CN111948299B - 测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法，包括如下步骤：(1)样品预处理：将需要检测的泊沙康唑注射液与硫酸铜溶液混合，加入氢氧化钠溶液和水，混合，过滤，收集滤液，作为供试品溶液；(2)洗脱：先将供试品溶液注入色谱柱，再泵入洗脱液进行洗脱；(3)检测：记录供试品溶液乙二胺四乙酸二钠峰面积；(4)计算结果：将供试品与乙二胺四乙酸二钠对照品标准曲线进行比较，即可获得检测结果。本发明采用梯度洗脱高比例水相可将色谱柱上残留的磺丁基醚倍他环糊精钠基本洗脱完全，有效消除其对乙二胺四乙酸二钠测定的影响，检测结果误差小于1.5％，能够满足相关领域应用的需要。

Description

测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法

技术领域

本发明涉及泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量测定的方法，具体涉及液相色谱法测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法。

背景技术

乙二胺四乙酸二钠(Disodium Edetate，EDTA-2Na)在药物制剂中广泛用作螯合剂，能螯合催化自氧化反应的铜、铁(Fe³⁺)和锰等微量金属离子，发挥抗氧剂增效剂作用，可显著减少输液的不溶性微粒数量，提高药物在制备、存储和临床配制过程中的稳定性。

EDTA-2Na被列为公认安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)物质,收载于FDA《非活性组分指南》,英国和中国也批准用于非注射和注射给药制剂。在药物制剂中EDTA-2Na被用作螯合剂的一般浓度仅为0.005％～0.1％(W/V)。但EDTA-2Na易与钙螯合，长期大剂量服用或静脉输注速度过快可引起低血钙症。另外肾损伤病人，结核病人与心脏功能损伤病人应慎用EDTA-2Na。泊沙康唑注射液(300mg：16.7ml)处方中含3mg EDTA-2Na。为确保用药安全，需建立灵敏、准确的分析方法测定EDTA-2Na含量，避免因过量而可能带来危害。

文献报道的药物制剂中EDTA-2Na的含量测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱质谱联用(LC-MS)。EDTA-2Na在反相C₁₈色谱柱上保留弱，需使用反相离子对色谱法或选择离子色谱法，阴离子交换柱。EDTA-2Na不含共轭结构，可使用蒸发光散射检测器，电导检测器，或将其用金属离子衍生化处理，利用其金属螯合物具紫外吸收的性质进行含量测定。

泊沙康唑注射液处方中包含40％(w/v)的磺丁基醚倍他环糊精钠(Sulfobutylether-β-cyclodextrin，sodium salt，SBE-β-CD)，在试验中发现，SBE-β-CD在色谱柱上的残留会引起EDTA-2Na色谱峰的保留时间逐针前移及理论塔板数逐针降低，并且随着SBE-β-CD浓度的增加而影响增大。这与文献报道SBE-β-CD会使糖肽类药物峰保留时间滞后和峰形变宽、使金刚烷乙胺峰面积变小类似。尝试将供试品溶液浓度减小至原来的10％，虽然峰保留时间变化减小，但峰面积RSD％增大至7.38％。文献报道采用阴离子交换固相萃取方法和封端的环己基固相萃取盒可除去样品中的SBE-β-CD，但操作复杂，且泊沙康唑注射液中的EDTA-2Na用量少、提取过程很可能会影响其回收率。

发明内容

本发明的目的是公开一种测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明的方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理：将需要检测的泊沙康唑注射液与硫酸铜溶液混合，然后加入氢氧化钠溶液和水至一定体积，混合，过滤，取续滤液作为供试品溶液；

所述的供试品溶液中，以总体积为10ml为例，各个组份的含量为：泊沙康唑注射液0.5～1.5ml，硫酸铜摩尔量为2～10μmol，氢氧化钠摩尔量为20～60μmol；

对照品溶液的制备，方法如下：

取EDTA-2Na对照品约10mg(含EDTA-2Na约9mg)，精密称定,置于50mL容量瓶中，用水溶解稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液；取上述对照品贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，加1％硫酸铜溶液100μL(相当于硫酸铜4μmol)，混匀,再加水至刻度,摇匀,滤过，取续滤液即得对照品溶液。

所述的EDTA-2Na对照品为(美国药典标准品，批号：R028C0，含量100.0％)；

(2)洗脱：先将供试品溶液注入色谱柱，再泵入洗脱液进行洗脱。为了消除SBE-β-CD在色谱柱中的残留而对EDTA-2Na峰保留时间以及峰形的影响，本发明需要采用特定的洗脱方法，具体如下：

色谱条件：

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×150mm,5μm)或效能相当的色谱柱；柱温30±5℃；检测波长254±5nm；进样量5～10μl。

洗脱液由乙腈、A(20±5mmol·L^-1四丁基硫酸氢铵,用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.0±0.5)和水组成，其浓度随时间变化，具体如下：

其中：浓度均为体积浓度，四丁基硫酸氢铵(Tetrabutylammonium hydrogensulfate，TBAHS)可采用Supelco公司的产品；

流速0.8±0.4ml·min^-1。

(3)检测：记录供试品溶液EDTA-2Na峰面积；

(4)计算结果，将供试品与EDTA-2Na对照品标准曲线进行比较，即可获得检测结果；

本发明选择合适的金属离子显色剂、筛选流动相的离子对试剂种类、浓度和pH及优化梯度洗脱程序等手段，消除了SBE-β-CD对EDTA-2Na测定的影响、建立了泊沙康唑注射液中的EDTA-2Na含量测定方法并进行了方法学验证，结果表明该方法专属性好，灵敏度高，线性范围、准确度均能满足测定要求，且耐用性良好。

本发明的有益效果是：

梯度洗脱高比例水相能将色谱柱上残留的SBE-β-CD基本洗脱完全，有效的消除了SBE-β-CD对EDTA-2Na测定的影响。建立的反相离子对高效液相色谱法测定泊沙康唑注射液中EDTA-2Na的含量，检测结果误差小于1.5％，能够满足相关领域应用的需要。

附图说明

图1是EDTA-2Na对照品标准曲线。

图2是实施例2-4和对比实施例1～2的供试品溶液测定结果与对照品标准曲线的比较。

具体实施方式

实施例1

对照品标准曲线的制备：

精密称取EDTA-2Na对照品12.5mg(含EDTA-2Na 11.3mg)，置25ml量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作贮备液。精密量取贮备液2.0ml，置10ml量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，作线性贮备液。分别精密量取线性贮备液0.05、0.2、0.5、1、2和3ml，各置10ml量瓶中，加1％硫酸铜溶液100μl(相当于硫酸铜4μmol)，用水定容，摇匀，制得EDTA-2Na浓度为0.45、1.81、4.52、9.03、18.06和27.10μg/ml的系列浓度溶液。

分别进样，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，浓度c为横坐标，进行线性回归，得回归方程A＝2481.3c-1462.2，r²＝0.9995。结果显示，EDTA-2Na在0.45-27.10μg/ml浓度范围内线性关系良好。

实施例2

(1)配制供试品溶液：

配制泊沙康唑注射液：称取EDTA-2Na18mg加水适量使溶解，加入磺丁基醚倍他环糊精钠40g，加水适量并搅拌使溶解，加入泊沙康唑原料药1.8g，加盐酸适量，搅拌使泊沙康唑溶解，加氢氧化钠溶液调pH至2.6，再加水至100ml，即得。

其中：

各个组份的含量如下：

(2)样品预处理：将配制的泊沙康唑注射液与硫酸铜溶液混合，然后加入氢氧化钠溶液和水，混合，过滤，收集滤液，作为供试品溶液；

10ml所述的供试品溶液中，各个组份的含量为：泊沙康唑注射液1ml，1％硫酸铜溶液为100μl(相当于硫酸铜4μmol)，0.1M氢氧化钠溶液400μl(相当于氢氧化钠40μmol)；其中：EDTA-2Na含量为0.18mg/ml；

(3)洗脱：先将供试品溶液注入液相色谱，再泵入洗脱液进行洗脱。色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×150mm,5μm)；柱温30℃；检测波长254nm；进样量5μl。

洗脱方法包括洗脱液和洗脱时间如下：

洗脱液由乙腈、A(20mmol·L^-1TBAHS,用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.0)；和水组成，其浓度随时间变化，具体如下：

其中：浓度均为体积浓度，TBAHS的化学名称为四丁基硫酸氢铵(Tetrabutylammonium hydrogen sulfate)，可采用Supelco公司的产品；

流速0.8ml·min^-1。

(4)检测：记录供试品溶液EDTA-2Na峰面积；

(5)计算结果，将供试品与EDTA-2Na对照品标准曲线进行比较，见图2，获得检测结果；

结果表明：误差为0.7％，能够满足准确测定泊沙康唑注射液中的EDTA-2Na浓度的需要。

实施例3

(1)配制供试品溶液：

配制泊沙康唑注射液：称取EDTA-2Na9mg加水适量使溶解，加入磺丁基醚倍他环糊精钠40g，加水适量并搅拌使溶解，加入泊沙康唑原料药1.8g，加盐酸适量，搅拌使泊沙康唑溶解，加氢氧化钠溶液调pH至2.6，再加水至100ml，即得。

其中：

各个组份的含量如下：

其他同实施例2，结果见图2；检测误差为1.0％。

实施例4

(1)配制供试品溶液：

配制泊沙康唑注射液：称取EDTA-2Na21.6mg加水适量使溶解，加入磺丁基醚倍他环糊精钠40g，加水适量并搅拌使溶解，加入泊沙康唑原料药1.8g，加盐酸适量，搅拌使泊沙康唑溶解，加氢氧化钠溶液调pH至2.6，再加水至100ml，即得。

其中：

各个组份的含量如下：

其他同实施例2，结果见图2；检测误差为0.2％。

实施例5

配制与实施例2相同的供试品溶液：

采用与实施例2相同的方法进行样品预处理，注入液相色谱进行检测，色谱条件：色谱柱

XB-C₁₈柱(4.6mm×150mm,5μm)；柱温35℃；检测波长259nm；进样量5μl。

洗脱方法包括洗脱液和洗脱时间如下：

洗脱液由乙腈、A(25mmol·L^-1TBAHS,用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.5)和水组成，其浓度随时间变化，具体如下：

流速0.7ml·min^-1。

其他同实施例2，结果见图2；检测误差为0.8％。

实施例6

配制与实施例2相同的供试品溶液：

采用与实施例2相同的方法进行样品预处理；

注入液相色谱进行检测，色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×150mm,5μm)；柱温25℃；检测波长249nm；进样量10μl。

洗脱方法包括洗脱液和洗脱时间如下：

洗脱液由乙腈、A(15mmol·L^-1TBAHS,用氢氧化钠或磷酸调节pH至2.5)和水组成，其浓度随时间变化，具体如下：

流速1.0ml·min^-1。

其他同实施例2，结果见图2；检测误差为0.4％。

对比实施例1

配制与实施例2相同的供试品溶液：

样品不进行预处理，直接注入液相色谱，其他同实施例2，结果见图2，误差为4.9％。并且样品随时间放置会析出不溶物。

对比实施例2

配制与实施例2相同的供试品溶液：

采用与实施例2相同的方法进行样品预处理，注入液相色谱，采用下述方法进行洗脱，洗脱液为乙腈:A(20mmol·L^-1TBAHS,用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.0)＝5:95，洗脱时间为10分钟。

其他同实施例2，结果显示，EDTA-2Na峰的保留时间随着进样针数的增加会发生前移，连续进样6针，第6针保留时间与第1针保留时间的误差6％；测定结果见图2，误差为3.0％。

对比实施例3

配制与实施例2相同的供试品溶液：

采用与实施例2相同的方法进行样品预处理，注入液相色谱，洗脱方法包括洗脱液和洗脱时间如下：

洗脱液由乙腈、A(5mmol·L^-1TBAHS,用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.0)；和水组成，其浓度随时间变化，具体如下：

其他同实施例2，结果见图2；检测误差为4.3％。

由实施例和对比实施例的结果可见，本发明选择合适的金属离子显色剂、筛选流动相的离子对试剂种类、浓度和pH及优化梯度洗脱程序等手段，消除了SBE-β-CD对EDTA-2Na测定的影响、建立了泊沙康唑注射液中的EDTA-2Na含量测定方法并进行了方法学验证，结果表明该方法专属性好，灵敏度高，线性范围、准确度均能满足测定要求，且耐用性良好。

Claims (2)

1.测定泊沙康唑注射液中乙二胺四乙酸二钠含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品预处理：将需要检测的泊沙康唑注射液与硫酸铜溶液混合，然后加入氢氧化钠溶液和水，混合，过滤，收集滤液，作为供试品溶液；

10ml所述的供试品溶液中，各个组份的含量为：泊沙康唑注射液为0.5~1.5ml，硫酸铜摩尔量为2~10μmol，氢氧化钠摩尔量为20~60μmol；

(2)洗脱：先将供试品溶液注入色谱柱，再泵入洗脱液进行洗脱；

(3)检测：记录供试品溶液乙二胺四乙酸二钠峰面积；

(4)计算结果：将供试品与乙二胺四乙酸二钠对照品标准曲线进行比较，即可获得检测结果；

供试品溶液色谱条件：色谱柱 Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱4.6mm×150mm, 5μm或效能相当的色谱柱；流动相A为乙腈，B为20 mmol·L^-1硫酸氢四丁基铵，用氢氧化钠或磷酸调节pH至3.0，C为水；流速0.8±0.4ml·min^-1；柱温30±5℃；检测波长254±5nm；进样量5~10μl；

洗脱液浓度随时间变化，具体如下：

0~5分钟， 乙腈 5%， B 95%， 水 0%

5.1~15分钟， 乙腈 80%， B 20%， 水 0%

15.1~20分钟， 乙腈 10%， B 0%， 水 90%

其中：浓度均为体积浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对照品溶液的制备，方法如下：

取乙二胺四乙酸二钠对照品10mg，精密称定,置于50 ml容量瓶中，用水溶解稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液；取上述对照品贮备液1 ml，置于10 ml容量瓶中，加1%硫酸铜溶液100 μL，混匀,再加水至刻度,摇匀,滤过，取滤液即得对照品溶液。

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