CN111951898B - 一种筛选能将l-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于L‑氨基酸发酵的技术领域。本发明提供一种筛选能将L‑氨基酸转化为2‑酮酸酶的方法，包括如下步骤：用每个亚家族HMM图谱对最终数据库中的序列进行评分获得E值低于0.001的序列；得到属于I和II类的15个AT。本发明的有益效果：AT来源广泛，易于异源表达，无需额外添加昂贵的辅因子；高活性，高立体选择性等优点。
Description
技术领域
本发明涉及2-酮酸、D-氨基酸生物催化合成的技术领域。
背景技术
近些年，代谢工程和合成生物学的发展使L-氨基酸的发酵取得了巨大成功。2017年全球氨基酸产量约为850万吨，预计到2022年将达到1100万吨。而随着现代生物技术的进一步发展，L-氨基酸的生产成本在持续走低。我国作为氨基酸生产和消费大国，大宗型氨基酸产品长期处于供过于求的状态。因此，使用L-氨基酸作为初始原料生产高附加值产品成为亟待解决的问题。
2-酮酸作为L-氨基酸合成的直接前体物质在人类和动物的新陈代谢中起着重要的作用，并被广泛应用于医药，食品和农业等领域中。但是目前2-酮酸的合成主要是依赖化学方法，这些方法需要昂贵的催化剂或特殊的起始化合物，从而存在高生产成本和环境不友好等缺点。
采用生物酶法催化天然L-氨基酸转化为2-酮酸在可持续性方面具有突出的优势：可再生资源作为起始原料，温和的反应条件和高原子经济性。基于此，目前发现有四类酶可以催化L-氨基酸生成2-酮酸，即L-氨基酸脱氢酶(LADH)，L-氨基酸氧化酶(LAAO)，L-氨基酸脱氨酶(LAAD)和L-氨基酸氨基转移酶(AT)。
尽管高效率以及高对映选择性和区域选择性使AT具有参与酶促级联反应和2-酮酸合成的能力，但是AT一般只接受一组相似氨基酸作为底物，这种底物耐受性阻碍了该技术的广泛应用。此外，某些氨基酸(如苏氨酸，赖氨酸和精氨酸)并没有对应的转氨酶或者一些转氨酶活性较低。因此，如何通过生物信息学手段寻找兼容上述反应体系的新型AT以扩大底物接受范围成为本领域研究的难点。
由于近年来手性非天然氨基酸在制药和农业化学工业中受到越来越多的关注，因此非常需要一种由生产的2-酮酸合成D-氨基酸和N-甲基化氨基酸的经济有效的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选能将L-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法，包括如下步骤：用每个亚家族HMM图谱对最终数据库中的序列进行评分获得E值低于0.001的序列；得到属于I和II类的15个AT。
进一步地，所述最终数据库中的序列的获得方法，包括：将UniprotKB数据库中源自细菌和古细菌的未被研究的AspAT/ARAT和AlaAT序列下载为数据集，然后对数据集去除冗余序列得最终数据库的序列。
进一步地，所述HMM亚家族图谱的建立方法，包括：从Swiss-Port检索已被研究确认的AspAT/ARAT和AlaAT的序列；对这些序列去除冗余，使用HMMER软件包建立HMM亚家族图谱。
更进一步地，所述去除冗余序列的方法为去除氨基酸个数＞200且与AspAT/ARAT或AlaAT序列的相似度＜90％的序列。
本发明的有益效果：
1.AT来源广泛，易于异源表达，无需额外添加昂贵的辅因子；高活性，高立体选择性等优点。
2.使用廉价且可再生的底物和辅助因子，无需额外添加其他辅因子再生***，将不利的化学平衡转移到产物的合成方向，减弱了2-酮戊二酸对转氨酶的抑制作用。
3.反应条件温和(pH 8.0-8.5，30℃)，底物转化率高，目标化合物的HPLC收率很高(＞92.7％)，且具备高立体选择性(产物ee值＞99％)。
附图说明
图1.L-氨基酸转化为2-酮酸的多酶级联反应图。
图2.通过亚族HMM图谱对转氨酶序列进行筛选的总体分析方案与结果图。
其中，“in”和“jn”分别是未知序列n对AspAT/ATAR和AlaAT的亚家族图谱分析的得分值。
图3.酶促级联反合成手性非天然氨基酸路线图。
具体实施方式
1.在AT家族I和II中，依据蛋白质结构和序列特征，将AspAT和ARAT归类为同一亚家族(AspAT/ARAT)；由于AlaAT与AspAT/ARAT序列差异较大，将AlaAT归类为I和II类中的另一个亚家族。
表1.转氨酶的分类及其底物谱
2.从Swiss-Port检索已被实验研究确认的AspAT/ARAT和AlaAT序列，用于构建家族序列图谱。
3.对这些序列去除冗余，去掉其中相似度大于90％的序列。余下的序列在亚家族内使用MAFFT，V7.419软件包进行多序列比对，使用HMMER3.2.1软件包建立HMM亚家族图谱。
4.将UniprotKB数据库中源自细菌和古细菌的未被研究的AspAT/ARAT和AlaAT序列下载作为数据集，对数据集去除冗余序列得最终数据库的序列；
所述去除冗余序列的方法为使用CD-HIT软件包去除氨基酸个数＜200且与AspAT/ARAT或AlaAT序列的相似度＞90％的序列。
5.用每个亚家族HMM图谱对最终数据库中的序列进行评分(参数设为默认值，保留E值低于0.001的序列)，将上述序列依据最终打分值绘制于2维平面内(图2)。
共在二维空间上绘制的序列数为2667；如序列的打分值明显偏向于AspAT/ARAT或AlaAT，这些序列是典型的AspAT/ARAT或AlaAT。
根据序列的分布，选择了属于I和II类的15个AT作为候选序列。
表2.选取的来自于家族I和II的15个AT的信息
相关蛋白序列在Uniprot上搜索Accession ID即可获得。
6.将上述候选序列克隆到pET-28a载体中并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，然后采用His标签进行亲和纯化。除去大肠杆菌中无法充分表的达两种蛋白质AlaAT7和ATI2。其余13个AT均以可溶形式表达并通过纯化获得了纯度较高的蛋白。
7.测定上述13个ATs对除L-Pro和L-Glu之外的18种L-氨基酸的活性和特异性(表3)。
可以看到不同来源的AT表现出互补的底物特异性，这些转氨酶能够耐受大多数L-氨基酸底物(14种)。
表3.筛选的AT对18个L-氨基酸的活性。
表3续
活性单位：U/mg(1U等于每分钟催化产生1微摩尔产物所需的酶的量)
活性测定条件：30℃，200rpm，1mL反应体系中测定，反应体系由0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，20mM L-氨基酸，10mM 2-酮戊二酸酯，10μg/ml ATs和20μMPLP组成。
8.酶在2-酮酸合成中的催化能力
选择在单个底物上具有较高活性的AT作为候选酶。对表4所示的9个L-氨基酸进行了测试，所有的酶促反应均在摇床中进行，以确保补充氧气。几乎所有测定的L-氨基酸都可以通过酶促级联反应有效地转化为相应的2-酮酸，在24小时内具有较高的转化率(＞99％)(表4)。
值得注意的是，由于乙醛酸，草乙酸和B-吲哚基丙酮酸容易在中性pH下自发进行β-脱羧副反应，因此通过动力学控制来获得上述2-酮酸的最大收率分别达到31.9％，40.％和78.9％。
表4.酶促级联反应氧化L-氨基酸为对应的2-酮酸。
将L-氨基酸通过基于AT的级联反应氧化形成2-酮酸，反应在30℃，200rpm，1mL反应体系中进行，反应体系主要成分为：0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，30mM L-氨基酸，1mM 2-酮戊二酸，0.25mg/ml ATs，0.1mg/ml LGOX，0.1mg/ml过氧化氢酶和20μM PLP。
[a]HPLC分析的产物得率；
[b]由于缺乏商品化标准品，并未进行产物得率的定量。
9.一锅两步法酶促级联反应用于合成手性非天然氨基酸。
第一步，将L-氨基酸通过基于AT的级联反应体系中氧化形成2-酮酸，得2-酮酸反应液；
其中反应体系的条件为：30℃，200rpm，1mL反应体积，反应体系成分包括：0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，30mM L-氨基酸，1mM 2-酮戊二酸，0.25mg/ml ATs，0.1mg/ml LGOX，0.1mg/ml过氧化氢酶和20μM PLP。
第二步，往2-酮酸反应液中添加0.3mg StDAPDH W121L/H227I或PfNMAADH，0.2mgGDH，终浓度为1mM的NADP+；1.3当量的葡萄糖和5当量的胺，在pH为8.0-8.5条件下反应。在反应过程中，用NaOH将第二步反应的pH调节至8.0-8.5。
产物收率及立体构型确定方法：样品采用2，4-二硝基氟苯衍生(衍生方法：样品溶液经稀释后使得氨水和氨基酸总浓度低于50mM，吸取25微升样品溶液，加入10微升1M的碳酸氢钠，40微升36.7mM2，4-二硝基氟苯的丙酮溶液，于60℃保温30分钟，取出立刻加入20微升1M盐酸终止反应)，衍生溶液进行HPLC测定产物峰面积，计算收率和ee值。
反应流程如下：
具体收率及产物立体构型结果见下图：
有益效果：
1.AT来源广泛，易于异源表达，无需额外添加昂贵的辅因子；高活性，高立体选择性等优点；
2.使用廉价且可再生的底物和辅助因子，无需额外添加其他辅因子再生***，将不利的化学平衡转移到产物的合成方向，减弱了2-酮戊二酸对转氨酶的抑制作用。
3.在温和的反应条件下(pH 8.0-8.5，30℃)，采用一锅两步顺序合成工艺，从L-氨基酸制备2-酮酸并和5倍当量的氨或甲胺，进行两步反应，逐步实现高附加值手性胺的合成。从结果可以看到，底物几乎完全转化为所需的产物，各目标化合物的HPLC收率很高(＞92.7％)，且具备高立体选择性(产物ee值＞99％)。
Claims (4)
1.一种筛选能将L-氨基酸转化为2-酮酸的酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将UniprotKB数据库中源自细菌和古细菌的未被研究的AspAT/ARAT和AlaAT序列下载为数据集，然后对数据集去除冗余序列得最终数据库的序列；用每个亚家族HMM图谱对所述最终数据库中的序列进行评分获得E值低于0.001的序列；得到属于I和II类的15个AT；
所述去除冗余序列的方法为，去除氨基酸个数>200且与所述AspAT/ARAT或AlaAT序列的相似度<90％的序列；
所述亚家族HMM图谱的建立方法，包括：
从Swiss-Port检索已被研究确认的所述AspAT/ARAT和AlaAT的序列；
对这些序列去除冗余，使用HMMER软件包建立所述亚家族HMM图谱。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AT用于合成手性非天然氨基酸的方法，包括：
将L-氨基酸通过基于AT的级联反应体系中氧化形成2-酮酸，得2-酮酸反应液；
往2-酮酸反应液中添加0.3mg StDAPDHW121L/H227I或PfNMAADH，0.2mg GDH，1.3当量的葡萄糖和5当量的胺，在pH为8.0-8.5条件下反应。
3.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系的条件为：30℃，200rpm，1mL反应体积。
4.依据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系成分包括：0.2M磷酸盐缓冲液pH 7.5，30mM L-氨基酸，1mM 2-酮戊二酸，0.25mg/mlATs，0.1mg/ml LGOX，0.1mg/ml过氧化氢酶和20μM PLP。
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| Exploration of Transaminase Diversity for the Oxidative Conversion of Natural Amino Acids into 2‑Ketoacids and High-Value Chemicals;Tao Li等;ACS Catal.(第10期);7950−7957 * |
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