CN111944770A - 一种***病毒致弱突变株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种***病毒致弱突变株及其制备方法和应用，属于生物技术和生物制品技术领域。***病毒致弱突变株是将亲本***病毒前导蛋白基因中的Lb AUG突变为ATC或AAA，突变病毒在BHK‑21细胞中的复制能力与亲本毒株相似，但在PK‑15细胞上的复制水平降低，对乳鼠的致病力显著减弱，而且此突变类型能够稳定遗传。本发明在OZK/93‑08疫苗株基因组结构基础上将前导蛋白基因中的第2个起始密码子AUG突变为ATC或AAA后，能显著致弱O型***病毒，是一种研制基因工程弱毒疫苗株的方法，将为***O型灭活疫苗抗原的生产提供一个更安全的平台。

Description

一种***病毒致弱突变株及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物制品技术领域，具体涉及一种***病毒致弱突变株及其制备方法和应用。
背景技术
***(foot-and-mouth disease，FMD)是由***病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度传染性的动物疫病，主要侵染偶蹄类动物，包括牛，猪，绵羊和山羊等。该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物传染病之一，我国将其列为一类动物疫病之首。目前，对***最有效的控制策略主要是通过接种灭活疫苗以及屠宰感染和暴露的动物来实现的。欧盟和南美的一些国家经过几十年免疫接种***病毒灭活疫苗，已经有效控制了***，被认为是灭活疫苗防控***的标杆。我国在2012年5月发布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中，明确将***列为优先防控的疫病，将疫苗免疫作为防控和净化的核心技术手段。
灭活疫苗的生产需要昂贵的设施，在这些设施中大量增殖***病毒强毒株，存在病毒从生产设施中逃逸的风险。为了降低疫苗制造过程中散毒的生产隐患，方法之一是开发生物安全性提高的***病毒株。这种工程毒株在BHK-21细胞(用于***疫苗生产的种子细胞系)中的复制能力不应降低，但在其它干扰素全能型细胞中的复制能力减弱或者对敏感动物的致病力减弱，即致弱毒株。因此，从“种毒”源头改造***疫苗强毒株，获得致弱病毒株，对于提高疫苗生产过程中的生物安全性至关重要。
前导(leader,L)蛋白是一种木瓜蛋白酶样蛋白酶，是***病毒编码的毒力因子，在***病毒发病机理中起着重要的作用。因此，对前导蛋白基因的操纵可能获得工程可行的***病毒致弱毒株。前导蛋白的翻译起始于两个不同的起始密码子(Lab AUG和LbAUG)，间隔84个核苷酸(La区域)，这导致前导蛋白存在两种形式，称为Lab蛋白和Lb蛋白。起始密码子的选择利用是影响病毒蛋白翻译起始的核心步骤之一，决定着病毒蛋白的翻译效率，所以L基因中两个起始AUG对***病毒复制起着重要的作用。先前的研究已经分析了两个起始AUG的突变对病毒复制的影响，结果表明Lab AUG突变为UGG并不妨碍***病毒的拯救，但是Lb AUG突变为UUU则拯救不到活的***病毒。另一项研究表明，La区域内***57nt的转座子导致Lb AUG的利用率降低，使得病毒对牛的致病力减弱。此外，La区域中***表位标签(Flag)不会影响病毒的存活，但会消除或大大降低病毒利用Lab AUG起始蛋白翻译活动。这些已有的结果表明，Lab AUG和Lb AUG的选择使用对于***病毒的复制和致病力非常关键。迄今为止，国内外尚无可用的Lb AUG修饰的***病毒，也没有Lb AUG修饰***致弱毒株的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种***病毒致弱突变株，所述突变株病毒具有致弱表型，对于提高疫苗生产中的生物安全性具有应用潜力。
本发明提供了一种***病毒致弱突变株，将***病毒前导蛋白基因中的LbAUG突变为ATC或AAA。
优选的，突变为ATC的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
优选的，突变为AAA的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
优选的，所述前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
优选的，所述***病毒包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型***病毒。
优选的，O型***减毒病毒株是在OZK/93-08病毒株的基础上，将前导蛋白的LbAUG突变为ATC或AAA。
本发明所述***病毒致弱突变株的制备方法，包括以下步骤：
将含***病毒全长基因组的cDNA质粒进行点突变，得到突变后的重组质粒，将突变后的重组质粒转染细胞进行病毒拯救，得到***病毒突变株。
优选的，所述点突变用引物为ATC-F/ATC-R引物对和AAA-F/AAA-R引物对；
所述ATC-F的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；
所述ATC-R的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；
所述AAA-F的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；
所述AAA-R的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示。
优选的，所述点突变所用的PCR扩增程序为94℃预变性5min后，98℃20min，68℃1min/1kb，35个循环后，72℃10min。
本发明提供了所述***病毒致弱突变株在在制备***疫苗中的应用。
本发明提供的***病毒致弱突变株，将***病毒前导蛋白基因中的LbAUG突变为ATC或AAA。利用序列测定正确的重组质粒进行***病毒突变株的拯救。间接免疫荧光试验结果显示成功获得2株LbAUG修饰的O型***病毒(rV-O/ATC和rV-O/AAA)。2株突变体病毒在细胞上连续传代，测序结果显示前导蛋白基因上分别引入的2种碱基突变能够稳定存在，表明该突变株遗传稳定性高。同时蚀斑表型和一步生长曲线的测定结果表明，rV-O/ATC和rV-O/AAA在BHK-21细胞上的复制能力与亲本毒株相似，但在PK-15细胞上rV-O/ATC和rV-O/AAA病毒的滴度明显低于亲本病毒；而对照的LbAUG突变为UGG或CUG，拯救的病毒rV-O/TGG和rV-O/CTG虽然也能稳定遗传，但是其复制能力与亲本毒株相似。对乳鼠致病力测定结果显示，与亲本毒株相比，rV-O/ATC和rV-O/AAA的LD50明显降低，对乳鼠的致病力显著减弱，而rV-O/TGG和rV-O/CTG的LD50略微低于亲本毒株。以上结果证明rV-O/ATC和rV-O/AAA具有致弱表型。这表明本发明提供的致弱病毒株应用到生物体或扩散到环境中，所述病毒株的增殖将受到很大限制，这种致弱病毒株作为疫苗毒株，在生产中的生物安全性将大大提高。因此，用本发明方法制备出的***病毒O型突变株可作为生物安全性提高的O型***疫苗的种子病毒使用。
附图说明
图1为LbAUG修饰***病毒突变株全长基因组结构示意图；
图2为拯救病毒的间接免疫荧光鉴定，其中各图标尺为10μm；
图3为拯救病毒的复制能力分析，其中A：拯救病毒的蚀斑表型；B：拯救病毒的一步生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了***病毒致弱突变株，将***病毒前导蛋白基因中的LbAUG突变为ATC或AAA(见图1)。
在本发明中，突变为ATC的前导蛋白的核苷酸序列优选为SEQ ID No.2所示。突变为AAA的前导蛋白的核苷酸序列优选为SEQ ID No.4所示。所述前导蛋白的核苷酸序列优选为SEQ ID No.5所示。
在本发明中，由于***病毒前导蛋白基因中LbAUG为保守的密码子，因此本发明提供的两种突变方案适用于所有血清型的***病毒。所述***病毒包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型。为了举例说明两种突变方案均能用于制备***病毒致弱突变株，本发明实施例以***病毒O型为亲本病毒进行具体试验，但这不能理解为对本发明保护范围的限制。以O型***病毒进行突变时，***病毒致弱突变株的构建是以OZK/93-08病毒株基因组为骨架进行，将前导蛋白基因中的LbAUG突变为ATC或AAA。
在本发明中，***病毒致弱突变株的制备方法，优选包括以下步骤，在***病毒株OZK/93-08全长感染性克隆质粒的基础上，突变LbAUG得到2种不同突变的重组质粒，利用筛选出的阳性重组质粒进行病毒拯救，得到***病毒突变株。
在本发明中，所述突变优选采用定点诱变技术进行。用于点突变的引物见表1。同时为了验证在该LbAUG位点突变为任意密码子是否都能影响病毒的复制能力，本发明还提供2种对照突变方案，Lb AUG突变为TGG和CTG(见图1)，突变方法与上述方法相同，用于点突变的引物见表1。
表1点突变引物信息
Figure BDA0002653012410000041
Figure BDA0002653012410000051
所述引物的扩增程序为：94℃预变性5min后，98℃20min，68℃1min/1kb，35个循环后，72℃10min。
在本发明中，筛选出的阳性重组质粒进行序列测定。所述拯救病毒的方法优选将测序正确的突变重组质粒用Not I线性化，在LipofectamineTM 2000(Invitrogen)的介导下，转入BSR/T7细胞中进行***病毒拯救，转染后的细胞在37℃下孵育48小时，冷冻后收集上清液，得到拯救的病毒株。得到病毒株后，优选进行验证。所述验证结果为感染拯救病毒的BHK-21细胞可以与***病毒MAb 3A24抗体反应，产生红色荧光，而正常的BHK-21细胞无荧光产生，说明在拯救病毒的增殖过程中可检测到***病毒3A蛋白的合成，表明拯救出的病毒确实是***病毒。
在本发明中，由于基因突变常导致病毒突变位点发生多种形式的回复突变和病毒复制能力发生改变。因此，本发明对2株拯救病毒分别进行遗传稳定性检测以及蚀斑试验和生长曲线测定。
遗传稳定性试验结果表明，引入的突变碱基在***病毒突变体的传代中能够保持稳定遗传，而且在拯救病毒传代中未发生其它碱基突变。
蚀斑表型和一步生长曲线一致表明，拯救病毒rV-O/ATC和rV-O/AAA在BHK-21细胞(用于***疫苗生产的细胞系)上的复制能力与亲本毒株相似，但在PK-15细胞(干扰素全能型细胞系)中的复制水平降低，这表明2株拯救病毒很可能在***病毒敏感动物中的致病力下降。
在本发明中，由于前导蛋白是决定***病毒致病机制最为重要的病毒蛋白，为了进一步验证LbAUG突变对***病毒致病力的影响，进行了拯救病毒的乳鼠致病力试验。结果显示与亲本毒株相比，rV-O/ATC和rV-O/AAA的LD50明显降低，对乳鼠的致病力明显减弱，这表明利用突变前导蛋白基因中第2个起始密码子的策略可产生致弱的***病毒。基于此，本发明提供了一种***病毒致弱突变株在***灭活疫苗生产中的应用。
本发明对所述制备疫苗的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗制备方法即可。
在病毒逃逸出***疫苗制造工厂的情况下，此类***病毒将在BHK-21细胞外的其它细胞中增殖减弱。因此，修饰前导蛋白基因中的起始密码子而对***病毒进行精确工程改造的方法为生产灭活疫苗抗原提供了一个安全的平台。
下面结合实施例对本发明提供的一种***病毒致弱突变株的制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
材料来源说明
BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213，该细胞用于制备病毒并计算病毒滴度。BHK-21细胞是***疫苗生产中用来大量繁殖病毒的细胞，这种传代细胞系是干扰素缺陷型的细胞系，拮抗病毒复制的能力有限。
PK-15通过常规商品购买途径获得。PK-15细胞系能够产生并响应干扰素，其拮抗病毒复制的能力强于BHK-21细胞系。
BSR/T7细胞从德国购买，该细胞已公开，见参考文献“Generation of bovinerespiratorysyncytial virus(BRSV)from cDNA：BRSVNS2 is not essential forvirusreplication intissue culture，and the human RSV leaderregion acts as afunctional BRSV genome promoter”，Journal ofVirology，1999，73(1)：251-259，该细胞用于***病毒的拯救。
***病毒OZK/93-08株全长感染性cDNA克隆质粒pOZKF-Z1234的构建方法已公开(见专利CN102614507A)，其L基因的序列如SEQ ID No.5所示。
实施例1
1、突变全长质粒的构建
为了获得LbAUG突变的***病毒，通过定点诱变技术，在***病毒OZK/93-08株全长感染性cDNA克隆质粒pOZKF-Z1234的基础上，将Lb AUG点突变为AUC和AAA，依次构建了LbAUG不同突变修饰的质粒。用于点突变的引物如表1所示，PCR扩增体系如表2所示，扩增程序为：94℃预变性5min后，98℃20min，68℃1min/1kb，35个循环后，72℃10min。通过序列测定验证所得重组质粒是否引入预期的突变。
表1 Lb AUG点突变所用引物
Figure BDA0002653012410000071
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002653012410000072
2.拯救突变体病毒
将测序正确的突变质粒用Not I线性化，在LipofectamineTM 2000(Invitrogen)的介导下，转入BSR/T7细胞中进行***病毒拯救。转染后的细胞在37℃下孵育48小时，冷冻后收集上清液。
突变全长cDNA克隆的构建及序列测定结果表明，获得了含预期突变的全长cDNA克隆。
将测序正确的突变全长cDNA克隆质粒和野生型(WT)质粒转染到BSR/T7细胞中，转染48h后细胞出现明显的***病毒病变，而对照组细胞形态规则、无病变，表明拯救出了***病毒，拯救病毒分别命名为rV-O/ATC和rV-O/AAA。
对比例1
按照实施例1的方法构建全长质粒和拯救突变体病毒，不同之处突变方案不同，将LbAUG点突变为UGG(SEQ ID No.1)，用于点突变的引物如表1所示。将测序正确的突变全长cDNA克隆质粒转染到BSR/T7细胞中，转染48h后细胞出现明显的***病毒病变，而对照组细胞形态规则、无病变，表明拯救出了***病毒，拯救的病毒命名为rV-O/TGG。
对比例2
按照实施例1的方法构建全长质粒和拯救突变体病毒，不同之处突变方案不同，将LbAUG点突变为CUG(SEQ ID No.3)，用于点突变的引物如表1所示。将测序正确的突变全长cDNA克隆质粒转染到BSR/T7细胞中，转染48h后细胞出现明显的***病毒病变，而对照组细胞形态规则、无病变，表明拯救出了***病毒，拯救的病毒命名为rV-O/CTG。
实施例2
拯救病毒的间接免疫荧光鉴定
BHK-21单层细胞生长至70％左右，用10MOI的感染剂量分别接种拯救出的亲本病毒(WT)及4株***病毒突变体(rV-O/TGG、rV-O/ATC、rV-O/CTG和rV-O/AAA)，37℃下孵育4h，将病毒感染细胞固定在4％多聚甲醛中，PBS缓冲液漂洗3次后用0.5％TritonX-100(Sigma-Aldrich)通透15min，加入1％BSA并放置37℃温箱中封闭1h，滴加***病毒3A单抗3A24，37℃孵育1h，PBS漂洗3次后加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma)，37℃下孵育1h，PBS漂洗3次，加入DAPI(Beyotime)孵育15min，PBS漂洗3次，使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察病毒感染细胞中荧光情况。
拯救病毒的鉴定结果如图2所示，感染拯救病毒的BHK-21细胞可以与***病毒MAb 3A24抗体反应，产生红色荧光，而正常的BHK-21细胞无荧光产生，说明在拯救病毒的增殖过程中可检测到***病毒3A蛋白的合成，表明拯救出的病毒确实是***病毒。
实施例3
拯救病毒的遗传稳定性分析
将收集的上清液按0.1倍体积接种剂量在BHK-21细胞上连续传代，分别取第3、6和10代病毒提取RNA，然后用无RNase的DNase I(Qiagen)消化除去RNA中剩余的DNA，随后进行RT-PCR扩增拯救病毒的前导蛋白基因，使用引物(LCF)5'-AGGTAACACGAGACACTC-3'(SEQ IDNo.14)对所得片段进行测序，以鉴定引入突变碱基的遗传稳定性。
对拯救病毒的第3、6和10代病毒进行前导蛋白基因的遗传稳定性分析，以拯救出的突变体病毒基因组为模板扩增出前导蛋白基因并进行序列测定，测序结果表明引入的突变碱基在***病毒突变体的传代中能够保持稳定遗传，而且在拯救病毒传代中未发其它碱基突变。
实施例4
拯救病毒的蚀斑表型和一步生长曲线测定
BHK-21或PK-15细胞分入6孔板中培养24h，PBS漂洗后，每孔加入200μL10×病毒稀释液，37℃温箱中培养1h，期间每10min轻轻摇晃1次，以免细胞变干。每孔加入2mL Overlay培养液，继续培养48h，吸去培养液，PBS漂洗细胞后加入2mL固定液(甲醇：丙酮＝1:1)，-20℃固定30min后弃掉固定液，加入结晶紫染色液染色30min，清水冲去染色液后即可观察拯救病毒的蚀斑形态。单层BHK-21或PK-15细胞接种1MOI的拯救病毒液，吸附1h后吸去病毒液，加入新鲜培养基，分别在3、6、9和20h收获样品，测定TCID50以确定不同时间点样品中的病毒滴度。
用蚀斑表型和一步生长曲线分析LbAUG突变对***病毒复制能力的影响。如图3A所示，在BHK-21细胞中，与亲本病毒相比，4株突变体***病毒在蚀斑表型和蚀斑大小上没有显示出巨大差异。在PK-15细胞中，与WT病毒相比，rV-O/TGG和rV-O/CTG的蚀斑略减小，但rV-O/ATC和rV-O/AAA形成的蚀斑明显减小。突变体***病毒的生长曲线显示(见图3B)，与亲本病毒相比，突变型***病毒在BHK-21细胞上的滴度无显著变化，该结果与蚀斑表型的结果一致。在PK-15细胞中，rV-O/ATC和rV-O/AAA病毒的滴度明显低于亲本病毒，而rV-O/TGG和rV-O/CTG的病毒滴度与亲本毒相似。
实施例5
拯救病毒的乳鼠致病力检测
4株突变体***病毒的10-4～10-8稀释液皮下接种1日龄乳鼠(200μl/只，5只/稀释度)，观察乳鼠的发病情况，至第7天，统计乳鼠的死亡数，按照Reed-Muench法计算LD50。
乳鼠致病力的结果显示，亲本毒的LD50为10-7.3，rV-O/ATC和rV-O/AAA的LD50为10-6.1和10-6.3/。与亲本毒相比，rV-O/ATC和rV-O/AAA对乳鼠的致病力明显减弱。而rV-O/TGG和rV-O/CTG的LD50分别为10-6.8和10-6.9，与亲本毒相比，rV-O/TGG和rV-O/CTG的乳鼠致病力稍低于亲本毒株。
综上所述，这些结果表明拯救出的突变体病毒rV-O/ATC和rV-O/AAA是致弱的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种***病毒致弱突变株及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgaacacga ctgactgttt tatcgctctg ttacacgttc tcagggagat taaagcactg 60
tttctgtcac gaacacaagg gaaatgggaa ttcacacttc acaacggtga aaagaaggtc 120
ttctacgcca gacccaacaa ccacgacaat tgctggttga acgccatcct ccaactgttc 180
aggtacgtcg acgaaccctt cttcgactgg gtctacgact cacctgagaa ccttactctt 240
gaggcgatca ggcgactcga agaaattact ggtcttgagc tacacgaggg tggaccaccc 300
gcccttgtcg tctggaacat taagcacttg ctctgcaccg gaatcggcac cgcttcgcgg 360
cctagcgagg tgtgtatggt ggacggtaca gacatgtgct tggccgactt ccacgctggt 420
atctttctga agggacaaga ccacgccgta ttcgcctgtg tcacctccga cgggtggtac 480
gcgattgacg acgaggattt ttacccgtgg acaccagacc cggctgacgt tttggttttt 540
gttccgtacg atcaagaacc acttaatgga gaatggaaag caaaggtcca gaagcggctt 600
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atgaacacga ctgactgttt tatcgctctg ttacacgttc tcagggagat taaagcactg 60
tttctgtcac gaacacaagg gaaaatcgaa ttcacacttc acaacggtga aaagaaggtc 120
ttctacgcca gacccaacaa ccacgacaat tgctggttga acgccatcct ccaactgttc 180
aggtacgtcg acgaaccctt cttcgactgg gtctacgact cacctgagaa ccttactctt 240
gaggcgatca ggcgactcga agaaattact ggtcttgagc tacacgaggg tggaccaccc 300
gcccttgtcg tctggaacat taagcacttg ctctgcaccg gaatcggcac cgcttcgcgg 360
cctagcgagg tgtgtatggt ggacggtaca gacatgtgct tggccgactt ccacgctggt 420
atctttctga agggacaaga ccacgccgta ttcgcctgtg tcacctccga cgggtggtac 480
gcgattgacg acgaggattt ttacccgtgg acaccagacc cggctgacgt tttggttttt 540
gttccgtacg atcaagaacc acttaatgga gaatggaaag caaaggtcca gaagcggctt 600
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atgaacacga ctgactgttt tatcgctctg ttacacgttc tcagggagat taaagcactg 60
tttctgtcac gaacacaagg gaaactggaa ttcacacttc acaacggtga aaagaaggtc 120
ttctacgcca gacccaacaa ccacgacaat tgctggttga acgccatcct ccaactgttc 180
aggtacgtcg acgaaccctt cttcgactgg gtctacgact cacctgagaa ccttactctt 240
gaggcgatca ggcgactcga agaaattact ggtcttgagc tacacgaggg tggaccaccc 300
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tttctgtcac gaacacaagg gaaaaaagaa ttcacacttc acaacggtga aaagaaggtc 120
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tcacgaacac aagggaaatg ggaattcaca cttcacaac 39
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aggtaacacg agacactc 18

Claims (10)

1.***病毒致弱突变株，其特征在于，在***病毒的前导蛋白基础上将LbAUG突变为ATC或AAA。
2.根据权利要求1所述***病毒致弱突变株，其特征在于，突变为ATC的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述***病毒致弱突变株，其特征在于，突变为AAA的前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述***病毒致弱突变株，其特征在于，所述前导蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求1～4任意一项所述***病毒致弱突变株，其特征在于，所述***病毒包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型***病毒。
6.根据权利要求5所述***病毒致弱突变株，其特征在于，O型***减毒病毒株是在OZK/93-08病毒株的基础上，将前导蛋白的LbAUG突变为ATC或AAA。
7.权利要求1～6任意一项所述***病毒致弱突变株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含***病毒的全长cDNA的重组质粒进行点突变，得到突变后的重组质粒，将突变后的重组质粒侵染细胞进行拯救，得到拯救的病毒株。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述点突变用引物为ATC-F/ATC-R引物对和AAA-F/AAA-R引物对；
所述ATC-F的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；
所述ATC-R的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；
所述AAA-F的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；
所述AAA-R的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述点突变所用的PCR扩增程序为94℃预变性5min后，98℃20min，68℃1min/1kb，35个循环后，72℃10min。
10.权利要求1～6任意一项所述***病毒致弱突变株在制备***疫苗中的应用。
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