CN111944056A - 凋亡蛋白融合型抗her-2单链抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

凋亡蛋白融合型抗her-2单链抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了凋亡蛋白融合型抗HER‑2单链抗体及其制备方法和应用，凋亡蛋白融合型抗HER‑2单链抗体，由抗HER‑2单链抗体以不同串联方式与凋亡蛋白偶联而成，凋亡蛋白为细胞色素C或DNA片段化因子40，具体可与抗HER‑2单链抗体偶联成DFF40‑scFv融合型单链抗体、nCytc(串联)‑scFv融合型单链抗体。凋亡蛋白融合型抗HER‑2单链抗体通过凋亡蛋白的cDNA序列***scFv上游并克隆入表达载体中构建重组质粒，重组质粒转入细胞，诱导表达凋亡蛋白融合型抗HER‑2单链抗体，制备方法易于构建和表达，构建的凋亡蛋白融合型抗HER‑2单链抗体能够特异性靶向HER‑2高表达的恶性肿瘤并介导癌细胞凋亡，可用于制备靶向治疗HER‑2高表达癌症的药物。

Description

凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。2018年3月23日，国家癌症中心发布的最新数据显示，全国女性乳腺癌新发病例占女性恶性肿瘤发病16.51％，位居女性恶性肿瘤发病第1位。HER-2(HumanEpidermal Growth Factor receptor 2，又称为neu，ErBb-2，HER-2)为表皮生长因子受体超家族成员，是人类肿瘤中发生改变频率最高的癌基因之一，其基因表达水平和基因拷贝数目在几种人类肿瘤细胞中都有显著升高，特别是在乳腺癌、卵巢癌和胃癌中升高更为显著。研究表明30％以上的人类肿瘤中存在HER-2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和***癌等)，HER-2过度表达的乳腺癌患者病情进展迅速，化疗缓解期短，内分泌治疗效果差，无病生存和总生存率低。HER-2基因的过表达不仅与肿瘤的发生发展相关，还是肿瘤靶向治疗药物选择的一个重要靶点。
目前临床批准的绝大部分HER-2为靶点的药物都集中在乳腺癌，比如拉帕替尼(泰立沙)、曲妥珠单抗(赫赛汀)、T-DM1、帕妥珠单抗。FDA在1998年批准曲妥珠单抗(Trastuzumab)用于有HER-2过量表达的乳腺癌的治疗。曲妥珠单抗中文商品名叫“赫赛汀”，是抗HER-2的单克隆抗体，它通过将自己附着在HER-2上来阻止人体表皮生长因子在HER-2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，赫赛汀还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、双特异性抗体等，其中单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)是由抗体重链和轻链可变区片段用一条弹性短肽连接而成的小分子抗体片段。与完整抗体分子相比，单链抗体具有以下特点：(1)不含有抗体分子的恒定区片段，因而免疫原性弱，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体；(2)对相应抗原具有较高的亲和力和特异性；(3)相对分子质量小，穿透力较强，在体内停留的时间较短，适用于疾病的免疫显像诊断和导向治疗；(4)由于相对分子质量较小，不需要进行糖基化修饰即可形成有功能的抗体分子，因而可以在原核表达***中进行表达并容易获得。已有研究成功制备抗HER-2单链抗体用于肿瘤的靶向，然而，单链抗体稳定性差、易聚集，半衰期短效果不显著。
单链抗体scFv也被用作药物递送平台递送效应分子杀伤靶细胞，但很多现有免疫毒素的杀伤功能域主要来源于植物或细菌毒素，分子量太大，组织渗透性低，且具有很高的免疫原性和强烈的副作用，限制了其临床应用。为了解决这些问题，据报道，一系列内源性细胞凋亡相关分子可以替代外源性毒素，经过大量文献研究发现，细胞色素C(Cytc)和DNA片段化因子40(DFF40)在细胞凋亡途径中发挥重要作用，Cytc释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡；DFF40在凋亡细胞中，经caspase-3激活后，这种蛋白质可裂解核小体间DNA，导致特征性的DNA梯状，由于DFF40是凋亡级联中的下游组分，其表达和活化将导致不可逆的DNA损伤，导致明确的细胞死亡。
基于上述研究，本发明将抗HER-2单链抗体scFv与凋亡蛋白DFF40或nCytc(n≥1)偶联，通过scFv将DFF40或nCytc递送至靶细胞，经细胞内化后通过激活内源性凋亡途径抑制肿瘤细胞活性，大大降低免疫原性和毒副作用。通过比较不同蛋白构建体的活性差异，以期寻求抗肿瘤活性最好且副作用最小的单链抗体免疫凋亡制剂，有望在乳腺癌的诊断和治疗方面发挥重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体及其制备方法和应用。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，由抗HER-2单链抗体以不同串联方式与凋亡蛋白偶联而成，抗HER-2单链抗体包括序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区VH和序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区VL，重链可变区和轻链可变区通过序列如SEQ ID NO.3所示的柔性肽(G4S)3连接，重链可变区VH上游含有6×his标签，抗HER-2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码抗HER-2单链抗体的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示，凋亡蛋白为细胞色素C串联集合体(nCytc，n≥1)或DNA片段化因子40(DFF40)。
进一步地，所述细胞色素C的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述细胞色素C的cDNA序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述DNA片段化因子40的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述DNA片段化因子40的cDNA序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为Cytc-scFv融合型单链抗体，由所述的抗HER-2单链抗体与一个权利要求3所述的细胞色素C偶联而成，所述细胞色素C连接在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，所述Cytc-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为nCytc-scFv融合型单链抗体，由所述的抗HER-2单链抗体与细胞色素C串联集合体偶联而成，且细胞色素C串联集合体串联在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，细胞色素C串联集合体由若干个细胞色素C通过连接肽连接，所述连接肽为Caspase-3酶切位点DEVD，所述DEVD的cDNA序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为DFF40-scFv融合型单链抗体，由所述的抗HER-2单链抗体与权利要求4所述的DNA片段化因子40连接而成，所述DNA片段化因子40连接在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，所述DFF40-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还提供了上述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成如SEQ ID NO.5所示的编码抗HER-2单链抗体的cDNA序列和编码凋亡蛋白的cDNA序列；
(2)构建重组质粒：将步骤(1)所得的编码抗HER-2单链抗体的cDNA序列和编码凋亡蛋白的cDNA序列分别连入pET-32a(+)表达载体中，构建成重组质粒；
(3)将步骤(2)所得重组质粒转化DH5α感受态细胞，筛选测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体。
进一步地，步骤(2)中，采用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ酶切如SEQ ID NO.5所示的抗HER-2单链抗体的cDNA片段与pET-32a(+)表达载体的cDNA片段，然后将抗HER-2单链抗体的cDNA片段连接在pET-32a(+)表达载体的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间；凋亡蛋白为细胞色素C或DNA片段化因子40，采用限制性内切酶BglⅡ和NcoⅠ酶切pET-32a(+)表达载体的cDNA片段与如SEQ ID NO.7所示的Cytc的cDNA序列或如SEQ ID NO.9所示的DFF40的cDNA序列，然后将Cytc的cDNA序列或DFF40的cDNA序列连接在pET-32a(+)表达载体的BglⅡ和NcoⅠ酶切位点之间，其中，***编码抗HER-2单链抗体的cDNA片段与***编码凋亡蛋白的cDNA片段时在pET-32a(+)表达载体上采用的NcoⅠ酶切位点为同一酶切位点。
进一步地，当凋亡蛋白为细胞色素C且细胞色素C的个数大于一个时，各个细胞色素C之间通过如SEQ ID NO.11所示的Caspase-3酶切位点DEVD串联连接。
进一步地，还包括步骤(4)采用Ni-NTA柱纯化步骤(4)所得的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体。
本发明还提供了上述抗HER-2单链抗体或凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体在制备靶向治疗HER-2高表达癌症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：在临床前研究中，许多重组免疫毒素与肿瘤细胞相关的不同细胞表面抗原相结合，通过毒素介导的翻译抑制作用导致细胞死亡，是有效的抗癌药物。但是，限制这些分子在临床上治疗实体癌的有效性的原因主要包括低特异性，高毒性。免疫毒素中的毒素分子主要是植物或细菌毒素，例如假单胞菌外毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、白喉毒素、海葵溶细胞素、白树素等等，具有可能导致胃肠道毒性和肝肾毒性等副作用，此外它们分子量大、渗透效率低，免疫原性高，半衰期短等。本发明以HER-2高表达型乳腺癌表面HER-2抗原为分子靶标，利用单链抗体的高特异性和低免疫原性等优点，以抗HER-2单链抗体scFv为药物递送平台，使用内源性细胞凋亡相关分子来替代外源性毒素，通过激活内源性凋亡途径来避免毒副作用的产生；将单链抗体的靶向性与凋亡蛋白的促凋亡活性相结合，设计构建三种凋亡蛋白融合型单链抗体：DFF40-scFv、Cytc-scFv以及nCytc-scFv(n>1，以实施例n＝3为例)，体内外实验均证明凋亡蛋白融合型单链抗体能够特异性靶向HER-2过表达乳腺癌并介导细胞凋亡，而对HER-2阴性乳腺癌细胞没有毒性，且三种融合型单链抗体的活性差异为DFF40-scFv>3Cytc-scFv>Cytc-scFv。据我们所知，这是将凋亡蛋白DFF40与单链抗体结合用于治疗HER-2阳性乳腺癌的第一项研究，更重要的是，引入凋亡执行蛋白Caspase3的特异性切割位点DEVD的凋亡蛋白融合型单链抗体蛋白构建体(nCytc-scFv)，通过酶切反应释放更多的效应分子，提高了抗肿瘤活性，是对通过内源性凋亡途径***的策略的重要补充。nCytc-scFv作为本研究首次发现的较理想的一种免疫凋亡分子，其包含一个巧妙的良性循环，在扩大抗肿瘤活性的同时将肿瘤杀伤限制于细胞凋亡，符合高效低毒的治疗理念，是更新颖和有效的治疗途径。总之，本发明将促凋亡蛋白与单链抗体融合表达用于癌症的治疗可实现靶向性与抗肿瘤活性的良好结合，为癌症的靶向免疫治疗及抗体药物的研发提供新的思路。
附图说明
图1为单链抗体蛋白二维结构示意图；
图2为实施例1和实施例2构建的重组质粒pET-32a(+)-scFv、pET-32a(+)-DFF40-scFv、pET-32a(+)-Cytc-scFv和pET-32a(+)-3Cytc-scFv的质粒图谱图；
图3是实施例3的scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白表达纯化鉴定结果，其中：A为纯化的scFv、DFF40-scFv、Cytc–scFv和3Cytc–scFv蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳结果，M：蛋白Marker；B为纯化的scFv、DFF40-scFv、Cytc–scFv和3Cytc–scFv蛋白的WesternBlot鉴定结果图，一抗使用anti-6His tag，且B的Marker及泳道设置与A所用相同；
图4为实施例4的四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别与SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7共孵育后的免疫荧光图像，其中，绿色为FITC荧光二抗标记的单链抗体蛋白(图中亮色外边)，蓝色为DAPI染核，比例尺＝25μm；
图5为实施例5的四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)对HER-2过表达型乳腺癌细胞活力检测结果，其中：A为不同浓度的单链抗体蛋白对SK-BR-3的细胞毒性数据，B为不同浓度的单链抗体蛋白对MDA-MB-231的细胞毒性数据，C为不同浓度的单链抗体蛋白对MCF-7的细胞毒性数据,n＝3，与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001,ns：不显著；D为四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别与MDA-MB-231及DFF40-scFv分别与MDA-MB-231和MCF-7共孵育48h后通过结晶紫染色结果；
图6为实施例6的scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体对HER-2过表达型乳腺癌细胞诱导后Caspase3蛋白活性检测结果，其中：A为SK-BR-3分别与四种抗体蛋白共同作用后Caspase3活性检测结果，B和C分别为MDA-MB-231和MCF-7分别与四种抗体蛋白共同作用后Caspase3活性检测结果，n＝5，*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001,ns：不显著；
图7为实施例7的免疫印迹法分析凋亡相关蛋白表达量变化结果图，其中：A为四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)作用于SK-BR-3细胞后，提取总蛋白，Bcl-2和Bax的含量变化检测结果，α-tubulin作为内参，B为A中蛋白条带的ImageLab定量结果，各柱形图中下段代表Bcl-2，上段代表Bax，两者总量为1；
图8为实施例8的Hoechst核染色及细胞形态变化结果图，其中：A为四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别与SK-BR-3细胞共孵育48h后使用倒置荧光显微镜观察细胞核固缩情况结果图，蓝色：Hoechst；白色：固缩的核(图中亮白色部分)；B为活细胞长时间动态影像成像分析仪观测的四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别与SK-BR-3细胞共孵育0h、24h、48h后的细胞图像；
图9为实施例8的四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)与三种乳腺癌细胞(SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7)共孵育48h后的细胞凋亡率统计结果，其中，n＝3，与对照组(MDA-MB-231、MCF-7)相比，*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001,ns：不显著；
图10为实施例9的流式细胞术检测融合蛋白诱导的细胞凋亡实验图谱，其中：A为四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别与SK-BR-3细胞共孵育48h，Annexin V-FITC/PI双染后避光孵育10min后立即用流式细胞仪检测的细胞凋亡结果，B～D：对于A中的凋亡数据的量化分析，n＝3，以scFv作用组为对照，*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001，ns：不显著；
图11为实施例10的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体的体内活性验证结果，其中：A为四种单链抗体蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)对裸鼠异种移植模型进行蛋白药物治疗后30天内肿瘤体积变化图，每3天测量一次并计算肿瘤体积，B为抗体蛋白药物治疗结束后，从scFv治疗组、Cytc–scFv治疗组、3Cytc–scFv治疗组及DFF40-scFv治疗组的裸鼠异种移植模型中分离出的肿瘤组织拍摄图像；C为抗体蛋白药物治疗结束后，从scFv治疗组、Cytc–scFv治疗组、3Cytc–scFv治疗组及DFF40-scFv治疗组的裸鼠异种移植模型中分离出的肿瘤组织质量结果，以scFv治疗组为对照，*P<0.05,**P<0.01,***p<0.001，ns：不显著。
图12为实施例10的肿瘤组织石蜡切片Tunel染色结果，其中，凋亡细胞显示为深棕色(图中深色点)。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：pET-32a(+)-scFv重组质粒的构建
一、抗HER-2单链抗体scFv同源重组基因片段的获得
1.1重链可变区VH、轻链可变区VL和柔性肽(G4S)3序列的获取
通过NCBI和Uniprot数据库查找及文献检索比对曲妥珠单抗单链抗体序列以及linker序列，确定如SEQ ID NO.1所示的重链可变区VH的氨基酸序列、如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区VL的氨基酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的柔性肽(G4S)3的氨基酸序列；
重链可变区VH序列(SEQ ID NO.1)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS；
轻链可变区VL序列(SEQ ID NO.2)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR；
柔性肽(G4S)3序列(SEQ ID NO.3)：GGGGSGGGGSGGGGS；
抗HER-2单链抗体的氨基酸序列(VH-linker-VL)如SEQ ID NO.4所示(抗HER-2单链抗体scFv的二维结构如图1所示，在上述重链可变区VH上游含有6×his标签用于镍柱纯化)，编码所述抗HER-2单链抗体scFv的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示；
SEQ ID NO.4具体为：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR，下划线部分为柔性肽(G4S)3序列；
SEQ ID NO.5具体为：5'-GAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTTTCAACATCAAAGACACCTACATCCACTGGGTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTCGTATCTACCCGACCAACGGTTACACCCGTTACGCTGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCTGCTGACACCTCTAAAAACACCGCTTACCTGCAGATGAACTCTCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCTCTCGTTGGGGTGGTGACGGTTTCTACGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCTTCTGGGGGCGGGGGCTCTGGGGGCGGGGGCTCTGGGGGCGGGGGCTCTGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCGCGAGCTTTCTGTATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCCGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGCATTATACCACCCCGCCGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGC-3'；
1.2聚合酶链式反应(PCR)获取用于同源重组的scFv基因
根据scFv的cDNA序列以及pET-32a(+)载体上的序列，设计并合成与pET-32a(+)载体同源重组的scFv基因序列的PCR引物scFv-F(如SEQ ID NO.14所示)和scFv-R(如SEQ IDNO.15所示)，通过化学合成方法合成含有酶切位点NcoⅠ和BamHⅠ及补充碱基的核苷酸片段，随后通过引物scFv-F和scFv-R扩增scFv同源重组序列
scFv-F(SEQ ID NO.14)：5’-CGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGG-3’，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点NcoⅠ；
scFv-R(SEQ ID NO.15)：5’-CGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGCGTTTAATTTCCACTTTGGTGC-3’，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点BamHⅠ；
Figure BDA0002585061130000081
PCR产物即为两端含有载体同源序列及酶切位点的单链抗体scFv基因片断，用于与酶切后的pET-32a(+)载体进行同源重组。
二、pET-32a(+)-scFv重组质粒的构建
将胶回收的scFv同源重组基因片段和双酶切(NcoⅠ和BamHⅠ)后的pET-32a(+)质粒通过同源重组进行连接，将连接产物转化到E.coli DH5α，并在菌液扩大培养后提取重组质粒pET-32a(+)-scFv送上海生工生物工程有限公司进行测序，结果显示，阳性重组质粒pET-32a(+)-scFv中***的序列与实验设计一致，从而成功构建得到重组质粒pET-32a(+)-scFv(如图2A所示)。
实施例2：pET-32a(+)-Cytc-scFv、pET-32a(+)-3Cytc-scFv和pET-32a(+)-DFF40-scFv重组质粒的构建
一、实验材料
1、PCR所需引物
通过NCBI和Uniprot数据库查找确定如SEQ ID NO.6所示的细胞色素C(Cytc)氨基酸序列和如SEQ ID NO.7所示的编码所述细胞色素C的cDNA序列；通过NCBI和Uniprot数据库查找确定如SEQ ID NO.8所示的DNA片段化因子40(DFF40)氨基酸序列和如SEQ ID NO.9所示的编码所述DFF40的cDNA序列；根据Cytc和DFF40的cDNA序列以及pET-32a(+)载体上的序列，设计并合成扩增上述Cytc的用于与pET-32a(+)载体同源重组的基因序列的PCR引物Cytc-F和Cytc-R；以及扩增DFF40的用于与载体同源重组的基因序列的PCR引物DFF40-F和DFF40-R，具体序列信息为：
细胞色素C的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：MGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGYSYTAANKNKGIIWGEDTLMEYLENPKKYIPGTKMIFVGIKKKEERADLIAYLKKATNE；
细胞色素C的cDNA序列(SEQ ID NO.7)：5'-AGATCTCATGGGTGATGTTGAGAAAGGCAAGAAGATTTTTATTATGAAGTGTTCCCAGTGCCACACCGTTGAAAAGGGAGGCAAGCACAAGACTGGGCCAAATCTCCACGGTCTCTTTGGGCGGAAGACAGGTCAGGCCCCTGGATACTCTTACACAGCCGCCAATAAGAACAAAGGCATCATCTGGGGAGAGGATACACTGATGGAGTATTTGGAGAATCCCAAGAAGTACATCCCTGGAACAAAAATGATCTTTGTCGGCATTAAGAAGAAGGAAGAAAGGGCAGACTTAATAGCTTATCTCAAAAAAGCTACTAATGAGACCATGG-3'；
扩增Cytc同源重组序列的正向引物Cytc-F序列(SEQ ID NO.16)：5'-CCAGCACATG GACAGCCCAGATCTCATGGGTGATGTTGAGAAAGGC-3'，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点BglⅡ；
扩增Cytc同源重组序列的反向引物Cytc-R序列(SEQ ID NO.17)：5'-CAACCAGCTG AACTTCAGCCATGGTCTCATTAGTAGCTTTTTTGAGATAAGC-3'，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点NcoⅠ；
DFF40的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：MLQKPKSVKLRALRSPRKFGVAGRSCQEVLRKGCLRFQLPERGSRLCLYEDGTELTEDYFPSVPDNAELVLLTLGQAWQGYVSDIRRFLSAFHEPQVGLIQAAQQLLCDEQAPQRQRLLADLLHNVSQNIAAETRAEDPPWFEGLESRFQSKSGYLRYSCESRIRSYLREVSSYPSTVGAEAQEEFLRVLGSMCQRLRSMQYNGSYFDRGAKGGSRLCTPEGWFSCQGPFDMDSCLSRHSINPYSNRESRILFSTWNLDHIIEKKRTIIPTLVEAIKEQDGREVDWEYFYGLLFTSENLKLVHIVCHKKT THKLNCDPSRIYKPQTRLKRKQPVRKRQ；
DFF40的cDNA序列(SEQ ID NO.9)：5'-ATGCTCCAGAAGCCCAAGAGCGTGAAGCTGCGGGCCCTGCGCAGCCCGAGGAAGTTCGGCGTGGCTGGCCGGAGCTGCCAGGAGGTGCTGCGCAAGGGCTGTCTCCGCTTCCAGCTCCCTGAGCGCGGTTCCCGGCTGTGCCTGTACGAGGATGGCACGGAGCTGACGGAAGATTACTTCCCCAGTGTTCCCGACAACGCCGAGCTGGTGCTGCTCACCTTGGGCCAGGCCTGGCAGGGCTATGTGAGCGACATCAGGCGCTTCCTCAGTGCATTTCACGAGCCACAGGTGGGGCTCATCCAGGCCGCCCAGCAGCTGCTGTGTGATGAGCAGGCCCCACAGAGGCAGAGGCTGCTGGCTGACCTCCTGCACAACGTCAGCCAGAACATCGCGGCCGAGACCCGGGCTGAGGACCCGCCGTGGTTTGAAGGCTTGGAGTCCCGATTTCAGAGCAAGTCTGGCTATCTGAGATACAGCTGTGAGAGCCGGATCCGGAGTTACCTGAGGGAGGTGAGCTCCTACCCCTCCACGGTGGGTGCGGAGGCTCAGGAGGAATTCCTGCGGGTCCTCGGCTCCATGTGCCAGAGGCTCCGGTCCATGCAGTACAATGGCAGCTACTTCGACAGAGGAGCCAAGGGCGGCAGCCGCCTCTGCACACCGGAAGGCTGGTTCTCCTGCCAGGGTCCCTTTGACATGGACAGCTGCTTATCAAGACACTCCATCAACCCCTACAGTAACAGGGAGAGCAGGATCCTCTTCAGCACCTGGAACCTGGATCACATAATAGAAAAGAAACGCACCATCATTCCTACACTGGTGGAAGCAATTAAGGAACAAGATGGAAGAGAAGTGGACTGGGAGTATTTTTATGGCCTGCTTTTTACCTCAGAGAACCTAAAACTAGTGCACATTGTCTGCCATAAGAAAACCACCCACAAGCTCAACTGTGACCCAAGCAGAATCTACAAACCCCAGACAAGGTTGAAGCGGAAGCAGCCTGTGCGGAAACGCCAG-3'；
扩增DFF40的正向引物DFF40-F序列(SEQ ID NO.18)：5'-CCAGCACATGGACAGCCCAGATCTCATGCTCCAGAAGCCCAAGAGC-3'，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点BglⅡ；
扩增DFF40的反向引物DFF40-R序列(SEQ ID NO.19)：5'-CAACCAGCTGAACTTCAGCCATGGT CTGGCGTTTCCGCACAGGCTG-3'，其中，下划线处表示pET-32a(+)载体同源序列，斜体处表示酶切位点NcoⅠ；
2、质粒：pET-32a(+)大肠杆菌表达载体购自Addgene质粒库；
二、实验方法
1、细胞色素C同源重组基因片段的获得：通过化学合成方法合成在SEQ ID NO.7所示Cytc的cDNA序列两端添加有酶切位点BglⅡ和NcoⅠ及补充碱基的核苷酸片段，随后通过引物Cytc-F和Cytc-R扩增Cytc同源重组序列；
2、DFF40同源重组基因片段的获得：通过化学合成方法合成SEQ ID NO.9所示DFF40的cDNA序列两端添加有酶切位点BglⅡ和NcoⅠ及补充碱基的核苷酸片段，随后通过引物DFF40-F和DFF40-R扩增DFF40同源重组序列；
3、pET-32a(+)-Cytc-scFv重组质粒的构建
将Cytc同源重组基因和双酶切(BglⅡ和NcoⅠ)后的pET-32a(+)-scFv重组质粒通过同源重组进行连接，将连接产物转化到E.coli DH5α；重组菌扩培后送上海生工生物工程有限公司进行测序，结果显示阳性重组质粒与预期cDNA序列完全一致，***的Cytc-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，构建得到重组质粒pET-32a(+)-Cytc-scFv(图2)。
SEQ ID NO.10具体为：MGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGYSYTAANKNKGIIWGEDTLMEYLENPKKYIPGTKMIFVGIKKKEERADLIAYLKKATNETMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKR
4、pET-32a(+)-DFF40-scFv重组质粒的构建
将DFF40同源重组基因和双酶切(BglⅡ和NcoⅠ)后的pET-32a(+)-scFv重组质粒通过同源重组进行连接，将连接产物转化到E.coli DH5α；测序，结果显示阳性重组质粒与预期cDNA序列完全一致，***的DFF40-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，构建得到重组质粒pET-32a(+)-DFF40-scFv(图2)；
SEQ ID NO.12具体为：MLQKPKSVKLRALRSPRKFGVAGRSCQEVLRKGCLRFQLPERGSRLCLYEDGTELTEDYFPSVPDNAELVLLTLGQAWQGYVSDIRRFLSAFHEPQVGLIQAAQQLLCDEQAPQRQRLLADLLHNVSQNIAAETRAEDPPWFEGLESRFQSKSGYLRYSCESRIRSYLREVSSYPSTVGAEAQEEFLRVLGSMCQRLRSMQYNGSYFDRGAKGGSRLCTPEGWFSCQGPFDMDSCLSRHSINPYSNRESRILFSTWNLDHIIEKKRTIIPTLVEAIKEQDGREVDWEYFYGLLFTSENLKLVHIVCHKKTTHKLNCDPSRIYKPQTRLKRKQPVRKRQTMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR
5、pET-32a(+)-3Cytc-scFv重组质粒的构建
采用如SEQ ID NO.11所示的Caspase-3酶切位点DEVD序列连接三段Cytc基因片段，组成3Cytc基因片段，按照上述与Cytc类似的方法获得3Cytc同源重组基因，随后和双酶切(BglⅡ和NcoⅠ)后的pET-32a(+)-scFv重组质粒通过同源重组进行连接，将连接产物转化到E.coli DH5α；测序，结果显示阳性重组质粒与预期cDNA序列完全一致，***的3Cytc-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，构建得到重组质粒pET-32a(+)-3Cytc-scFv(图2)；
DEVD的cDNA序列(SEQ ID NO.11)：5'-GATGAAGTTGAT-3'；
SEQ ID NO.13具体为：MGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGYSYTAANKNKGIIWGEDTLMEYLENPKKYIPGTKMIFVGIKKKEERADLIAYLKKATNEDEVDMGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGYSYTAANKNKGIIWGEDTLMEYLENPKKYIPGTKMIFVGIKKKEERADLIAYLKKATNEDEVDMGDVEKGKKIFIMKCSQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGYSYTAANKNKGIIWGEDTLMEYLENPKKYIPGTKMIFVGIKKKEERADLIAYLKKATNETMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR，其中，下划线处为DEVD；
进一步地，凋亡蛋白Cytc的个数不限于1个或3个，还可为2个或大于3个，各个Cytc之间均是通过Caspase-3酶切位点DEVD序列连接，DEVD的cDNA序列如SEQ ID NO.11所示。
实施例3：scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白的诱导表达与鉴定
一、实验材料
大肠杆菌表达菌株感受态细胞BL21(DE3)购自北京天根生化科技；异丙基-L-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)购自中国Aladdin；NI-NTA Resin购自北京全式金生物科技；
二、实验方法
1、scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白的诱导表达
将上述实施例1得到的阳性质粒pET28a-scFv和实施例2中得到的阳性质粒pET-32a(+)-Cytc-scFv、pET-32a(+)-3Cytc-scFv和pET-32a(+)-DFF40-scFv分别转化至大肠杆菌表达菌株感受态细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达和相应条件摸索，诱导scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白表达，并通过NI-NTA Resin亲和层析纯化蛋白，scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白的二维结构如图1所示。
2、scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白的鉴定
将纯化的scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白进行SDS-PAGE电泳检测：蛋白液分别与SDS-PAGE上样缓冲液按比例混匀，金属浴加热变性10min，冷却至室温后上样，100V电泳70min；结束后，将凝胶切下来浸入考马斯亮蓝染色液染色25min，随后用脱色液室温摇床脱色3h，利用marker指示的分子量位置及甬道的背景是否有较多杂带以鉴定纯化效果；
将纯化后的scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv蛋白进行Western Blot分析：如上所述通过煮沸变性制备蛋白样品，冷却后的样品上样到凝胶孔中，100V电泳70min，电泳结束后对照marker的指示带在相应位置切下凝胶，使用bio-rad半干转仪将蛋白转印到PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，接着以鼠源6His Tag抗体为一抗，4摄氏度孵育过夜；次日，使用pH7.6的PBST洗膜后以山羊抗鼠IgG-FITC为二抗，室温孵育2h，随后使用增强型化学发光试剂盒进行曝光。
三、结果与分析
将测序正确的重组质粒pET-32a(+)-scFv、pET-32a(+)-Cytc–scFv、pET-32a(+)-3Cytc-scFv和pET-32a(+)-DFF40-scFv分别转化BL21(DE3)感受态细胞中，通过氨苄青霉素在LB固体培养板上筛选出整合有质粒的重组子，融合基因的表达由pET32a(+)上的噬菌体T7启动子控制，并使用乳糖操纵子进行诱导，利用药瓶在37℃培养出菌体后加入IPTG，通过控制变量法确定最佳诱导条件为0.5mM IPTG，20℃反应12h。
为了获得scFv蛋白及Cytc–scFv、3Cytc–scFv、DFF40-scFv重组蛋白，以进行蛋白鉴定，对0.5mM IPTG，20℃诱导反应12h条件下的pET-32a(+)-scFv/BL21(DE3)、pET-32a(+)-Cytc–scFv/BL21(DE3)、pET-32a(+)-3Cytc–scFv/BL21(DE3)和pET-32a(+)-DFF40–scFv/BL21(DE3)菌体沉淀进行超声破碎，取破碎悬液上清通过NI-NTA Resin亲和层析纯化蛋白，而后通过不同咪唑浓度的洗脱液洗脱下来，目的蛋白主要在100mM咪唑的洗脱液中。
使用SDS-PAGE验证蛋白的纯化效果，如图3A所示，scFv、DFF40-scFv、Cytc-scFv和3Cytc-scFv蛋白分子量分别为scFv：46kDa、DFF40-scFv：84kDa、Cytc-scFv：58kDa、3Cytc-scFv：83kDa，而后考马斯亮蓝染色后，每种蛋白根据其各自分子量的不同在相应位置都出现了条带，与预期结果一致，且背景干净无杂蛋白，说明纯化效果较好。
进一步通过Western Blot实验进行scFv、DFF40-scFv、Cytc-scFv及3Cytc-scFv蛋白表达验证，如图3B所示，抗原抗体结合后进行生物发光成像，结果与凝胶染色结果一致，都在相应位置检测到条带。
以上结果表明，重组蛋白scFv、DFF40-scFv、Cytc-scFv及3Cytc-scFv已成功诱导表达和纯化。
实施例4：scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体在体外对乳腺癌细胞的活性测定
一、实验材料
人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-7购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)ATCC；6His Tag抗体购自上海翊圣生物科技；山羊抗鼠IgG-FITC购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
二、免疫荧光实验
1、实验分组：HER-2高表达型细胞SK-BR-3作为实验组，HER-2阴性细胞MDA-MB-231和MCF-7，用作对照，分别将四种抗体构建体(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv及DFF40-scFv)与三种细胞于37℃共孵育30min。
2、实验操作：
(1)细胞准备：分别将三种乳腺癌细胞接种到预先放置有无菌爬片的12孔板培养皿中，待细胞贴壁后分别加入5ug/ml的不同抗体，于5％CO2培养箱中37℃培养30min；
(2)固定：吸弃培养基，PBS缓冲液洗涤细胞三次，使用新鲜的4％多聚甲醛固定细胞，于室温摇床30min，结束后可移至显微镜下观察细胞是否固定完全；
(3)通透：吸弃固定液，将固定好的细胞用PBS洗涤3次，每次5min。使用PBST溶液(PBS+0.1％Triton X-100)于4℃冰箱通透细胞10min，结束后PBS洗涤3次，每次5min；
(4)封闭：加入5％BSA封闭液室温摇床30min，封闭非特异性结合位点；
(5)一抗结合：一抗使用鼠源6His Tag抗体，按照抗体说明书规定的if实验稀释比例稀释一抗，加入一抗稀释液，室温孵育2h或者4℃过夜。PBS洗涤3次，每次5min；
(6)二抗结合：二抗使用山羊抗鼠IgG-FITC，室温避光孵育2h，PBS洗涤3次，每次5min；
(7)染核：加入DAPI染色液，避光结合10min，PBS洗涤3次，每次5min；
(8)封片及检测：于载玻片上滴加封片剂一滴，取出爬片，细胞面接触封片剂进行封片，待爬片干燥固定后于共聚焦荧光显微镜观察并摄取图像。
三、结果与分析
使用630倍共聚焦显微镜观察，如图4所示，无论是独立的scFv还是凋亡蛋白融合型单链抗体DFF40-scFv、Cytc-scFv以及3Cytc-scFv均结合到SK-BR-3细胞表面，相比之下，HER-2阴性细胞MDA-MB-231和MCF-7表面没有观察到任何绿色目的蛋白，即scFv以及凋亡蛋白融合型scFv均能与HER-2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3表面HER-2抗原特异性结合；由此可见，由原核表达***制备的抗HER-2单链抗体scFv特异性结合乳腺癌细胞表面抗原HER-2，与单克隆抗体具有等效靶向活性，且与凋亡蛋白DFF40或Cytc偶联后结合活性没有受到损伤。
实施例5：scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体对HER-2过表达型乳腺癌细胞活力影响验证
一、实验材料
CCK-8细胞活力检测试剂盒购自美国Sigma；人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-7来源同实施例4；结晶紫染色液购自北京索莱宝；4％多聚甲醛购自美国Sigma；
二、实验方法
CCK-8细胞活力检测试剂盒含有WST-8，在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下，细胞内脱氢酶将WST-8还原成水溶性的橙黄色甲臢染料，其能够溶解在培养基中并可通过酶标仪于450nm处检测吸光度，其生成量与活细胞数量成正比。结晶紫染色液，是一种碱性染色液，可以把细胞核染成深紫色，常用于细胞计数以及细胞增殖分析。本发明通过在SK-BR-3，MDA-MB-231和MCF7细胞系上进行CCK-8分析以及细胞增殖分析，确定免疫细胞凋亡蛋白的体外细胞毒性作用。
1、细胞活力检测实验
(一)实验分组：HER-2高表达型细胞SK-BR-3作为实验组，HER-2阴性细胞MDA-MB-231和MCF-7，用作对照，通过在SK-BR-3，MDA-MB-231和MCF7细胞系上进行CCK-8分析以及细胞增殖分析，确定免疫细胞凋亡蛋白的体外细胞毒性作用。
(二)细胞活力检测：
(1)以104～105个细胞/孔的密度在96孔板中接种细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养细胞24小时；
(2)PBS洗涤细胞，设置空白孔(培养基+CCK8，不含细胞及蛋白)、对照孔(细胞+培养基+CCK8，不含蛋白)、实验孔(细胞+培养基+CCK8+蛋白)，实验孔分组加入不同浓度的目的蛋白，在培养箱中继续孵育48h；(每组设置3个副孔)
(3)使用排枪将10μLCCK-8溶液添加到平板的每个孔中。
(4)37℃孵育1～4小时，直至颜色发生明显变化；
(5)取出平板，用锡纸包被避光，室温下在振荡器上轻轻混合1min，以确保颜色均匀分布；
(6)立即使用酶标仪测定450nm处的每孔吸光度值；
(7)细胞活力计算公式：细胞活力＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％(As为实验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔)。
2、结晶紫染色实验
(1)以104～105个细胞/孔的密度在6孔板中接种细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养细胞24小时；
(2)PBS洗涤细胞，以scFv作用组为对照组，实验组每组加入不同浓度的凋亡蛋白融合型单链抗体蛋白(Cytc-scFv、3Cytc-scFv及DFF40-scFv)，在培养箱中继续孵育48h；
(3)吸出培养基用PBS洗涤两次，并在室温下用4％多聚甲醛摇床固定10min，用蒸馏水洗涤2min，切换至新鲜蒸馏水，然后再洗涤2min；
(4)每孔加入1ml 0.1％结晶紫染色液孵育10min，用蒸馏水洗涤完毕后即可进行观察并拍照。
三、结果与分析
1、细胞活力检测实验10-2
如图5A，四种抗体构建体(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)与SK-BR-3细胞共孵育，浓度梯度为0.01～1000nM，我们可以直观地看出，与scFv相比，凋亡蛋白融合型单链抗体Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv可以有效抑制具有最高HER-2表达水平的SK-BR-3细胞的活力，而且其抑制效果呈浓度依赖性。在100nM相同浓度蛋白质刺激下细胞活力显著下降：DFF40-scFv毒性最高，细胞活力下降80％左右，其次是3Cytc-scFv，而Cytc-scFv是低毒性的，仅为3Cytc-scFv的一半左右，可见3Cytc-scFv由于多个Cytc的释放，毒性显著增加。此外，观察到与SK-BR-3细胞相比，表达低水平HER-2的MDA-MB-231和MCF7细胞的细胞活力几乎没有受到影响(图5B、图5C)，这清楚地表明，细胞表面存在较高水平的HER-2对于凋亡蛋白融合型单链抗体的特异性细胞毒性是必需的。
2、结晶紫染色实验
分别使用四种抗体构建体(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)刺激HER-2高表达细胞SK-BR-3，类似地，从细胞染色结果图5D可以看出，SK-BR-3细胞在scFv作用后细胞数最多，细胞增殖活力基本不受影响；与scFv相比，凋亡蛋白融合型单链抗体Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv孵育的细胞集落数明显减少，这表明融合蛋白Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv可显着抑制细胞生长，并且活性差异与前述细胞活力检测实验结果一致：DFF40-scFv作用后细胞数最少，细胞毒性最强；3Cytc-scFv细胞数较Cytc-scFv更少，可见其活性更优；此外，用DFF40-scFv刺激两种对照细胞MDA-MB-231和MCF7，发现细胞增殖活力均不受影响。
综上，我们可以得出：由于scFv的存在，DFF40或Cytc融合蛋白(Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)对高表达HER-2的细胞产生特异性毒性。
实施例6：scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体对HER-2过表达型乳腺癌细胞诱导后Caspase3蛋白活性检测
一、实验材料
Caspase3活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-7来源同实施例4；
二、Caspase3蛋白活性检测
Caspase3是细胞凋亡执行蛋白，在凋亡通路中起到关键作用。Caspase3活性检测试剂盒就是将Caspase3序列特异性的多肽(Ac-DEVD-PNA)偶联至黄色基团pNA：当该底物被Caspase3剪切后，黄色基团pNA即游离出来，其在405nm附近有强吸收，可通过酶标仪检测，据此可间接考察Caspase3的活化程度。此外，凋亡执行蛋白Caspase3的特异性切割位点DEVD引入3Cytc-scFv蛋白构建体，一旦被细胞内化，Caspase3的激活和切割将使更多的Cytc从融合蛋白中释放出来。
本发明通过scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv或DFF40-scFv融合型单链抗体分别刺激SK-BR-3，MDA-MB-231和MCF7细胞系，采用Caspase3活性检测试剂盒对诱导后Caspase3蛋白活性检测，具体步骤如下：
(1)细胞进行抗体蛋白刺激后，使用胰酶消化，800g离心5min收集细胞；
(2)PBS洗涤细胞沉淀一次，如上离心，吸弃上清后按照每200万细胞加入50μl裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解3min，其间涡旋振荡3-4次，每次10s，或冻融2-3次；
(3)12000rpm，4℃离心15min，小心吸取上清转移至新的干净离心管中。按照Caspase3活性检测试剂盒要求设置对照组与实验组，并分别加入对应量的反应液、裂解液、待测样品、Caspase3酶切底物等，反应体系如表1；
表1
Figure BDA0002585061130000181
(4)将反应体系混匀，继续在培养箱中孵育4h，颜色变化明显时即可在405nm处测定吸光度值；
(5)通过OD实验组/OD对照组来反映Caspase3活化的程度。
三、结果与分析
如图6A所示，凋亡蛋白融合型scFv(Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)与SK-BR-3细胞共孵育后Caspase3蛋白活性显著增强，与单纯scFv(scFv)相比，DFF40-scFv、Cytc-scFv及3Cytc-scFv作用后的Caspase3活化程度分别是其6倍、3倍和4.5倍左右；然而，对于HER-2阴性细胞MDA-MB-231和MCF-7，所有抗体构建体(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)作用后均未检测到Caspase3蛋白的激活(图6B、图6C)。
以上结果表明，单纯scFv没有促凋亡活性，将scFv与凋亡相关蛋白DFF40、Cytc融合表达后可在体外有效诱导HER-2过表达型乳腺癌细胞凋亡。
实施例7：scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体对HER-2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3诱导后凋亡抑制蛋白Bcl-2与凋亡促进蛋白Bax的比值测定
一、实验材料
BCA浓度检测试剂盒购自美国CST；人乳腺癌细胞系SK-BR-3来源同实施例4；
二、凋亡蛋白表达量分析
Bcl-2基因全称为B淋巴细胞瘤-2，在调节凋亡相关基因中Bcl-2家族是最重要的调节因子之一。Bcl-2与Bax都是Bcl-2蛋白家族成员，前者为抗凋亡蛋白，后者为促凋亡蛋白，已证明两者主要在线粒体凋亡途径中发挥作用。Bcl-2通过控制线粒体膜通透性来调节细胞死亡，通过阻止细胞色素C从线粒体中释放和/或与凋亡激活因子(Apaf-1)结合来抑制半胱天冬酶活性，从而抑制细胞凋亡；而Bax可诱导细胞色素C释放，促进Caspase3的激活，从而形成凋亡。Bcl-2可与Bax形成二聚体，如果Bax表达量高于Bcl-2，则促进细胞凋亡；而如果Bcl-2表达量高于Bax，则抑制细胞凋亡。因此，我们通过检测Bcl-2与Bax的表达量变化来比较两者的比值变化，从而判断凋亡的发生。
1、总蛋白提取
(1)配制细胞裂解液(RIPA：Cocktail：PMSF＝100:1:1)置于冰上待用；
(2)12孔板培养细胞，抗体蛋白刺激结束后，吸弃培养基，冰冷的PBS洗涤细胞2次，随即将板置于冰上，每孔加入约100μl配制好的裂解液，使用移液枪反复轻柔吹打几次，确保裂解液与底面充分接触，冰上静置裂解30min；
(3)到达规定时间后，使用细胞刮刮下含有细胞碎片的裂解液，转移至干净EP管中，4℃，12000rpm离心15min；
(4)小心吸取上清液，即为细胞浆总蛋白质。立即进行后续实验，剩余保存于-80℃冰箱。
2、BCA蛋白浓度测定
(1)按照BCA浓度检测试剂盒说明书配制BCA工作液备用：A液：B液＝50:1，
(2)稀释2mg/ml标准品至终浓度0.5mg/ml备用，
(3)如下设置反应体系，包括标准曲线孔与实验样品孔；
表2
Figure BDA0002585061130000191
(4)在96孔板中按顺序依次加入各组试剂，并通过200μl移液枪轻轻混匀每孔试剂，样品组每组重复设置三个副孔；
(5)将孔板放入预热的37℃恒温孵箱孵育30min，结束后取出立即使用酶标仪检测570nm处的吸光度值；
(6)根据吸光度值建立标准曲线，根据标准曲线计算每孔蛋白浓度。
3、免疫印迹
将各蛋白样品加热变性，根据浓度的不同计算上样体积，保证每孔上样量一致，按照如上Western blot方法完成蛋白质印迹相关实验步骤，并作灰度分析。
三、结果与分析
如图7所示，四种融合蛋白(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv及DFF40-scFv)分别作用于SK-BR-3细胞后，提取总蛋白，检测凋亡抑制蛋白Bcl-2以及凋亡促进蛋白Bax的含量变化，以α-tubulin作为内参，结果如图7A所示；如图7B所示，四种融合蛋白(scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv)分别作用于SK-BR-3细胞，经ImageLab定量，Bcl-2/Bax比值：scFv>Cytc-scFv>3Cytc-scFv>DFF40-scFv。
由此可见，与凋亡蛋白DFF40融合的scFv(DFF40-scFv)具有最好的凋亡诱导活性，而三个Cytc串联融合的scFv(3Cytc-scFv)效果优于单个Cytc融合的scFv(Cytc-scFv)。
实施例8：形态学观察与scFv、Cytc–scFv、3Cytc–scFv及DFF40-scFv融合型单链抗体共孵育后HER-2高表达型乳腺癌细胞SK-BR-3凋亡特征
一、实验材料
Hoechst染色液购自北京索莱宝；人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-7来源同实施例4；
二、凋亡蛋白表达量分析
Hoechst是一种蓝色荧光染料，可标记DNA，由于细胞发生凋亡时，染色质会固缩，故凋亡细胞与正常细胞相比细胞核会有明显差异。
1、Hoechst核染色
(1)将干净的爬片置于六孔板中，接种细胞并生长过夜，使其充满约50％-80％；
(2)融合蛋白(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv或DFF40-scFv)刺激细胞凋亡后，吸出培养液，加入0.5ml固定液，固定10min；
(3)除去固定液并用PBS清洗两次，然后加入0.5ml Hoechst 33258染色溶液并室温摇床染色5min；
(4)除去染色液，用PBS洗涤，然后在载玻片上滴一滴抗荧光淬灭剂，盖上爬片，使细胞面接触载玻片，并尽可能避免气泡。随即在共聚焦荧光显微镜下进行观察，激发波长约为350nm。
2、细胞长时间成像观察
SK-BR-3细胞在活细胞工作站环境中与不同的蛋白构建体(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv及DFF40-scFv)相互作用48小时，在此期间使用20×放大倍数显微镜头连续记录细胞生长过程中的所有形态变化。比较0h，24h和48h细胞形态的差异，以评估细胞凋亡的程度并进行定量分析。
三、结果与分析
如图8A为SK-BR-3细胞在Hoechst染核后拍摄的荧光图像，可见scFv作用下细胞核仍然呈正常的蓝色，而DFF40-scFv作用下细胞核呈碎块状致密浓染，颜色发白(图中亮色)，相比之下，3Cytc-scFv颜色也出现发白但程度不及DFF40-scFv，Cytc-scFv则是稍有发白不是很明显；以上结果表明，凋亡蛋白融合型单链抗体作用后，由于每种蛋白诱导凋亡效价的不同，细胞出现了不同程度的核固缩。
图8B为活细胞长时间动态影像成像分析仪延时拍摄图像，记录了抗体蛋白与SK-BR-3细胞共孵育后48h内的生长变化情况，可以看到，scFv作用后，24h、48h细胞形态均完整，未出现固缩，表面不出泡，没有形成凋亡小体；相比之下，DFF40-scFv作用下，24h细胞体积明显减小，细胞固缩，48h再观察可见细胞表面起泡，形成凋亡小体，呈碎片状；3Cytc-scFv作用下，24h胞质致密，48h也起泡并且出现凋亡小体；最后，Cytc-scFv作用后的细胞24h形态完好，48h才观察到细胞固缩。
图9A-D为不同蛋白(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv及DFF40-scFv)与三种乳腺癌细胞(SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7)共孵育48h后的凋亡率统计，SK-BR-3细胞的作用效果与图8B所描述一致；对于用作对照的HER-2阴性细胞MDA-MB-231以及MCF-7来说，在四种抗体蛋白诱导后均未发生显著凋亡。
综上，凋亡蛋白融合型scFv可有效诱导HER-2高表达的靶细胞凋亡，且DFF40-scFv活性最强，起效时间最快，3Cytc-scFv次之，Cytc-scFv活性较低，48h才检测到少量凋亡现象，而这些凋亡蛋白融合型scFv对于表面不含特异性抗原的细胞则没有作用。
实施例9：流式细胞术检测到经融合蛋白作用后，HER-2高表达乳腺癌细胞SK-BR-3显著凋亡
一、实验材料
Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231以及MCF-7来源同实施例4；
二、流式细胞术
(1)以scFv作用组作为对照组，比较凋亡蛋白融合型单链抗体作用组(实验组，Cytc-scFv、3Cytc-scFv或DFF40-scFv)的促凋亡活性。在六孔板中培养细胞，融合蛋白(scFv、Cytc-scFv、3Cytc-scFv或DFF40-scFv)凋亡刺激48h后把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤细胞3次，用不含EDTA的胰酶消化细胞；
(2)细胞消化下来后，加入步骤(1)中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到新的干净离心管内，1000g离心5min，弃上清，用PBS轻轻重悬细胞并计数；
(3)取1.5×105重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入500μl结合液(来自Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒)轻轻重悬细胞，
(4)先加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀再加入5μl碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)，轻轻混匀，
(5)室温(20-25℃)避光(锡纸包被)孵育10min。随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。流式象限图右侧两区域显示为凋亡/坏死细胞。
三、结果与分析
如下图10A所示，以FITC为横坐标，PI为纵坐标生成流式图谱，第一纵列为scFv分别作用于三种乳腺癌细胞系的流式象限图，细胞类型基本都分布在左下象限，即AnnexinV-/PI-，细胞正常生长，鲜少细胞发生凋亡；第二纵列为DFF40-scFv作用结果，可见HER-2高表达细胞SK-BR-3在DFF40-scFv作用下右下象限Annexin V+/PI-以及右上象限Annexin V+/PI+的细胞总和达到50％，即50％的细胞出现了不同程度的凋亡；用于对照的HER-2阴性细胞MDA-MB-231、MCF-7没有出现凋亡；第三纵列为Cytc-scFv作用结果，Cytc-scFv作用下，除SK-BR-3细胞有大概15％的凋亡率外，用于对照的HER-2阴性细胞MDA-MB-231、MCF-7没有出现凋亡；最右一列为3Cytc-scFv作用结果，SK-BR-3细胞的凋亡比率约是Cytc-scFv的两倍，同样，MDA-MB-231、MCF-7细胞没有出现凋亡。
图10B为10A中的凋亡数据的量化结果图，与象限图所示结果一致。
综上，根据以上流式细胞术实验结果，我们可以得出与前述体外实验一致的结论，即凋亡蛋白融合型scFv相比于单纯scFv可有效诱导HER-2高表达的靶细胞凋亡，对于表面不含特异性抗原的细胞没有作用，且活性DFF40-scFv>3Cytc-scFv>Cytc-scFv。
实施例10：凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体的体内活性验证
前述多种体外实验充分验证了融合型单链抗体的靶向抗肿瘤活性，紧接着我们通过建立动物模型来探讨融合蛋白在体内是否能发挥与体外一致活性。
一、材料与试剂
Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；人乳腺癌细胞系SK-BR-3购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)；动物：20只6周龄的BALB/C雌性裸鼠，体重16-18g，由南京大学模式动物研究中心提供；且其严格按照国家动物实验操作规范进行饲养与解剖，并获得南京中医药大学动物伦理委员会批准。
二、实验方法
1、建立裸鼠异种移植模型
(1)75mm2培养瓶大量培养SK-BR-3乳腺癌细胞，消化后重悬于DMEM中，与基质胶(4℃)4:1混合用于肿瘤细胞种植，
(2)在六周龄的雌性裸鼠右上侧腋下皮下接种1×107个SK-BR-3细胞；
(3)当肿瘤达到平均体积约50mm3时，将小鼠随机分为四组，分别为scFv作用组、DFF40-scFv作用组、3Cytc-scFv作用组和Cytc-scFv作用组，每组5只；
(4)对上述各组小鼠每三天腹腔注射(10mg/kg)融合蛋白进行治疗，使用卡尺每三天测量肿瘤大小，并根据标准公式：V(mm3)＝width2(mm2)×length(mm)/2计算肿瘤体积；
(5)在第30天终止实验，安乐死处死小鼠，并切除肿瘤拍照、称重。
2、Tunel染色
将分离出来的肿瘤制作成石蜡切片，使用Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒进行Tunel染色，然后于光学显微镜下观察拍照(凋亡细胞显示为深棕色)，分析肿瘤组织的凋亡情况。
三、结果与分析
如图11A所示，每3天监测肿瘤体积变化，scFv作用组的小鼠肿瘤体积逐日增加，肿瘤生长没有受到抑制；DFF40-scFv作用组、3Cytc-scFv作用组和Cytc-scFv作用组作用下的小鼠肿瘤体积增长幅度出现不同程度的减小，其中，DFF40-scFv作用组肿瘤生长受到较大抑制，蛋白注射治疗期间肿瘤体积的变化微乎其微；3Cytc-scFv作用组肿瘤同样受到抑制，体积较DFF40-scFv作用组略大一点，而Cytc-scFv作用组肿瘤生长明显，相比对照组scFv，受到轻微抑制。实验结束后分离出瘤体，将每组肿瘤排列整齐留存照片进行对比，可以看出肿瘤体积与终质量的差异与实验期间记录的一致(图11B、图11C)。
如图12所示的肿瘤组织石蜡切片的Tunel染色结果，scFv作用组小鼠肿瘤细胞没有检测到凋亡，相比之下，DFF40-scFv作用组小鼠凋亡显著，3Cytc-scFv作用组凋亡率次之，而Cytc-scFv仅出现少量凋亡。
综上，裸鼠异种移植模型在动物水平上成功验证了凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体体内能有效靶向HER-2过表达型乳腺癌肿瘤并诱导肿瘤细胞凋亡，且三种凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体(DFF40-scFv、3Cytc-scFv和Cytc-scFv)的活性与体外试验一致；由此我们可以得出：将促凋亡蛋白与单链抗体融合表达用于癌症的治疗可实现靶向性与抗肿瘤活性的良好结合，为癌症的靶向免疫治疗提供新的思路。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体及其制备方法和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 5
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 5
gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgctg cttctggttt caacatcaaa gacacctaca tccactgggt tcgtcaggct 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgctcgt atctacccga ccaacggtta cacccgttac 180
gctgactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctgctgaca cctctaaaaa caccgcttac 240
ctgcagatga actctctgcg tgctgaagac accgctgttt actactgctc tcgttggggt 300
ggtgacggtt tctacgctat ggactactgg ggtcagggta ccctggttac cgtttcttct 360
gggggcgggg gctctggggg cgggggctct gggggcgggg gctctgatat tcagatgacc 420
cagagcccga gcagcctgag cgcgagcgtg ggcgatcgcg tgaccattac ctgccgcgcg 480
agccaggatg tgaacaccgc ggtggcgtgg tatcagcaga aaccgggcaa agcgccgaaa 540
ctgctgattt atagcgcgag ctttctgtat agcggcgtgc cgagccgctt tagcggcagc 600
cgcagcggca ccgattttac cctgaccatt agcagcctgc agccggaaga ttttgcgacc 660
tattattgcc agcagcatta taccaccccg ccgacctttg gccagggcac caaagtggaa 720
attaaacgc 729
<210> 6
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gly Asp Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Ile Met Lys Cys Ser
1 5 10 15
Gln Cys His Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn
20 25 30
Leu His Gly Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser
35 40 45
Tyr Thr Ala Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Ile Trp Gly Glu Asp Thr
50 55 60
Leu Met Glu Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys
65 70 75 80
Met Ile Phe Val Gly Ile Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala Asp Leu Ile
85 90 95
Ala Tyr Leu Lys Lys Ala Thr Asn Glu
100 105
<210> 7
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 7
atgggtgatg ttgagaaagg caagaagatt tttattatga agtgttccca gtgccacacc 60
gttgaaaagg gaggcaagca caagactggg ccaaatctcc acggtctctt tgggcggaag 120
acaggtcagg cccctggata ctcttacaca gccgccaata agaacaaagg catcatctgg 180
ggagaggata cactgatgga gtatttggag aatcccaaga agtacatccc tggaacaaaa 240
atgatctttg tcggcattaa gaagaaggaa gaaagggcag acttaatagc ttatctcaaa 300
aaagctacta atgag 315
<210> 8
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 8
Met Leu Gln Lys Pro Lys Ser Val Lys Leu Arg Ala Leu Arg Ser Pro
1 5 10 15
Arg Lys Phe Gly Val Ala Gly Arg Ser Cys Gln Glu Val Leu Arg Lys
20 25 30
Gly Cys Leu Arg Phe Gln Leu Pro Glu Arg Gly Ser Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Tyr Glu Asp Gly Thr Glu Leu Thr Glu Asp Tyr Phe Pro Ser Val Pro
50 55 60
Asp Asn Ala Glu Leu Val Leu Leu Thr Leu Gly Gln Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Tyr Val Ser Asp Ile Arg Arg Phe Leu Ser Ala Phe His Glu Pro Gln
85 90 95
Val Gly Leu Ile Gln Ala Ala Gln Gln Leu Leu Cys Asp Glu Gln Ala
100 105 110
Pro Gln Arg Gln Arg Leu Leu Ala Asp Leu Leu His Asn Val Ser Gln
115 120 125
Asn Ile Ala Ala Glu Thr Arg Ala Glu Asp Pro Pro Trp Phe Glu Gly
130 135 140
Leu Glu Ser Arg Phe Gln Ser Lys Ser Gly Tyr Leu Arg Tyr Ser Cys
145 150 155 160
Glu Ser Arg Ile Arg Ser Tyr Leu Arg Glu Val Ser Ser Tyr Pro Ser
165 170 175
Thr Val Gly Ala Glu Ala Gln Glu Glu Phe Leu Arg Val Leu Gly Ser
180 185 190
Met Cys Gln Arg Leu Arg Ser Met Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Phe Asp
195 200 205
Arg Gly Ala Lys Gly Gly Ser Arg Leu Cys Thr Pro Glu Gly Trp Phe
210 215 220
Ser Cys Gln Gly Pro Phe Asp Met Asp Ser Cys Leu Ser Arg His Ser
225 230 235 240
Ile Asn Pro Tyr Ser Asn Arg Glu Ser Arg Ile Leu Phe Ser Thr Trp
245 250 255
Asn Leu Asp His Ile Ile Glu Lys Lys Arg Thr Ile Ile Pro Thr Leu
260 265 270
Val Glu Ala Ile Lys Glu Gln Asp Gly Arg Glu Val Asp Trp Glu Tyr
275 280 285
Phe Tyr Gly Leu Leu Phe Thr Ser Glu Asn Leu Lys Leu Val His Ile
290 295 300
Val Cys His Lys Lys Thr Thr His Lys Leu Asn Cys Asp Pro Ser Arg
305 310 315 320
Ile Tyr Lys Pro Gln Thr Arg Leu Lys Arg Lys Gln Pro Val Arg Lys
325 330 335
Arg Gln
<210> 9
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 9
atgctccaga agcccaagag cgtgaagctg cgggccctgc gcagcccgag gaagttcggc 60
gtggctggcc ggagctgcca ggaggtgctg cgcaagggct gtctccgctt ccagctccct 120
gagcgcggtt cccggctgtg cctgtacgag gatggcacgg agctgacgga agattacttc 180
cccagtgttc ccgacaacgc cgagctggtg ctgctcacct tgggccaggc ctggcagggc 240
tatgtgagcg acatcaggcg cttcctcagt gcatttcacg agccacaggt ggggctcatc 300
caggccgccc agcagctgct gtgtgatgag caggccccac agaggcagag gctgctggct 360
gacctcctgc acaacgtcag ccagaacatc gcggccgaga cccgggctga ggacccgccg 420
tggtttgaag gcttggagtc ccgatttcag agcaagtctg gctatctgag atacagctgt 480
gagagccgga tccggagtta cctgagggag gtgagctcct acccctccac ggtgggtgcg 540
gaggctcagg aggaattcct gcgggtcctc ggctccatgt gccagaggct ccggtccatg 600
cagtacaatg gcagctactt cgacagagga gccaagggcg gcagccgcct ctgcacaccg 660
gaaggctggt tctcctgcca gggtcccttt gacatggaca gctgcttatc aagacactcc 720
atcaacccct acagtaacag ggagagcagg atcctcttca gcacctggaa cctggatcac 780
ataatagaaa agaaacgcac catcattcct acactggtgg aagcaattaa ggaacaagat 840
ggaagagaag tggactggga gtatttttat ggcctgcttt ttacctcaga gaacctaaaa 900
ctagtgcaca ttgtctgcca taagaaaacc acccacaagc tcaactgtga cccaagcaga 960
atctacaaac cccagacaag gttgaagcgg aagcagcctg tgcggaaacg ccag 1014
<210> 10
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 10
Met Gly Asp Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Ile Met Lys Cys Ser
1 5 10 15
Gln Cys His Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn
20 25 30
Leu His Gly Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser
35 40 45
Tyr Thr Ala Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Ile Trp Gly Glu Asp Thr
50 55 60
Leu Met Glu Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys
65 70 75 80
Met Ile Phe Val Gly Ile Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala Asp Leu Ile
85 90 95
Ala Tyr Leu Lys Lys Ala Thr Asn Glu Thr Met Ala Glu Val Gln Leu
100 105 110
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
115 120 125
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp
130 135 140
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr
145 150 155 160
Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
165 170 175
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
180 185 190
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly
195 200 205
Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
210 215 220
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
245 250 255
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
260 265 270
Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr
325 330 335
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
340 345 350
<210> 11
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 11
gatgaagttg at 12
<210> 12
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 12
Met Leu Gln Lys Pro Lys Ser Val Lys Leu Arg Ala Leu Arg Ser Pro
1 5 10 15
Arg Lys Phe Gly Val Ala Gly Arg Ser Cys Gln Glu Val Leu Arg Lys
20 25 30
Gly Cys Leu Arg Phe Gln Leu Pro Glu Arg Gly Ser Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Tyr Glu Asp Gly Thr Glu Leu Thr Glu Asp Tyr Phe Pro Ser Val Pro
50 55 60
Asp Asn Ala Glu Leu Val Leu Leu Thr Leu Gly Gln Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Tyr Val Ser Asp Ile Arg Arg Phe Leu Ser Ala Phe His Glu Pro Gln
85 90 95
Val Gly Leu Ile Gln Ala Ala Gln Gln Leu Leu Cys Asp Glu Gln Ala
100 105 110
Pro Gln Arg Gln Arg Leu Leu Ala Asp Leu Leu His Asn Val Ser Gln
115 120 125
Asn Ile Ala Ala Glu Thr Arg Ala Glu Asp Pro Pro Trp Phe Glu Gly
130 135 140
Leu Glu Ser Arg Phe Gln Ser Lys Ser Gly Tyr Leu Arg Tyr Ser Cys
145 150 155 160
Glu Ser Arg Ile Arg Ser Tyr Leu Arg Glu Val Ser Ser Tyr Pro Ser
165 170 175
Thr Val Gly Ala Glu Ala Gln Glu Glu Phe Leu Arg Val Leu Gly Ser
180 185 190
Met Cys Gln Arg Leu Arg Ser Met Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Phe Asp
195 200 205
Arg Gly Ala Lys Gly Gly Ser Arg Leu Cys Thr Pro Glu Gly Trp Phe
210 215 220
Ser Cys Gln Gly Pro Phe Asp Met Asp Ser Cys Leu Ser Arg His Ser
225 230 235 240
Ile Asn Pro Tyr Ser Asn Arg Glu Ser Arg Ile Leu Phe Ser Thr Trp
245 250 255
Asn Leu Asp His Ile Ile Glu Lys Lys Arg Thr Ile Ile Pro Thr Leu
260 265 270
Val Glu Ala Ile Lys Glu Gln Asp Gly Arg Glu Val Asp Trp Glu Tyr
275 280 285
Phe Tyr Gly Leu Leu Phe Thr Ser Glu Asn Leu Lys Leu Val His Ile
290 295 300
Val Cys His Lys Lys Thr Thr His Lys Leu Asn Cys Asp Pro Ser Arg
305 310 315 320
Ile Tyr Lys Pro Gln Thr Arg Leu Lys Arg Lys Gln Pro Val Arg Lys
325 330 335
Arg Gln Thr Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
340 345 350
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
355 360 365
Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
370 375 380
Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg
385 390 395 400
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
405 410 415
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
420 425 430
Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met
435 440 445
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
465 470 475 480
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
485 490 495
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr
500 505 510
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
515 520 525
Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
530 535 540
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln
565 570 575
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
580
<210> 13
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gly Asp Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Ile Met Lys Cys Ser
1 5 10 15
Gln Cys His Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn
20 25 30
Leu His Gly Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser
35 40 45
Tyr Thr Ala Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Ile Trp Gly Glu Asp Thr
50 55 60
Leu Met Glu Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys
65 70 75 80
Met Ile Phe Val Gly Ile Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala Asp Leu Ile
85 90 95
Ala Tyr Leu Lys Lys Ala Thr Asn Glu Asp Glu Val Asp Met Gly Asp
100 105 110
Val Glu Lys Gly Lys Lys Ile Phe Ile Met Lys Cys Ser Gln Cys His
115 120 125
Thr Val Glu Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leu His Gly
130 135 140
Leu Phe Gly Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser Tyr Thr Ala
145 150 155 160
Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ile Ile Trp Gly Glu Asp Thr Leu Met Glu
165 170 175
Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys Met Ile Phe
180 185 190
Val Gly Ile Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala Asp Leu Ile Ala Tyr Leu
195 200 205
Lys Lys Ala Thr Asn Glu Asp Glu Val Asp Met Gly Asp Val Glu Lys
210 215 220
Gly Lys Lys Ile Phe Ile Met Lys Cys Ser Gln Cys His Thr Val Glu
225 230 235 240
Lys Gly Gly Lys His Lys Thr Gly Pro Asn Leu His Gly Leu Phe Gly
245 250 255
Arg Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser Tyr Thr Ala Ala Asn Lys
260 265 270
Asn Lys Gly Ile Ile Trp Gly Glu Asp Thr Leu Met Glu Tyr Leu Glu
275 280 285
Asn Pro Lys Lys Tyr Ile Pro Gly Thr Lys Met Ile Phe Val Gly Ile
290 295 300
Lys Lys Lys Glu Glu Arg Ala Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Ala
305 310 315 320
Thr Asn Glu Thr Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
340 345 350
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
355 360 365
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
370 375 380
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr
385 390 395 400
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
405 410 415
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala
420 425 430
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
450 455 460
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
465 470 475 480
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp
485 490 495
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
500 505 510
Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
515 520 525
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
530 535 540
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly
545 550 555 560
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
565
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 14
cgacgacgac gacaaggcca tggctgaagt tcagctggtt gaatctgg 48
<210> 15
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 15
cgacggagct cgaattcgga tccttagcgt ttaatttcca ctttggtgc 49
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 16
ccagcacatg gacagcccag atctcatggg tgatgttgag aaaggc 46
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 17
caaccagctg aacttcagcc atggtctcat tagtagcttt tttgagataa gc 52
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 18
ccagcacatg gacagcccag atctcatgct ccagaagccc aagagc 46
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<400> 19
caaccagctg aacttcagcc atggtctggc gtttccgcac aggctg 46

Claims (9)

1.凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于，由抗HER-2单链抗体以不同串联方式与凋亡蛋白偶联而成，所述抗HER-2单链抗体包括序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区VH和序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区VL，所述重链可变区和轻链可变区通过序列如SEQ ID NO.3所示的柔性肽(G4S)3连接，所述重链可变区VH上游含有6×his标签，所述抗HER-2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述抗HER-2单链抗体的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述凋亡蛋白为细胞色素C或DNA片段化因子40。
2.根据权利要求1所述的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于：所述细胞色素C的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述细胞色素C的cDNA序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于：所述DNA片段化因子40的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码所述DNA片段化因子40的cDNA序列如SEQID NO.9所示。
4.根据权利要求2所述的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于：所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为Cytc-scFv融合型单链抗体，由权利要求1所述的抗HER-2单链抗体与一个权利要求3所述的细胞色素C偶联而成，所述细胞色素C连接在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，所述Cytc-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.根据权利要求2所述的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于：所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为nCytc-scFv融合型单链抗体，由权利要求1所述的抗HER-2单链抗体与细胞色素C串联集合体偶联而成，且细胞色素C串联集合体串联在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，细胞色素C串联集合体由若干个权利要求3所述的细胞色素C通过连接肽连接而成，所述连接肽为Caspase-3酶切位点DEVD，所述DEVD的cDNA序列如SEQ ID NO.11所示。
6.根据权利要求3所述的凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体，其特征在于：所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体为DFF40-scFv融合型单链抗体，由权利要求1所述的抗HER-2单链抗体与权利要求4所述的DNA片段化因子40连接而成，所述DNA片段化因子40连接在6×his标签与抗HER-2单链抗体之间，所述DFF40-scFv融合型单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。
7.权利要求1～6任一项所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）合成如SEQ ID NO.5所示的编码抗HER-2单链抗体的cDNA序列和编码凋亡蛋白的cDNA序列；
（2）构建重组质粒：将步骤（1）所得的编码抗HER-2单链抗体的cDNA序列和编码凋亡蛋白的cDNA序列分别连入pET-32a(+)表达载体中，构建成重组质粒；
（3）将步骤（2）所得重组质粒转化DH5α感受态细胞，筛选测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞中，诱导表达凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，编码抗HER-2单链抗体的cDNA片段***到pET-32a(+)表达载体的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，所述凋亡蛋白为权利要求3所述的细胞色素C或权利要求4所述的DNA片段化因子40，编码凋亡蛋白的cDNA片段***到pET-32a(+)表达载体的BglⅡ和NcoⅠ酶切位点之间，且***编码抗HER-2单链抗体的cDNA片段与***编码凋亡蛋白的cDNA片段时在pET-32a(+)表达载体上采用的限制性内切酶NcoⅠ酶切位点为同一酶切位点，当凋亡蛋白为细胞色素C且细胞色素C的个数大于一个时，各个细胞色素C之间通过如SEQ ID NO.11所示的Caspase-3酶切位点DEVD串联连接。
9.权利要求1所述抗HER-2单链抗体或权利要求1～6任一项所述凋亡蛋白融合型抗HER-2单链抗体在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为靶向治疗HER-2高表达癌症的药物。
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