CN107881153A

CN107881153A - 一种o型***耐酸疫苗毒株及其构建方法

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Publication number: CN107881153A
Application number: CN201711191274.3A
Authority: CN
Inventors: 李平花; 刘在新; 袁红; 卢曾军; 白兴文; 孙普; 陈应理; 包慧芳; 李冬; 曹轶梅; 付元芳; 马雪青; 张婧; 李坤
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明提供了一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法，属于兽药生物制品技术领域。所述O型***耐酸疫苗毒株rD86H，包括病毒结构蛋白VP2第86位天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)。所述耐酸毒株rD86H的结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明通过突变结构蛋白VP2中第86位D为H，从而使O型***疫苗毒株具有极高的酸稳定性。所述毒株在提高酸稳定性的同时，还提高了所述毒株的热稳定性，而且VP2第86位氨基酸的变化对亲本毒株的免疫原性、生长特性和复制能力几乎没有影响，因此本发明构建的耐酸突变株可作为优质疫苗种毒，提升FMDV灭活疫苗的免疫效力。

Description

一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法

技术领域

本发明属于兽药生物制品技术领域，具体涉及一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法。

背景技术

***(foot-and-mouth disease,FMD)是由***病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的一种主要危害猪、牛和羊等偶蹄动物的烈性传染病。该病以传播迅速、发病率高而著称，国际兽疫局(OIE)将其列为必报疫病，我国规定为一类动物传染病。

目前，全病毒灭活疫苗的免疫接种是控制FMD最有效措施。研究表明，146S FMDV粒子是灭活疫苗诱导机体产生中和抗体的最有效抗原。在所有的小RNA病毒科的病毒中，FMDV对外界环境的pH值极其敏感，尤其是O型FMDV。当环境pH值稍低于中性时，146S病毒粒子就解离为12s五聚体亚单位，从而导致灭活疫苗的有效抗原量降低，影响疫苗免疫保护效力。146S FMDV病毒粒子是由60分子的四种结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)组成的衣壳和RNA构成。其中结构蛋白上的各种氨基酸残基通过共价键、氢键、分子间力、二硫键、疏水力、非共价键等作用力缔合在一起形成病毒衣壳。当FMDV在低于中性的环境中生长时，造成氨基酸残基的主链和/或侧链所带的电荷不同，从而导致氨基酸之间的电荷作用力发生改变，从而影响五聚体内部或者五聚体之间的静电作用力，最终影响病毒衣壳的稳定性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法，使得到的疫苗毒株对酸性环境具有较好的耐受性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种O型***耐酸疫苗毒株rD86H，包括结构蛋白VP2D86H，所述结构蛋白VP2第86位由天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)；

所述结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了所述O型***耐酸疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)将含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列***到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123半长质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H；含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

2)将所述步骤1)得到的阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒用BglII/SpeI酶消化，将得到的5355bp的片段***到用所述BglII/SpeI酶消化的pOZKF-Z1234全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H；

3)将所述步骤2)得到的全长重组质粒pOFS/VP2D86H用NotⅠ线性化处理得到线性化DNA片段；

4)将所述步骤3)得到的线性化DNA片段转染至单层BSR/T7细胞中，转染后5h，向转染后的BSR/T7细胞中加入含8％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待转染72h后收获细胞；

5)将所述步骤4)得到的细胞经反复冻融后在BHK21细胞上传代培养，得到O型***耐酸疫苗毒株rD86H。

优选的，所述步骤1)中含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的制备方法包括以下步骤：

A.采用OZ1534(+)\OZ2152(-)和OZ2152(+)\OZ2988(-)引物对分别进行PCR扩增，得到A片段和B片段；所述OZ1534(+)引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；OZ2152(-)引物具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；OZ2152(+)具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；OZ2988(-)具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

B.以A片段和B片段为模板，用OZ1534(+)\OZ2988(-)引物进行融合PCR扩增，得到融合的AB片段为含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

优选的，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增程序：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

优选的，所述步骤4)中转染采用Lipofectamine^TM 2000介导转染。

优选的，所述步骤4)中BSR/T7细胞的生长时期为生长至单层覆盖面积达70％～80％。

优选的，所述步骤4)中培养的条件：培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％。

优选的，所述步骤5)中反复冻融的次数为2～3次。

本发明提供了一种O型***耐酸疫苗毒株，包括结构蛋白VP2D86H，所述结构蛋白VP2第86位由天冬氨酸(D)突变为组氨酸(H)；所述结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQID No.1所示的氨基酸序列。本发明通过突变结构蛋白VP2第86位氨基酸，由天冬氨酸突变为组氨酸，从而使O型***疫苗毒株具有极高的耐酸稳定性。所述毒株在提高耐酸性的同时，还保持了原有病毒的免疫原性，生长特性和复制能力。实验证明，携带VP2D86H不同代次的重组病毒均具有显著的耐酸性，在pH值5.0条件下处理30min后，重组病毒的感染滴度均大于2×10²PFU/mL，而作为对照的亲本病毒OZK/93-08的感染滴度均小于1×10¹PFU/mL；在pH值6.0条件下处理30min后，不同代次的重组病毒的感染滴度均大于3×10⁵PFU/mL，而亲本病毒OZK/93-08的感染滴度均小于3×10²PFU/mL，可以看出两个病毒酸处理前后病毒感染滴度差异显著。

同时，本发明提供的一种O型***耐酸疫苗毒株不仅具有显著的耐酸性，还具有显著的耐热性。实验结果表明，相比亲本病毒，携带VP2D86H的重组病毒在42℃条件下抗热失活的能力明显增加。这说明VP2D86H的变化即可增加病毒的酸稳定性，又增加病毒的热稳定性，这对于制备酸稳定性和热稳定性的灭活疫苗具有重要意义。

本发明提供了所述O型***耐酸疫苗毒株的构建方法，所述方法简单，步骤简便，重复性好，能够得到生物学性能优良的耐酸疫苗毒株。同时，采用本发明所述方法制备的重组病毒和亲本病毒具有相似的免疫原性，VP2第86位氨基酸的变化并没有影响FMDV的抗原性，适合发展具有耐酸特性的***疫苗，提升FMD灭活疫苗的质量。

附图说明

图1为实施例1中pOFS/VP2D86H质粒EcoR I酶切；

图2为实施例1中重组质粒的部分测序峰图，其中图2-A为pOFS/VP2D86H质粒的部分测序峰图；图2-B为pOZKF-Z1234质粒的部分测序峰图；

图3为实施例2中重组质粒pOFS/VP2D86H转染BSR/T7细胞60h后引起的CPE，图3-A为正常的BSR/T7细胞，图3-B为出现CPE的BSR/T7细胞；

图4为实施例3中间接免疫荧光检测重组病毒在BHK上的复制；

图5为实施例4中重组病毒的一步生长曲线；

图6为实施例5中FMDV在不同pH值条件下的感染性；

图7为实施例6中FMDV在42℃的热失活曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种O型***耐酸疫苗毒株rD86H，包括结构蛋白VP2D86H，所述结构蛋白VP2D86H具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

1)将含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列***到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123半长质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H；含编码所述结构蛋白VP2D86H基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

本发明将含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列***到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123半长质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H。

本发明中，所述含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的制备方法优选包括以下步骤：

A.采用OZ1534(+)\OZ2152(-)和OZ2152(+)\OZ2988(-)引物对半长质粒pOZK-Z123分别进行PCR扩增，得到A片段和B片段；所述步骤A中OZ1534(+)引物优选具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；OZ2152(-)引物优选具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；OZ2152(+)优选具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；OZ2988(-)优选具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

B.以A片段和B片段为模板，用OZ1534(+)\OZ2988(-)引物进行融合扩增，得到的融合片段AB片段为含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

本发明中，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增程序优选如下：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

本发明中，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增体系优选如下：

试剂	用量
		5×PrimeSTAR缓冲液	20.0μL
dNTP(2.5mM)	8.0μL
		模板1(或质粒)	1.0μL
(或)模板2	1.0μL
		上游引物	1.0μL
下游引物	1.0μL
		DNA聚合酶	1.0μL
ddH₂O	补充至100μL

得到A片段和B片段后，本发明优选进行纯化回收。本发明对所述纯化回收的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的纯化回收方法即可。本发明实施例中，所述纯化回收采用试剂盒法。

得到纯化回收的A片段和B片段后，本发明将所述为模板，用OZ1534(+)\OZ2988(-)引物进行融合PCR扩增，得到融合的片段AB为含编码所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

本发明对所述融合扩增的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的融合扩增的方法即可。

本发明中，所述融合扩增的扩增程序优选如下：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

本发明中，所述融合扩增后还优选包括纯化回收。本发明对所述纯化回收的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的纯化回收方法即可。本发明实施例中，所述纯化回收采用试剂盒法。

本发明中对用BamHI/BssHII限制性内切酶消化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的方案即可。所述将消化后的基因序列***到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123半长质粒中的***优选采用连接方法。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方法即可。

本发明中，所述半长质粒pOZK-Z123参考公开专利《用反向遗传操作拓展***疫苗株抗原谱及疫苗准备方法》获得，专利公布号CN101948811A。

得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒后，本发明将所述阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒用BglII/SpeI酶消化，将得到的5355bp的片段***到用所述BglII/SpeI酶消化的pOZKF-Z1234全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H。

本发明中对用BglII/SpeI酶消化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的BglII/SpeI消化方案即可。

所述将消化后的基因序列***到用所述BglII/SpeI消化的pOZK-Z1234全长质粒中的***优选采用连接方法。本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方法即可。

本发明中，所述pOZKF-Z1234参考公开专《利用反向遗传操作拓展***疫苗株抗原谱及疫苗准备方法》获得，专利公布号为CN101948811A。

得到的全长重组质粒pOFS/VP2D86H后，本发明将所述全长重组质粒pOFS/VP2D86H用NotI线性化处理得到线性化DNA片段。本发明对所述用NotI线性化处理的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用NotI线性化处理的方案即可。

得到的线性化DNA片段后，本发明将所述线性化DNA片段转染至单层BSR/T7细胞中，转染后5h，向转染后的BSR/T7细胞中加入含8％胎牛血清的DMEM培养基中培养，待转染72h后收获细胞。

本发明中，所述转染优选采用Lipofectamine ^TM 2000介导转染。

本发明中，所述BSR/T7细胞的生长时期优选为生长至单层覆盖面积达70％～80％，更优选为75％。

本发明中，所述培养的条件优选如下：培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％。

培养得到的细胞后，本发明将所述细胞经反复冻融后在BHK21细胞上传代培养，得到O型***耐酸疫苗毒株rD86H。

本发明中，所述反复冻融的次数优选为2～3次。

本发明对所述传代的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的传代方法即可。所述传代培养的代数优选为10～20代。

下面结合实施例对本发明提供的一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

含FMDV VP2D86H全长克隆的构建

根据OZK/93-08FMDV序列设计合成下列引物，构建FMDV结构蛋白VP2第86位天冬氨酸(D)变为组氨酸(H)的半长克隆。

表1构建FMDV VP2D86H所用引物

表2 PCR反应体系(100μL)

以实验室构建保存的FMDV疫苗株OZK/93-08的半长质粒pOZK-Z123(见公开专利用反向遗传操作拓展***疫苗株抗原谱及疫苗准备方法，专利公布号CN101948811A)为模板，以OZ1534(+)\OZ2152(-)，OZ2152(+)\OZ2988(-)为引物分别PCR扩增约655bp和855bp的A片段(A片段核苷酸序列见SEQ 7)和B片段(B片段核苷酸序列见SEQ ID No.8)，以纯化回收的A和B片段为模板，以OZ1534(+)\OZ2988(-)为引物融合扩增约1473bp的AB片段(AB片段核苷酸序列见SEQ 2)。A、B和A+B片段PCR扩增体系见表2，其扩增程序为：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。将AB片段纯化回收后用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，并将其***用同样酶消化的pOZK-Z123质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H。该质粒用BglII/SpeI酶消化，回收约5355bp的片段将其***用同样酶消化的pOZKF-Z1234(见公开专利用反向遗传操作拓展***疫苗株抗原谱及疫苗准备方法，专利公布号CN101948811A)全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H。全长重组质粒用EcoRI酶切鉴定，结果切出与预期相符的目的条带(见图1，其中1，DNA marker；2，pOFS/VP2D86H质粒EcoR I酶切)。全长质粒测序结果也表明，构建的重组质粒含预期的突变修饰(见图2)。

实施例2

重组病毒的拯救

BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213。

BSR/T7细胞(表达T7RNA聚合酶的BHK-21稳定细胞系)在文献《中国预防兽医学报》2016年第2期，袁红，李平花等“O型与A型***重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

QIAGEN PlasmidMidi Kits制备质粒pOFS/VP2D86H，用NotⅠ线化后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞生长至70％～80％时用LipofectamineTM2000介导转染(转染步骤按试剂盒操作手册进行)。转染后5h加入1ml含8％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃5％CO₂培养箱继续培养，每日观察致细胞病变(Cytopathic effect，CPE)。结果转染60h后细胞出现典型的细胞病变(cytopathogeniceffct,CPE)(见图3)。转染72h后收获细胞，反复冻融2～3次后，在BHK21上连续传10代，-70℃以下保存各代病毒备用。拯救的基因工程病毒命名为rD86H。

实施例3

间接免疫荧光

将收集的转染上清和亲本病毒OZK/93-08接种生长至70％～80％满的单层BHK-21细胞，孵育6h后用PBS缓冲液漂洗3次，用3.7％多聚甲醛室温固定20min，1XPBS缓冲液((50mMNaPO₄和140mM NaCl，pH值为7.4)洗涤3次，用50mmol/L氯化铵室温通透10min，PBS缓冲液洗涤3次，加抗***病毒非结构蛋白3A的单抗3A24在37℃条件下分别孵育1h，PBS漂洗3次，然后加FITC标记的山羊抗小鼠的抗体37℃孵育1h，PBS漂洗3次。然后每孔加入0.5ug/ml DAPI(PBS配制)染色10分钟，PBS洗三遍，去除多余的DAPI，置于共聚焦荧光显微镜下拍照。结果表明接种OZK/93-08和转染上清的BHK细胞用FMDV特异的3A单抗作用，均能看到可见的绿色荧光，而对照细胞用3A单抗作用看不到可见荧光。说明本发明拯救的重组病毒能够表达FMDV 3A蛋白(见图4)。文中提到的3A单抗3A24在文献《***病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定》，中国兽医科学2010,40(04):331-336中公开过，公众均可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

实施例4

RT-PCR和遗传稳定性分析

将重组病毒rD86H按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现95％细胞出现典型细胞病变(CPE)的时间，并对3、7、10代病毒RNA反转录后用OZ1490(+)/OZ3980，其中OZ1490(+)为GACAAGACCACGCCGTATT(SEQ ID No.9)，OZ3980(-)为TGCATCTGGTTGATGGTGTC(SEQ ID No.10)进行PCR以及序列测定，检测结构蛋白P1氨基酸的变化以及引入突变遗传稳定性。结果表明P4代以后重组病毒感染细胞出现95％CPE时间稳定在8-10h左右，与亲本病毒基本一致。重组病毒连续传至第10代时VP2D86H的突变仍可稳定遗传，而且在传代过程中结构蛋白没有引入其他氨基酸的变化。

表3重组病毒rD86H的遗传特性

病毒代次	D86H的变异	P1氨基酸的变化	95％细胞病变时间
				P3	-	-	11h
P7	-	-	9h
				P10	-	-	8h

注：“-”表示无变化。

实施例5

重组病毒的一步生长曲线

将第六代重组病毒rD86H和亲本病毒分别做10倍系列稀释，用微量稀释法滴定两个病毒的效价。然后将第六代重组病毒和亲本病毒以1个MOI的病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用1XMEM洗2次后，加5ml MEM培养基置于37℃CO₂培养箱继续培养。病毒接种细胞后4h、8h、12h、16h、20h收取样品，在BHK-21单层细胞上(96孔板)滴定病毒效价(实验进行2次重复)，具体步骤如下：(1)用MEM 10倍系列稀释各时段收集的病毒；(2)将长满的BHK-21细胞用胰酶消化后稀释到一定浓度，然后用排枪吸取100μL细胞液加入96孔板中；(3)在已经加入细胞的96孔板中分别加入10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的100μL病毒液8孔，每个稀释度重复3排；(4)将加入细胞和病毒的96孔板放入37℃细胞培养箱中继续培养，48h后观察并记录每个稀释度的细胞50％出现CPE的孔数；(5)根据统计结果，用Reed-Muench法计算每个样品的TCID50(50％tissue culture infectivedose)，绘制出病毒的一步生长曲线。结果表明：拯救病毒rD86H与疫苗毒株OZK/93-08有相似生长特性，VP2D86H的引入几乎没有影响重组病毒在BHK-21细胞上的复制能力(见图5)。

实施例6

酸诱导的失活试验

取10μL2×10⁶PFU的p4、p7和p10的rD86H重组病毒和与疫苗毒OZK/93-08分别与300μL不同pH值(5.0、6.0、和7.4)的PBS(50mmol/LNaPO₄和140mmol/LNaCl)混合均匀，室温放置30min后加入100μL的1M Tris溶液(pH为7.6)进行中和；然后使用蚀斑法测定每个样品酸处理后的病毒滴度(实验重复2次)。具体步骤：(1)将不同时间处理后的病毒样品分别做10系列稀释；(2)将长满的单层BHK-21细胞(6孔板)用1xPBS(pH值为7.4)洗细胞两次，将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200ul/孔，每个稀释度重复3孔)置于37℃CO₂培养箱孵育1小时，每10min摇动一次；(3)病毒吸附1h后每孔加入2mL黄芪胶混合液(一份2X MEM，一份1.2％黄芪胶，1％血清)，37℃CO₂培养箱继续孵育48h；(4)48h用1×PBS洗细胞2次，每孔加入2mL预冷的固定液(50％丙酮+50％甲醇)，-20℃固定30min；(5)弃去固定液，用PBS将细胞清洗2次，加入结晶紫，室温染色1h，(6)倒去染色液，用清水冲洗六孔板，干燥后计数每个病毒不同稀释毒长斑的个数，并计算病毒的PFU/mL。

结果表明携带VP2D86H不同代次的重组病毒均具有显著的耐酸性，在pH值5.0条件下处理30min后，重组病毒的感染滴度均大于2×10²PFU/mL，而作为对照的亲本病毒OZK/93-08的感染滴度均小于1×10PFU/mL；在pH值6.0条件下处理30min后，不同代次的重组病毒的感染滴度均大于3×10⁵PFU/mL，而亲本病毒OZK/93-08的感染滴度均小于3×10²PFU/mL，从这些结果可以看出，两个病毒酸处理前后病毒感染滴度差异明显(见图6)，而两个病毒在pH值7.4中性条件下处理后两个病毒滴度没有发生明显变化，这些结果说明携带VP2D86H的FMD重组病毒具有显著的耐酸性。

实施例7

热诱导的失活试验

研究表明FMDV不仅对酸敏感，而且对热也比较敏感。为了分析构建的重组病毒对温度的敏感性，本发明将等量的重组病毒和亲本病毒在42℃条件下分别作用20min、40min和60min，然后用噬斑定量的方法(如上述方案)分别测定不同时间处理后剩余感染性病毒粒子的含量。实验结果表明，相比亲本病毒，携带VP2D86H的重组病毒在42℃条件下抗热失活的能力明显增加(见图7)。这说明VP2D86H的变化即可增加病毒的酸稳定性，又增加病毒的热稳定性，这对于制备酸稳定性和热稳定性的灭活疫苗具有重要意义。

实施例8

重组病毒的抗原性分析

FMDV结构蛋白上含有不同的抗原位点，决定了FMDV的抗原特性。本研究中决定疫苗毒株耐酸表型的关键氨基酸位于O型FMDV的抗原位点之外，因此我们理论上推测VP2D86H的变化不会影响疫苗毒株的抗原特性。为了证实这一推测，两个毒株进行疫苗免疫实验。

rD86H和OZK/93-08病毒在BHK-21细胞上大量增殖培养，并按照常规方法201佐剂乳化后制备灭活疫苗。2-4月龄豚鼠20只分为两组，一组接种重组病毒灭活疫苗，一组接种亲本病毒灭活疫苗，每组10只，剂量为1ug/只。接种后每间隔1周采血，按照微量细胞中和实验法测定血清中和抗体效价。检测的实验结果如表4所示，结果表明重组病毒和亲本病毒具有相似的免疫原性，VP2D86H氨基酸的变化并没有影响FMDV的抗原性，适合发展具有耐酸特性的***疫苗，提升FMD灭活疫苗的质量。

表4 rD86H和OZK/93-08灭活疫苗免疫豚鼠诱导的中和抗体

注：中和抗体效价为10只动物的平均值

综上所述，本研究发明构建的含结构蛋白VP2D86H的FMDV不仅具有耐酸稳定性，而且具有一定的热稳定性，适合做既耐酸又耐热的疫苗候选毒株，提升灭活疫苗的质量，为***的防控提供有力的技术支撑。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种O型***耐酸疫苗毒株及其构建方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr

1 5 10 15

Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val

20 25 30

Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly Pro Asn Thr

35 40 45

Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Phe Lys Thr

50 55 60

His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe Gly Arg Cys His Met

65 70 75 80

Leu Glu Leu Pro Thr His His Lys Gly Val Tyr Gly Ser Leu Thr Asp

85 90 95

Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Thr Ala Val

100 105 110

Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu

115 120 125

Leu Cys Ser Ile Asn Lys Arg Glu Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro

130 135 140

His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val

145 150 155 160

Pro Tyr Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Val His Lys Pro

165 170 175

Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu Thr Val Asn Asn Glu

180 185 190

Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Asn Val

195 200 205

Tyr Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu

210 215

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacgcgattg acgacgagga tttttacccg tggacaccag acccggctga cgttttggtt 60

tttgttccgt acgatcaaga accacttaat ggagaatgga aagcaaaggt ccagaagcgg 120

cttaagggcg ccgggcaatc cagcccgacg accgggtcac agaaccaatc aggcaacact 180

ggaagcatca ttaacaacta ctacatgcag caataccaga actccatgga cacacagctt 240

ggtgacaacg ccattagcgg aggatccaac gagggttcta cggataccac ctccacccac 300

acgaacaaca cccagaacaa cgactggttt tcaaaactgg ccaactccgc tctcagcggt 360

ctcttcggtg ctcttctcgc cgacaaaaag acagaggaaa ctaccctcct cgaggaccgc 420

attctcacca cccgcaacgg acacacgacc tcgacaaccc agtcgagcgt cggggtgacg 480

tacgggtatg caacagctga ggacttcgtg agcgggccca acacctctgg tcttgagacc 540

agggttgtcc aggccgaacg gttcttcaaa acccacttgt tcgactgggt caccagtgac 600

ccgtttggac ggtgccacat gttggagctc ccgactcacc acaaaggcgt ctacggcagc 660

ctaaccgact cgtacgcgta tatgaggaac ggttgggacg ttgaagtcac cgcggtggga 720

aaccagttca acggaggctg cttgttggtg gcaatggtac cagagctttg ttccatcaac 780

aagagagagc tgtaccagct cacacttttc ccccaccagt tcattaaccc acggacgaac 840

atgacggcac acatcactgt gccctacgtt ggcgtcaaca ggtacgacca atacaaggtg 900

cataaaccct ggacccttgt tgtcatggtc gtggccccct tgacggtcaa caatgagggt 960

gctccgcaaa tcaaggtgta tgccaacatc gcccccacca acgtttacgt tgcgggtgaa 1020

ttcccttcca aggaggggat cttccccgtg gcatgcagcg acggttacgg cggtttggtg 1080

accacggacc caaagacggc ggaccccgtg tacgggaaag tgttcaaccc cccccgtaac 1140

ttgttgccag ggcggtttac aaacctcctt gatgtggccg aggcgtgtcc cacgttccta 1200

cacttcgaag gtgacgtacc gtacgtgacc acgaagacgg actcagacag ggtgttggcc 1260

caattcgacc tgtctctggc agcaaagcac atgtcgaaca ctttcctcgc gggtcttgcc 1320

cagtattaca cacagtacag cggcaccatc aacctacact tcatgttcac agggcccacc 1380

gatgcgaagg cgcgctacat gattgcgtat gcccctcctg gcatggaacc gccgaaaacg 1440

cctgaggccg ccgcacactg cattcacgct gag 1473

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacgcgattg acgacgagga 20

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtagacgcc tttgtggtga gtcgggagct ccaacat 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgttggagc tcccgactca ccacaaaggc gtctacg 37

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcagcgtga atgcagtgtg 20

<210> 7

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacgcgattg acgacgagga tttttacccg tggacaccag acccggctga cgttttggtt 60

tttgttccgt acgatcaaga accacttaat ggagaatgga aagcaaaggt ccagaagcgg 120

cttaagggcg ccgggcaatc cagcccgacg accgggtcac agaaccaatc aggcaacact 180

ggaagcatca ttaacaacta ctacatgcag caataccaga actccatgga cacacagctt 240

ggtgacaacg ccattagcgg aggctccaac gagggttcta cggataccac ctccacccac 300

acgaacaaca cccagaacaa cgactggttt tcaaaactgg ccaactccgc tctcagcggt 360

ctcttcggtg ctcttctcgc cgacaaaaag acagaggaaa ctaccctcct cgaggaccgc 420

attctcacca cccgcaacgg acacacgacc tcgacaaccc agtcgagcgt cggggtgacg 480

tacgggtatg caacagctga ggacttcgtg agcgggccca acacctctgg tcttgagacc 540

agggttgtcc aggccgaacg gttcttcaaa acccacttgt tcgactgggt caccagtgac 600

ccgtttggac ggtgccacat gttggagctc ccgactcacc acaaaggcgt ctacg 655

<210> 8

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgttggagc tcccgactca ccacaaaggc gtctacggca gcctaaccga ctcgtacgcg 60

tatatgagga acggttggga cgttgaagtc accgcggtgg gaaaccagtt caacggaggc 120

tgcttgttgg tggcaatggt accagagctt tgttccatca acaagagaga gctgtaccag 180

ctcacacttt tcccccacca gttcattaac ccacggacga acatgacggc acacatcact 240

gtgccctacg ttggcgtcaa caggtacgac caatacaagg tgcataaacc ctggaccctt 300

gttgtcatgg tcgtggcccc cttgacggtc aacaatgagg gtgctccgca aatcaaggtg 360

tatgccaaca tcgcccccac caacgtttac gttgcgggtg aattcccttc caaggagggg 420

atcttccccg tggcatgcag cgacggttac ggcggtttgg tgaccacgga cccaaagacg 480

gcggaccccg tgtacgggaa agtgttcaac cccccccgta acttgttgcc agggcggttt 540

acaaacctcc ttgatgtggc cgaggcgtgt cccacgttcc tacacttcga aggtgacgta 600

ccgtacgtga ccacgaagac ggactcagac agggtgttgg cccaattcga cctgtctctg 660

gcagcaaagc acatgtcgaa cactttcctc gcgggtcttg cccagtatta cacacagtac 720

agcggcacca tcaacctaca cttcatgttc acagggccca ccgatgcgaa ggcgcgctac 780

atgattgcgt atgcccctcc tggcatggaa ccgccgaaaa cgcctgaggc cgccgcacac 840

tgcattcacg ctgagt 856

Claims

1.一种O型***耐酸疫苗毒株rD86H，包括结构蛋白VP2D86H；

2.权利要求1所述O型***耐酸疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：

1)将含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段用BamHI/BssHII限制性内切酶消化，将消化后的基因序列***到用所述BamHI/BssHII消化的pOZK-Z123质粒中，得到阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H；所述含编码所述结构蛋白VP2D86H基因片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

2)将所述步骤1)得到的阳性重组质粒pOZK-Z123VP2D86H质粒用BglII/SpeI酶消化，将所述酶消化得到的5355bp的片段***到用所述BglII/SpeI酶消化的pOZKF-Z1234全长质粒中，得到全长重组质粒pOFS/VP2D86H；

3)将所述步骤2)得到的全长重组质粒pOFS/VP2D86H用NotⅠ线性化处理，得到线性化DNA片段；

4)将所述步骤3)得到的线性化DNA片段转染至单层BSR/T7细胞中，转染后5h，向转染后的BSR/T7细胞中加入含8％胎牛血清的DMEM培养基培养，待转染72h后收获细胞；

5)将所述步骤4)得到的细胞经反复冻融后在BHK-21细胞上传代培养，得到O型***耐酸疫苗毒株rD86H。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段的制备方法包括以下步骤：

A.采用OZ1534(+)\OZ2152(-)和OZ2152(+)\OZ2988(-)引物对半长质粒pOZK-Z123分别进行PCR扩增，得到A片段和B片段；OZ1534(+)引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；OZ2152(-)引物具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；OZ2152(+)具有如序列表中SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；OZ2988(-)具有如序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

B.以A片段和B片段为模板，用OZ1534(+)\OZ2988(-)引物进行融合PCR扩增，得到融合的AB片段为含编码权利要求1所述结构蛋白VP2D86H的基因片段。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A中PCR扩增或步骤B中融合扩增的扩增程序：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸8min。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中转染采用Lipofectamine^TM2000介导转染。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中BSR/T7细胞的生长时期为生长至单层覆盖面积达70％～80％。

7.根据权利要求2、5或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中培养的条件：培养温度为37℃，CO₂体积浓度为5％。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中反复冻融的次数为2～3次。