.57(ddd,J＝12.6,6.5,4.2Hz,1H),2.99(ddd,J＝14.3,8.6,2.6Hz,1H),2.80(ddd,J＝14.3,9.8,2.5Hz,1H),2.66(ddd,J＝12.5,9.9,4.5Hz,1H),1.90–1.84(m,1H),1.65–1.59(m,1H)。13C NMR(151MHz,甲醇-d4)δ:170.3,163.8,145.0,140.3,132.4,131.2,129.3,121.2,115.6,77.0,34.9,31.5,29.0。HPLC(254nm):99％。ESI-MS:m/z＝295.0,297.0[M-H]-。
实施例12
乙酰氧基甲基3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸酯(11)的合成
Figure BDA0002614849150000341
将3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸(A)(Vogensen等，2013)(207.4mg，1.62mmol)、K2CO3(114.9mg，0.83mmol)和KI(138.4mg，0.83mmol)在干燥的DMF(5ml)中的混合物在室温下搅拌30分钟。向反应混合物中滴加乙酸氯甲酯溶液(218.9mg，2.03mmol)，然后在70℃搅拌2小时，然后冷却至室温。加入水(15ml)，水相用EtOAc(3×20ml)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，并真空蒸发。通过柱色谱法(EtOAc/庚烷1:1)纯化，得到产物(202.5g，63％)，为透明油。1H NMR(600MHz,甲醇-d4)δ:6.74(q,J＝2.1Hz,1H),5.81(s,2H),4.91–4.88(m,1H),2.72–2.65(m,1H),2.50–2.43(m,1H),2.38–2.33(m,1H),2.08(s,3H),1.79–1.73(m,1H)。13CNMR(151MHz,甲醇-d4)δ:171.1,164.9,146.7,138.3,80.6,77.5,34.0,30.6,20.5。HPLC(254nm):96％。
实施例13
3-(2-乙酰氧基乙酰氧基)环戊-1-烯-1-羧酸(12)的合成
Figure BDA0002614849150000342
将乙酰氧基乙酰氯(0.4mL，3.8mmol)和乙酰氧基乙酸(457mg，3.9mmol)在THF(3mL)中的混合物冷却至0℃。在低于5℃下加入N,N-二异丙基乙胺(1.8mL，10.4mmol)。将所得溶液升温至室温并搅拌30分钟。将3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸(HOCPCA)(Vogensen等，2013)(222mg，1.7mmol)和4-二甲基氨基吡啶(22mg，0.2mmol)溶于THF(1.5mL)中。将溶液一次性加入到反应混合物中，并在室温下搅拌3小时。加入水(3mL)，并将反应在室温下搅拌90分钟。用EtOAc萃取混合物。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。通过柱色谱法(EtOAc/庚烷1:1+1％AcOH)纯化，得到3-(2-乙酰氧基乙酰氧基)环戊-1-烯-1-羧酸(35mg，9％)，为灰白色固体。1HNMR(600MHz,甲醇-d4)δ:6.62(q,J＝2.1Hz,1H),5.85–5.82(m,1H),4.62(s,2H),2.73–2.67(m,1H),2.57–2.51(m,1H),2.48–2.42(m,1H),2.12(s,3H),1.98–1.92(m,1H)。13C NMR(151MHz,甲醇-d4)δ172.1,169.3,167.7,143.7,139.0,81.9,61.9,31.0,31.0,20.3。HPLC(254nm):95％。
实施例14
3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸新戊酯(13)的合成
Figure BDA0002614849150000351
步骤1：向0℃下的3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸4(126mg，1.0mmol)、4-二甲基氨基吡啶(24mg，0.2mmol)和2,2-二甲基丙-1-醇(124mg，1.4mmol)在DCM(9mL)中的溶液中加入溶解在DCM(4mL)中的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(260mg，1.4mmol)。然后使混合物升温至室温并搅拌过夜。将饱和NH4Cl溶液加入到该混合物中，然后用DCM洗涤。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc4:1)粗纯化，得到不纯的3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸新戊酯(75mg，43％)，为黄色油。
步骤2：使用CeCl3 7H2O(309mg，0.8mmol)、3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸新戊酯(131mg，0.7mmol)、MeOH(7mL)和NaBH4(127mg，3.4mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 3:1)纯化，得到3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸新戊酯(57mg，43％)，为透明油。1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ:6.71(q,J＝2.1Hz,1H),5.01–4.97(m,1H),3.85(s,2H),2.79–2.73(m,1H),2.54–2.49(m,1H),2.45–2.39(m,1H),1.83–1.78(m,1H),0.97(s,9H)。13CNMR(151MHz,氯仿-d)δ:165.3,142.7,139.4,77.4,74.0,33.8,31.6,30.1,26.6。HPLC(254nm):99％。
实施例15
3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸叔丁酯(14)(Aye等，2008)的合成
Figure BDA0002614849150000352
步骤1：向3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸4(209mg，1.7mmol)的DMF(5mL)溶液中，加入叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(3.0mL，16.7mmol)和三氟化硼***络合物(0.1mL，0.9mmol)。将混合物在50℃下搅拌过夜。加入饱和NaHCO3溶液，然后用EtOAc萃取水相。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发至干燥。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 3:1)粗纯化，得到3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸叔丁酯(138mg，46％)，为黄色油。
步骤2：使用CeCl3 7H2O(499mg，1.3mmol)、3-氧代环戊-1-烯-1-羧酸叔丁酯(203mg，1.1mmol)、MeOH(11mL)和NaBH4(213mg，5.6mmol)，如实施例1(步骤2)所述进行。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 2:1)纯化得到3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸叔丁酯(Aye等，2008)(25mg，12％)，为灰白色油。
实施例16
(2S)-2-氨基-3-(3-(3-羟基环戊-1-烯-1-甲酰氨基)苯基)丙酸锂(I)(15)的合成
Figure BDA0002614849150000361
步骤1：将3-羟基环戊-1-烯-1-羧酸(HOCPCA)(Vogensen等，2013)(355mg，2.8mmol)、4-二甲基氨基吡啶(35mg，0.3mmol)溶于THF(15mL)中，并在氩气下冷却至0℃。滴加乙酸酐(0.4mL，4.2mmol)，并在室温下搅拌过夜。加入水，混合物用EtOAc萃取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 1:3+1％AcOH)纯化，得到3-乙酰氧基环戊-1-烯-1-羧酸(434mg，92％)，为白色固体。
步骤2：将3-乙酰氧环戊-1-烯-1-羧酸(137mg，0.8mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(152mg，0.8mmol)、羟基苯并***(108mg，0.8mmol)、三乙胺(0.22mL，1.6mmol)溶于THF(3mL)中，并在氩气下搅拌10分钟。加入(S)-3-(3-氨基苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸甲酯(281mg，1.0mmol)的THF(3mL)溶液，将混合物在室温下搅拌过夜。将饱和NH4Cl溶液加入到混合物中，然后用EtOAc洗涤。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发。通过柱色谱法(庚烷/EtOAc 1:1)纯化，得到(2S)-3-(3-(3-乙酰氧基环戊-1-烯-1-甲酰氨基)苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸甲酯(320mg，90％)，为黄色固体。
步骤3：在0℃向(2S)-3-(3-(3-乙酰氧基环戊-1-烯-1-甲酰氨基)苯基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸甲酯(139mg，0.3mmol)的二噁烷(1.2mL)溶液中滴加4M HCl/二噁烷(1.2mL，4.7mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。加入饱和NaHCO3溶液，然后用EtOAc萃取水相。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤，并真空蒸发至干燥。通过柱色谱法(EtOAc/MeOH 5:1)粗纯化，得到相应的中间体，为黄色油。将LiOH(4mg，0.2mmol)的水(0.5mL)溶液加入到中间体的MeOH(0.5mL)溶液中。在室温下搅拌混合物直到完全转化。将混合物真空蒸发至干，得到(2S)-2-氨基-3-(3-(3-羟基环戊-1-烯-1-甲酰氨基)苯基)丙酸锂(I)(30mg，34％)，为灰白色固体。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ:7.62(ddd,J＝8.1,2.2,1.0Hz,1H),7.33(t,J＝1.9Hz,1H),7.25(t,J＝7.9Hz,1H),7.05(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),6.61(q,J＝2.1Hz,1H),4.94(tdd,J＝5.2,2.6,1.6Hz,1H),3.47(dd,J＝8.1,4.7Hz,1H),3.10(dd,J＝13.5,4.7Hz,1H),2.86–2.73(m,2H),2.65–2.50(m,1H),2.43–2.35(m,1H),1.85–1.76(m,1H)。13CNMR(151MHz,甲醇-d4)δ:181.4,166.3,143.0,140.9,139.9,139.4,129.8,126.8,123.1,120.4,77.9,58.9,42.7,34.1,31.1。HPLC(254nm):99％。
实施例17
GHB相关类似物在pH值为6.0和7.4时均以高亲和力与大鼠脑突触膜中的特异性GHB位点结合(图1)
在已建立的结合试验中测试了新的类似物，并与参考化合物进行比较。在pH 6下，发现化合物1-10抑制A)3H-B结合(相应的Ki值为50、92、30、52、53、108、325、225、382、9687nM)，相比之下化合物B的Ki值为440nM。B)化合物1、2和3也以浓度依赖性方式抑制3H-A结合，具有相似的亲和力(各自的Ki值为56nM、144nM和50nM)，相比之下GHB本身的Ki值为2.75μM。C)在pH 7.4下，在3H-A结合试验中获得了较低的亲和力，化合物1、2和3的Ki值分别是～267、604和87nM。已知的CAMK2A抑制剂CN21在高达30μM的浓度(为其报道的IC50值的～300倍)下不能置换3H-A结合。D)化合物C、双氯芬酸和4'-羟基双氯芬酸在3H-A结合试验中的竞争表明，化合物C相对于4'-羟基双氯芬酸和双氯芬酸的亲和力更强(Ki值为22nM相对于16μM和4.7μM)。
实施例18
缺乏GHB类似物的显著GABAB受体结合(图2)
在已建立的结合试验中，测试GHB、化合物A和C对GABAB受体的亲和力。虽然GHB在0.1mM和1mM下都能抑制3H-GABAB结合，但是化合物A在高达1mM的浓度下也不显示竞争能力，而化合物C在1mM的浓度下显示有限的抑制。
实施例19
化合物A在小鼠中不产生低体温症，但GBL产生(图3)
为了证实化合物A不能功能性地激活GABAB受体，在小鼠中通过比较GHB前药GBL(750mg/kg)和化合物A(500mg/kg)在野生型和GABAB受体敲除小鼠中的给药，研究了已知的GABAB低体温症效应(Kaupmann等，2003)。如所预期的，GBL能够促进体温的强烈降低。相反，化合物A对野生型或敲除小鼠的低体温症没有影响。
实施例20
GBL诱导非GABAB受体介导的脑葡萄糖代谢速率降低(图4)
为了证实GHB前药GBL通过非GABAB受体依赖性机制改变葡萄糖代谢，对GABAB1受体敲除小鼠施用(i.p.)盐水(黑色柱)或GBL(200mg/kg)(白色柱)。十分钟后，向所有小鼠施用(i.p.)14C-脱氧葡萄糖以估计脑葡萄糖消耗。这表明45分钟后，在额叶皮层和海马体中GHB诱导的脑葡萄糖代谢速率显著降低(额叶皮层为10.46vs.6.78nCi/ROI/分钟，海马体为9.74vs.6.45，其中*P＜0.05，误差线表示SD)。
实施例21
化合物A在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血后30分钟给药时减小梗死尺寸(图5)
A)在诱导大脑皮层局灶性中风后30分钟，将两个不同剂量的化合物A施用于小鼠，并与盐水处理的动物进行比较。诱导中风后三天，在左侧运动皮层中可见梗死。B)梗死体积的量化揭示，当盐水与化合物A(175mg/kg)比较时减少30％(9.38vs.6.56mm3，***P<0.0005)。接受低剂量(17.5mg/kg)的小鼠组与盐水(9.38vs.8.95mm3)相比没有显示出梗死体积的显著减少。
实施例22
化合物A在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血后30分钟给药时改善受影响肢体的运动性能(图6)
为了评价局灶性缺血后施用化合物A后运动功能的改善，使用圆筒任务和网格行走任务作为左前肢运动恢复的具体措施。在局灶性缺血后3天，在圆筒和网格行走任务中观察到左前肢和右前肢之间的不对称性。A)在网格行走任务中，与生理盐水处理组相比，接受高剂量(175mg/kg)的小鼠组显示提高了26％(**P＜0.01)，而对17.5mg/kg组观察到非显著性降低(10％)。B)对于17.5和175mg/kg剂量组，当施用化合物A时，用圆筒任务测量的不对称性显著降低，效果分别为40％和42％。
实施例23
当在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血后3、6或12小时给药时，化合物A减小梗死尺寸(图7)
为了评价较晚给药的治疗效果，在诱导梗死后3、6或12小时以两种不同的剂量给予化合物A。A)中风后3、6或12小时施用化合物A(175mg/kg)显著降低了梗死尺寸(分别为5.51mm3 vs.3.12、3.68和3.58mm3)(P＜0.01-0.05)，总计降低33-43％。作为比较，GHB(275mg/kg)在3小时时间点没有导致梗死尺寸的显著减小(未显示)。B)在中风后3小时施用较低剂量的化合物A(90mg/kg)显著减小梗死尺寸51％(5.55mm3 vs.2.68mm3，**P＜0.01)。
实施例24
化合物A在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血后3、6或12小时给药时改善受影响肢体的运动性能(图8)
为了评估在诱导梗死后在较后的给药时间点接受175mg/kg剂量A的治疗组的运动技能，在局灶性缺血后7天，测量在网格行走和圆筒任务中左前肢和右前肢之间的不对称性。A)对于3小时、6小时和12小时的治疗点，利用网格行走任务测量的不对称性均高度显著降低(效果分别为31％、22％、21％，(***P<0.001)。B)在圆筒任务中，对于3小时(*P＜0.05)和6小时(**P＜0.001)的时间点，观察到与盐水处理组相比分别有16％和20％的改善，而12小时的时间点不具有显著性。
实施例25
当在光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血后3或6小时给药时，化合物2减小梗死尺寸并改善受影响肢体的运动性能(图9)
在诱导梗死后3或6小时以175mg/kg(A-C)或50mg/kg(D-F)的剂量给予(i.p.)新化合物2。A)损伤后3或6小时施用2(175mg/kg)显著降低梗死尺寸(分别为5.55mm3 vs.3.44和2.98mm3，P＜0.01-0.05)，总计降低38-46％。与盐水处理的小鼠相比，施用化合物2显著减少B)6小时组的足失误数目(*P＜0.05)，和C)3和6小时组中受影响的爪花费的时间(P＜0.01-0.001)。D)损伤3小时后施用2(50mg/kg)促进类似的保护作用，梗死尺寸显著降低39％(5.55mm3 vs.3.4mm3，**P＜0.01)。类似地，用较低剂量治疗的小鼠显示出E-F)在两个不对称性测试中都显著改善了运动功能。
实施例26
化合物A治疗减少了与光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血相关的所选分子标记物的表达(图10)
为了研究对抗局灶性缺血损伤后的脑损伤的保护机制，在中风后3天，在围绕缺血核的脑组织中测量标记物GFAP、CD14和MMP9的mRNA表达水平。A)GFAP水平在中风的动物中显著增加，但在两个治疗组之间水平没有差异。B)C)相比之下，在局灶性缺血事件后30分钟接受化合物A(175mg/kg)的动物中，CD14和MMP9的mRNA水平明显降低。在低剂量A(17.5mg/kg)下，MMP9 mRNA水平早已显著低于接受盐水的动物。D)12小时后发现了类似的结果。
实施例27
化合物A治疗降低了光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血中所选的促炎细胞因子的血浆水平(图11)
为了评价早期时间点的炎症性反应，在诱发局灶性缺血事件后4小时收集血样。A)梗死的形成显著增加MCP-1、IL-6和IL-1a的水平。4小时后，MCP-1水平在化合物A治疗的动物的血浆中显示出降低的趋势。B)与盐水处理的小鼠相比，用化合物A治疗显著降低了IL-6的血浆水平。C)与盐水处理的小鼠相比，用A治疗没有显著影响IL-1a水平。
实施例28
化合物A减小永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)局灶性缺血模型中的梗死尺寸(图12)
在通过永久性阻塞大脑中动脉诱导局灶性中风后30分钟向小鼠施用化合物A(175mg/kg)，并与盐水处理的动物进行比较。诱导中风后三天，在左侧运动皮层中可见梗死。梗死的定量显示，当30分钟后对盐水与A(175mg/kg)进行比较时，梗死体积显著减小(16.6vs.12.3mm3，*P＜0.05)。
实施例29
当在pMCAO局灶性损害后30分钟给药时，化合物A改善了功能恢复(图13)
在通过永久性阻塞大脑中动脉诱导局灶性中风后30分钟向小鼠施用化合物A(175mg/kg)，并与盐水处理的动物进行比较，使用旋转杆、握力和Hargreaves试验研究运动和感觉损伤。
在旋转杆试验中，小鼠在中风后48小时进行4次试验(T1-T4)。A)在旋转杆中盐水处理的小鼠从T2到T3)学习显著。B)相比之下，接受A治疗的小鼠具有更陡的学习曲线(T1至T2)，尽管在T4中在旋转杆上花费的时间在各组之间没有差异。C)中风后三天，盐水处理的小鼠在受影响的前肢中显示出握力的显著不足，而化合物A治疗的小鼠在该试验中没有显示任何不足。D)类似地，对于评价受影响的前肢的感觉缺陷，盐水处理的小鼠在Hargreaves试验中显示出受影响的前肢的反应时间增加，而这对于用A治疗的小鼠不明显。
实施例30
在小鼠脑的冠状脑切片中3H-A放射性配体的离体结合(图14)
使用3H-A进行离体结合C57BL/6J小鼠。因此，在每组5只小鼠的设计中，腹膜内注射3H-A(每只小鼠5MBq)。30分钟后，解剖脑并进行放射自显影。与用于标准化的小脑相比，在海马体和皮层中观察到显著的特异性结合水平。
实施例31
CAMK2A鉴定为GHB高亲和力结合位点(图15)
A)光亲和标记工作流的原理。将大鼠海马体的粗突触膜与光亲和配体SBV3一起孵育，并用UV照射(波长302nm)以将光亲和配体与GHB结合蛋白共价连接。通过Staudinger-Bertozzi连接至EZ-LinkTM膦-PEG3-生物素(ThermoFisher Scientific)而引入生物素后，亲和纯化生物素标记的蛋白质，并进行LC-MS/MS分析。B)抗生物素western印迹显示在有(第一泳道)和没有(第二泳道)光配体存在时在～55kDa处的特异性标记条带。C)3H-A结合敲除CAMK2A和CAMK2B的小鼠脑的皮层膜。D)与非特异性水平相比，3H-A与来自用大鼠CAMK2A转染的HEK293T细胞的全细胞匀浆的结合显示了显著更高的总结合(87％特异性结合)，而在CAMK2B没有观察到特异性结合(黑色柱＝特异性结合，白色柱＝非特异性结合；1mM GHB)。
实施例32
GHB和GHB相关类似物A、B、C、1和2直接结合重组CAMK2A(图16)
在内部建立的3H-A过滤结合测定中测定HEK细胞中表达的人/大鼠CAMK2A，所述测定是对CAMK2A-转染的HEK293T细胞的全细胞裂解物进行的。如对与大鼠脑皮层突触膜的结合所见，化合物GHB、A、B、C、1和2能够浓度依赖性地抑制放射性配体结合。所获得的Ki值分别是50.4、1.95、3.71、0.81、0.72和1.09μM，化合物1和2在与3H-A放射性配体竞争时显示出比GHB高50-70倍的更好的亲和力，这与3H-A结合试验中观察到的结合效力转移相似(图1B)。
实施例33
化合物A和2通过其在质子偶联转运蛋白上的底物活性快速穿过tsA201细胞膜(图17)
为了监测化合物进入细胞并到达靶标(CAMK2A)的能力，使用了利用pH-敏感染料BCECF的基于荧光的测定法。使已知表达MCT的细胞(tsA201；与HEK293-T相关)在96孔板中生长，并暴露于化合物和测量pH的降低2分钟。A)如对A(一种已知的MCT1底物)所预期的，观察到pH的浓度依赖性降低(EC50值为8.2mM)。B)化合物2(代表几种类似物)类似地产生pH的浓度依赖性降低(EC50值为1.6mM)，支持了化合物递送至细胞胞质溶胶。
实施例34
化合物A在遭受光化学诱导的血栓形成性局灶性缺血的小鼠中预防pThr286CAMK2A自磷酸化(图18)
为了评估A的功能活性，对从遭受光化学诱导的血栓形成性损伤并接受A治疗或未接受A治疗的小鼠分离的皮层组织使用充分描述的pThr286测定法(Kool等，2016)。
为此，假模组(sham)小鼠或小鼠在损伤后3小时用盐水或175mg/kg A(i.p.)治疗。损伤后三十(30)分钟，处死小鼠并处理皮层组织。通过Western印迹分析评估自磷酸化，并将pThr286 CAMK2A的水平相对于总CAMK2A进行标准化，以检测自磷酸化的变化。与其他关于缺血的报道(Ahmed等，2017)一致，由光化学诱导的血栓形成引起的局灶性缺血显著增加了自磷酸化(#P＜0.05)。化合物A显著抑制了这种反应(*P＜0.05)，与假模组条件相比，自磷酸化减少73％。
参考文献
Ahmed,M.E.,Dong,Y.,Lu,Y.,Tucker,D.,Wang,R.,Zhang,Q.,2017.Beneficialeffects of a CaMKIIa inhibitor TatCN21 peptide in global cerebral ischemia.JMol Neurosci 61,42-51.
Aye,Y.；Davies,S.G.,Garnaer,A.C.,Roberts,P.M.,Smith,A.D.；Thomson,J.E.,2008Parallel kinetic resolution of citertci-butyl(RS)-3-oxy-substitutedcyclopent-1-ene-carboxylates for the asymmetric synthesis of 3-oxy-substituted cispentacin and transpentacin derivaties.Organic Biomol Chem 6,2195–2203.
Clarkson,A.N.,Huang,B.S.,Macisaac,S.E.,Mody,I.,Carmichael,S.T.,2010.Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functionalrecovery after stroke.Nature 468,305-309.
Coultrap,S.J.,Ashpole,N.M.,Hudmon,A.,Bayer,K.U.,2011.CaMKII incerebral ischemia.Acta Pharmacol Sin 32,861-872.
Gruber,R；Cagniant,D.,Cagniant,P.,1983.Hydrocarburesarylaliphatiques.Partie VII.Orientation dans la reaction de bromation debenzocyclenes bi-et tricycliques superieurs.Bulletin de la Societe Chimiquede France,2,96–104.
Kaupmann,K.,Cryan,J.F.,Wellendorph,P.,Mombereau,C.,Sansig,G.,Klebs,K.,Schmutz,M.,Froestl,W.,van der Putten,H.,Mosbacher,J.,Brauner-Osborne,H.,Waldmeier,P.,Bettler,B.,2003.Specificγ-hydroxybutyrate-binding sites butloss of pharmacological effects ofγ-hydroxybutyrate in GABAB1-deficientmice.Eur J Neurosci 18,2722-2730.
Klein,A.B.,Bay,T.,Villumsen,I.S.,Falk-Petersen,C.B.,Marek,A.,
Figure BDA0002614849150000441
B.,Clausen,R.P.,Hansen,H.D.,Knudsen,G.M.,Wellendorph,P.,2016.Autoradiographicimaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodentbrain using 3H-HOCPCA.Neurochem Int 100,138-145.
Kool,M.J.,Van De Bree,J.E.,Bodde,H.E.,Elgersma,Y.,Van Woerden,G.M.,2016.The molecular,temporal and region-specific requirements of the betaisoform of Calcium/Calmodulin-dependent protein kinase type 2(CAMK2B)in mouselocomotion.Sci Rep 6:26989,1-12.
Kuschinsky,W.,Suda,S.,Sokoloff,L.,1985.Influence of gamma-hydroxybutyrate on the relationship between local cerebral glucoseutilization and local cerebral blood flow in the rat brain.J Cereb Blood FlowMetab 5,58-64.
Lie,M.E.K.,Johansen,N.B.,Gowing E.K.,Dalby,N.O.,Thiesen,L.,Wellendorph,P.,Clarkson,A.N.,In Press.The GAT3 selective substrate L-isoserine upregulates GAT3 expression and increases functional recovery aftera focal ischemic stroke in mice.J Cereb Blood Flow Metab doi:10.1177/0271678X17744123.
Murineddu,G.,Ruiu,S.,Loriga,G.,Manca,I.,Lazzari,P.,Reali,R.,Pani,L.；Toma,L.,Pinna,G.A.,2005.Tricyclic pyrazoles.3.Synthesis,biologicalevaluation,and molecular modeling of analogues of the cannabinoid antagonist8-chloro-1-(2',4'-dichlorophenyl)-N-piperidin-1-yl-1,4,5,6-tetrahydrobenzo[6,7]cyclohepta[1,2-c]pyrazole-3-carboxamide.J Med Chem 48,7351-7362.
Thiesen,L.,Kehler,J.,Clausen,R.P.,
Figure BDA0002614849150000454
B.,Bundgaard,C.,Wellendorph,P.,2015.In vitro and in vivo evidence for active brain uptake ofthe GHB analog HOCPCA by the monocarboxylate transporter subtype 1.JPharmacol Exp Ther 354,166-174.
Vest,R.S.,Davies,K.D.,O’Leary,H.,Port,J.D.,Bayer,K.U.,2007.Dualmechanism of a natural CaMKII inhibitor.Mol Cell Biol 18,5024-5033.
Vogensen,S.B.,Marek,A.,Bay,T.,Wellendorph,P.,Kehler,J.,Bundgaard,C.,
Figure BDA0002614849150000455
B.,Pedersen,M.H.,Clausen,R.P.,2013.New synthesis and tritium labelingof a selective ligand for studying high-affinityγ-hydroxybutyrate(GHB)binding sites.J Med Chem.56,8201-8205.
Waxham,M.N.,Grotta,J.C.,Silva,A.J.,Strong,R.,Aronowski,J.,1996.Ischemia-induced neuronal damage:a role for calcium/calmodulin-dependentprotein kinase II.J Cereb Blood Flow Metab 16,1-6.
Wellendorph,P.,
Figure BDA0002614849150000451
S.,Greenwood,J.R.,de Lichtenberg,A.,Nielsen,B.,
Figure BDA0002614849150000452
B.,Brehm,L.,Clausen,R.P.,
Figure BDA0002614849150000453
H.,2005.Novel cyclic -hydroxybutyrate(GHB)analogs with high affinity and stereoselectivity ofbinding to GHB sites in rat brain.J Pharmacol Exp Ther 315,346-351.
项目
1.根据式I的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002614849150000461
其中R1和R2形成环体系以获得选自以下的化合物：
Figure BDA0002614849150000462
其中n是0或1；
R3选自H、-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-苄基、聚乙二醇基(PEG)，或基团如
Figure BDA0002614849150000463
其中R9选自-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu或-tBu，并且其中R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H、–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu、–C(＝O)-苄基、聚乙二醇基(PEG)，或基团如
Figure BDA0002614849150000471
其中R11选自-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、iBu或-tBu，并且其中R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R5、R6、R7和R8彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；
m是0或1；并且
X是N、O、S、CH2；
条件是所述化合物不是下列之一：
Figure BDA0002614849150000472
2.根据项1所述的化合物，其具有式II或III，并且其中n是0。
3.根据项1所述的化合物，其具有式IV，并且其中n是1。
4.根据前述任一项所述的化合物，其中R3和R4之一是H。
5.根据前述任一项所述的化合物，其中R3和R4都是H。
6.根据前述各项中任一项所述的化合物，其具有式III，其中R5为H，R6在2位。
7.根据前述任一项所述的化合物，其具有式III，其中R5为H，R6选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基或-CH＝CH-芳基。
8.根据前述任一项所述的化合物，其具有式III，其中R5为H，R6选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-芳基。
9.根据前述任一项所述的化合物，其具有式III，其中R5为H，R6选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-苯基。
10.根据项1-4、5-9中任一项所述的化合物，其中R3选自
Figure BDA0002614849150000481
或R4选自
Figure BDA0002614849150000482
11.根据项1-4、5-10所述的化合物，其中R3是
Figure BDA0002614849150000483
12.根据项1-4、10中任一项所述的化合物，其具有式II，其中R4为H，R3为
Figure BDA0002614849150000484
13.根据前述任一项所述的化合物，其具有以下结构之一：
Figure BDA0002614849150000491
14.根据前述任一项所述的化合物，用于医药。
15.根据前述任一项所述的化合物，用于治疗如本文所定义的急性脑损伤。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的化合物在制备用于治疗如本文所定义的急性脑损伤的药物中的用途。
17.一种治疗患有急性脑损伤的受试者的方法，所述治疗包括向所述受试者施用有效量的如项1-13中任一项所定义的化合物。
18.式I的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗急性脑损伤：
Figure BDA0002614849150000501
其中R1和R2形成环体系以获得选自以下的化合物：
Figure BDA0002614849150000502
其中n是0或1；
R3选自H、-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-苄基、聚乙二醇基(PEG)，或基团如
Figure BDA0002614849150000503
其中R9选自-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu或-tBu，并且其中R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H、–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu、–C(＝O)-苄基、聚乙二醇基(PEG)，或基团如
Figure BDA0002614849150000511
其中R11选自-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu或-tBu，并且其中R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R5、R6、R7和R8彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；
m是0或1；并且
X是N、O、S、CH2。
19.根据项18所述用途的化合物，其中所述化合物选自：
Figure BDA0002614849150000512
序列表
<110> 哥本哈根大学
<120> 用于治疗急性脑损伤的化合物
<130> P020583PCT1
<160> 12
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD14 (F)
<400> 1
aatctaccga ccatggagc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD14 (R)
<400> 2
actttcctcg tctagctcg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-6 (F)
<400> 3
ctctgggaaa tcgtggaaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-6 (R)
<400> 4
ccagtttggt agcatccatc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9 (F)
<400> 5
cagccgactt ttgtggtctt c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MMP9 (R)
<400> 6
cggccgtaga gactgcttct 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GFAP (F)
<400> 7
ggagatgcgg gatggtgag 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GFAP (R)
<400> 8
accacgtcct tgtgctcctg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Rpl13a (F)
<400> 9
ggaggggcag gttctggtat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Rpl13a (R)
<400> 10
tgttgatgcc ttcacagcgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDHA (F)
<400> 11
gcccatgcca gggaagatta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SDHA (R)
<400> 12
tgttccccaa acggcttctt 20

Claims (43)

1.根据式I的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002614849140000011
其中当R5为H，且R1和R2形成环体系时，则所述化合物选自以下式II或式IV的化合物：
Figure FDA0002614849140000012
其中
n是0或1；
X选自O或NH；
Y是NH、O、S、CH2；
R3选自H；直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-iBu、戊基、新戊基、己基；-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure FDA0002614849140000013
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；-C(＝O)-C1-C6-烷基，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)，或基团如
Figure FDA0002614849140000021
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R6和R7彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；
或者当R2为H，并且R1和R5形成环体系时，则所述化合物具有式III：
Figure FDA0002614849140000022
其中
n是0或1；
X为O或NH；
m是0或1；
R3选自H；直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-iBu、戊基、异戊基、己基；-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure FDA0002614849140000023
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；–C(＝O)-C1-C6-烷基，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
Figure FDA0002614849140000031
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R13和R14彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；
条件是该化合物不是下列之一：
Figure FDA0002614849140000032
Figure FDA0002614849140000041
其中R’是COOH，R”是H且R”’是OCH3，或
其中R’是COOH，R”是CH3，R”’是OH。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有式III。
3.根据权利要求1所述的化合物，其具有式II。
4.根据权利要求1所述的化合物，其具有式IV。
5.根据权利要求1所述的化合物，其具有式II或式III，并且其中n是0。
6.根据权利要求1的化合物，其具有式IV，并且其中n是1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3和R4中的一个为H。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R3和R4均为H。
9.根据权利要求1、2、5、7-8中任一项所述的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个在1位或2位。
10.根据权利要求1、2、5、7-9中任一项所述的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基或-CH＝CH-芳基。
11.根据权利要求1、2、5、7-10中任一项所述的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-芳基。
12.根据权利要求1、2、5、7-11中任一项所述的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-苯基。
13.根据权利要求1-7、9-12中任一项所述的化合物，其中R3选自
Figure FDA0002614849140000051
或者R4选自
Figure FDA0002614849140000052
14.根据权利要求1-7、9-13中任一项所述的化合物，其中R3为
Figure FDA0002614849140000053
15.根据权利要求1、3、5、7、13-14中任一项所述的化合物，其具有式II，其中R4为H且R3为
Figure FDA0002614849140000054
16.根据权利要求1、2、3、7中任一项所述的化合物，其具有式III，其中n＝0，R3为H，X为O，R4为H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，R14为H。
17.根据权利要求1、2、3、7中任一项所述的化合物，其具有式III，其中n＝0，R3选自H、-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu和Ph；X是O，R4是H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，R14是H。
18.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X是O。
19.根据权利要求1、3、5、7-8、13-15中任一项所述的化合物，其具有式II，其中X是NH。
20.根据权利要求1所述的化合物，其具有以下结构之一：
Figure FDA0002614849140000055
Figure FDA0002614849140000061
Figure FDA0002614849140000071
21.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，用于药物。
22.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，用于治疗急性脑损伤。
23.一种治疗患有急性脑损伤的受试者的方法，所述治疗包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-20中任一项所定义的化合物。
24.一种用于治疗急性脑损伤的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物具有式I
(式I)
其中当R5为H且R1和R2形成环体系时，所述化合物选自以下式II或式IV的化合物：
(式II)，或
(式IV)
其中
n是0或1；
X选自O或NH；
Y是NH、O、S、CH2；
R3选自H；直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-iBu、戊基、新戊基、己基；-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
或，
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；–C(＝O)-C1-C6-烷基，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
或，
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R6和R7彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1；
或者当R2为H且R1和R5形成环体系时，则所述化合物具有式III
(式III)
其中
n是0或1；
X为O或NH；
m是0或1；
R3选自H；直链或支链C1-C6-烷基，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu、-iBu、戊基、异戊基、己基；-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
或，
其中R9和R10彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；尤其是，R10选自H、-Me、-Et、-iPr；
R4选自H；–C(＝O)-C1-C6-烷基，包括–C(＝O)-Me、–C(＝O)-Et、–C(＝O)-Pr、–C(＝O)-iPr、–C(＝O)-Bu、–C(＝O)-tBu；–C(＝O)-苄基；聚乙二醇基(PEG)；或基团如
或，
其中R11和R12彼此独立地选自直链或支链C1-C6，包括-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-iBu、-tBu、戊基、新戊基、己基；R12选自H、-Me、-Et、-iPr；
R13和R14彼此独立地选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基、-CH＝CH-芳基、NH2、NO2、OH、SH、直链或支链-O-C1-8烷基、直链或支链-S-C1-8烷基、直链或支链-NH-C1-8烷基、-O-芳基、-S-芳基、-NH-芳基，其中芳基包括具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的芳基，并且其中p为0或1。
25.根据权利要求24所述用途的化合物，其具有式III。
26.根据权利要求24所述用途的化合物，其具有式II。
27.根据权利要求24所述用途的化合物，其具有式IV。
28.根据权利要求24所述用途的化合物，其具有式II或式III，并且其中n是0。
29.根据权利要求24所述用途的化合物，其具有式IV，并且其中n是1。
30.根据权利要求24-29中任一项所述用途的化合物，其中R3和R4中的一个是H。
31.根据权利要求24-30中任一项所述用途的化合物，其中R3和R4都是H。
32.根据权利要求24-25、28、30-31中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中R13为H且R14在1位或2位。
33.根据权利要求24-25、28、30-32中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、芳基、直链或支链C1-8烷基、-CH2(CH2)p-芳基或-CH＝CH-芳基。
34.根据权利要求24-25、28、30-33中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-芳基。
35.根据权利要求24-25、28、30-34中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中R13和R14中的一个是H，另一个选自H、F、Cl、Br、I、Ph或-CH＝CH-苯基。
36.根据权利要求24-30、32-35中任一项所述用途的化合物，其中R3选自
Figure FDA0002614849140000101
或R4选自
Figure FDA0002614849140000102
37.根据权利要求24-30、32-36中任一项所述用途的化合物，其中R3是
Figure FDA0002614849140000103
38.根据权利要求24、26、28、30、36-37中任一项所述用途的化合物，其具有式II，其中R4为H且R3为
Figure FDA0002614849140000104
39.根据权利要求24-26、30中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中n＝0，R3为H，X为O，R4为H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，并且R14为H。
40.根据权利要求24-26、30中任一项所述用途的化合物，其具有式III，其中n＝0，R3选自H、-Me、-Et、-Pr、-iPr、-Bu、-tBu和Ph；X是O，R4是H，R13选自H、卤素、苯基、甲基，且R13在1位或2位，R14是H。
41.根据前述权利要求中任一项所述用途的化合物，其中X为O。
42.根据权利要求24、26、28-30、36-38中任一项所述用途的化合物，其具有式II，其中X是NH。
43.根据权利要求24所述用途的化合物，其中所述化合物具有以下结构之一：
Figure FDA0002614849140000111
Figure FDA0002614849140000121
Figure FDA0002614849140000131
CN201980011451.6A 2018-02-02 2019-02-01 用于治疗急性脑损伤的化合物 Pending CN111989094A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201870067 2018-02-02
DKPA201870067 2018-02-02
PCT/DK2019/050041 WO2019149329A1 (en) 2018-02-02 2019-02-01 Compounds for the treatment of acute brain injury

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111989094A true CN111989094A (zh) 2020-11-24

Family

ID=65363024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980011451.6A Pending CN111989094A (zh) 2018-02-02 2019-02-01 用于治疗急性脑损伤的化合物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210122700A1 (zh)
EP (1) EP3746064A1 (zh)
JP (1) JP7488521B2 (zh)
CN (1) CN111989094A (zh)
AU (1) AU2019214252B2 (zh)
CA (1) CA3089161A1 (zh)
WO (1) WO2019149329A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021016006A (es) * 2019-06-28 2022-04-07 Univ Copenhagen Tratamiento de trastornos del sistema nervioso central (snc) con perturbaciones del sueño.
WO2023170024A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 University Of Copenhagen Camk2 modulators and their use in medicine

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103533949A (zh) * 2011-05-13 2014-01-22 哥本哈根大学 作为缺血性脑损伤的有效神经保护剂并用于治疗疼痛的psd-95的高亲和力的二聚抑制剂

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5466715A (en) * 1991-12-31 1995-11-14 Sterling Winthrop Inc. 3,4-disubstituted phenols-immunomodulating agents
IT1312362B1 (it) * 1999-06-29 2002-04-15 Neuroscienze S C A R L Derivati dell'acido (5,7,8,9-tetraidro-5-idrossi-6h-benzociclo-ept-6-iliden) acetico
JP2010500351A (ja) 2006-08-09 2010-01-07 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド ラクタムタキキニン受容体拮抗薬の製造法
WO2013024028A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compounds and compositions for treating proteinopathies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103533949A (zh) * 2011-05-13 2014-01-22 哥本哈根大学 作为缺血性脑损伤的有效神经保护剂并用于治疗疼痛的psd-95的高亲和力的二聚抑制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STINE B. VOGENSEN等: "New Synthesis and Tritium Labeling of a Selective Ligand for Studying High-Affinity γ Hydroxybutyrate (GHB) Binding Sites" *
潘永惠等: "-羟基丁酸对大鼠局部脑缺血再灌流损伤的保护作用" *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019214252A1 (en) 2020-08-13
JP7488521B2 (ja) 2024-05-22
US20210122700A1 (en) 2021-04-29
CA3089161A1 (en) 2019-08-08
JP2021513522A (ja) 2021-05-27
EP3746064A1 (en) 2020-12-09
AU2019214252B2 (en) 2024-04-04
WO2019149329A1 (en) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110809467B (zh) Sestrin-gator2相互作用的调节剂及其用途
TWI299731B (en) Selected fused pyrrolocarbazoles
US7732482B2 (en) Compound from Antrodia camphorata and the use thereof
JP3348859B2 (ja) プロテインキナーゼｃインヒビター
EP3983384B1 (en) N-(phenyl)-indole-3-sulfonamide derivatives and related compounds as gpr17 modulators for treating cns disorders such as multiple sclerosis
BR112020025618A2 (pt) piridinila e pirazinil-(aza)indolsulfonamidas
CA2947838A1 (en) Compounds for treatment of angiogenesis-mediated diseases
RU2661895C2 (ru) Соединение сложного эфира гуанидинобензойной кислоты
TW201620887A (zh) 化合物及方法
CN111989094A (zh) 用于治疗急性脑损伤的化合物
KR20160018537A (ko) 베타-세크레타제(bace) 저해제로서의 4-아미노-6-페닐-5,6-디하이드로이미다조[1,5-a]피라진 유도체
RU2528333C2 (ru) Соединения и способы лечения боли и других заболеваний
WO2020024977A1 (zh) 用于治疗神经***疾病的化合物及其应用
WO2024031963A1 (zh) 一种降解亲环素a的嵌合体化合物及其制备方法与应用
EP3186257B1 (en) Novel chromone oxime derivative and its use as allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors
Li et al. Novel O-benzylcinnamic acid derivative L26 treats acute lung injury in mice by MD-2
TW201438717A (zh) 預防或治療蕭格倫徵候群之方法
JP2020083811A (ja) １，５−アンヒドロフルクトース誘導体を含むａｍｐｋ活性化剤
RU2798107C2 (ru) Производные 2,6-диметил-n-((пиридин-4-ил)метил)имидазо[1,2-b]пиридазин-8-амина и 2,5-диметил-n-[(пиридин-4-ил)метил]пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-амина для лечения вирусных инфекций
WO2023232143A1 (zh) 一种磷类化合物及其用途
CA3141924A1 (en) A class of small-molecule compounds and their prodrugs for intervention with camk2a, and their use in acute brain injuries and central hypersomnias
RU2799454C2 (ru) Терапевтический препарат для лечения нейродегенеративных заболеваний и его применение
RU2675794C1 (ru) Мультифункциональные конъюгаты такрина и его аналогов с производными 1,2,4-тиадиазола, способ их синтеза и применение для лечения нейродегенеративных заболеваний
WO2020154243A1 (en) Compounds and methods for the treatment of degenerative disorders
Cai et al. Discovery of a dual-acting inhibitor of interleukin-1β and STATs for the treatment of inflammatory bowel disease

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination