CN108107204B - 一种检测car-t细胞数的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测CAR‑T细胞数的方法，其是在CAR‑T细胞中引入C5aR，检测C5aR的表达率从而获得CAR‑T细胞数。本发明首次通过实验证实C5aR胞内结构域可用于CAR‑T细胞数检测，而且还发现引入C5aR胞内结构域不仅不影响CAR‑T细胞杀伤功能、反而具有增强CAR‑T细胞杀伤功能作用，因此引入C5aR胞内结构域作为检测CAR‑T细胞数的方法具有很广泛的应用前景。

Description

一种检测CAR-T细胞数的方法

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，具体涉及嵌合抗原受体T细胞数检测技术，尤其汲及一种新的检测嵌合抗原受体T细胞数的方法。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR,Chimeric Antigen Receptors)T细胞是有望治愈肿瘤的里程碑事件,CAR-T技术是应用基因改造技术，将一段识别肿瘤抗原的单链抗体(single chainfragment variable,scFv)和胞内活化基序重组基因转染至T淋巴细胞上以达到更好的识别及杀伤肿瘤的作用。CAR-T分子通常包括胞外绞链区、跨膜区和胞内信号区。其中胞外绞链区是由单链抗体的重链和轻链可变区通过一条肽段连接而形成；跨膜区则主要来自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜区；胞内信号区则主要来自于CD28、4-1BB、CD3zeta、CD27或OX-40等T细胞传导信号分子的胞内段嵌合体。高亲合力，高特异性的scFv决定CAR-T靶向某种抗原，一旦结合抗原，CAR的胞内段会传输活化以及共刺激信号给T细胞，激活T细胞进而有效靶向杀伤肿瘤细胞。T细胞的激活需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-I分子结合为活化的第一信号,决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号,决定T细胞增殖。简而言之,CAR-T细胞通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别,然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。

CAR-T技术已经解决了T细胞的靶向性、杀伤性和体内增殖等难题。但目前如何准确确定体内CAR-T细胞的数量，不影响CAR-T功能，获知CAR-T细胞在体内的变化情况，提前预防因CAR-T引起的细胞因子风暴等，进而对患者的临床细胞治疗方案提供依据，成为目前亟需要解决的技术问题。目前对于CAR-T细胞数的检测主要是：1、使用PCR方法检测胞外scFV，缺点是检测方法耗时长、相对定量，不同的scFV需要设计不同的PCR引物和探讨；2、CAR分子中引入绿色荧光蛋白(GFP)，这是目前检测CAR-T比较精确的方法，但因GFP是在水母中发现，并不存在于人体，其安全性需要长时间观察，而且因人体内不存在GFP可能会产生抗GFP的抗体，进而影响CAR-T细胞功能；3、在胞外区域的铰链区引入IGG4或IGG1等，通过流式检测IGG4或IGG1的表达量，其缺点是引入IGG4或IGG1后，使CAR-T分子量增加，影响CAR-T转染率，而且人体内本身也存在IGG4或IGG1，检测结果并不完全精确。

发明内容

本发明提出了一种检测CAR-T细胞数的方法，操作方便，测量结果精确，可通过实时样品的检测获知CAR-T细胞在体内的变化情况，从而为有效的指导细胞治疗进一步安全的实施提供依据。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：在CAR-T细胞中引入C5aR，检测C5aR的表达率从而获得CAR-T细胞数。

在具体的实施方案中，C5aR除可以表达于CAR-T细胞胞内，还可以表达于其表面，进一步优选地，所述C5aR为CAR-T胞内结构域。在CAR-T分子胞内引入C5aR胞内结构域，并检测C5aR的表达率。

具体地来说，本发明是构建一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，所述至少一个胞内结构域是指C5aR胞内结构域，或与C5aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

对于上述CAR分子，作为优选，抗原可以是肿瘤抗原，所述肿瘤抗原例如包括：5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnTV、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190minor bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、NY-Eso-1或NY-Eso-B等等；进一步优选地，所述肿瘤抗原为CD19。本发明专利所述抗原也可以是在自身免疫性疾病中出现的炎性细胞表面分子或导致自身免疫的TCR。

优选地，所述能够结合抗原的胞外结构域是指结合靶向抗原的抗体的单链可变片段。在具体实施方案中，上述CAR分子可以仅以C5aR胞内结构域作为其胞内结构域，还可以包含除了C5aR胞内结构域之外的一个或多个(例如2个或3个)其它胞内结构域。例如，在优选的实施方案中，除了C5aR胞内结构域之外，所述胞内结构域还包括4-1BB、CD3ζ胞内结构域；进一步优选地，所述C5aR胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的C末端侧。

在一个具体实施方案中，胞内结构域为自N-末端侧开始依次连接的4-1BB胞内结构域、CD3ζ胞内结构域和C5aR胞内结构域。此外，本发明的嵌合抗原受体还涵盖其胞内结构域包括串联连接的两个或更多个胞内结构域的情形；以及，可供选择地，所述C5aR胞内结构域可以被配置在嵌合抗原受体胞内结构域的N-末端侧。在优选的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体自N末端侧开始依次包括抗肿瘤抗原抗体的单链可变区作为胞外结构域，CD28分子的跨膜结构域和4-1BB胞内结构域，CD3ζ胞内结构域，C5aR胞内结构域。

所述C5aR含有如序列表1所述的序列，但不局限于此系列，还应包括C5aR其他编码核酸。

优选地，肿瘤为实体瘤或血液瘤。

在本发明提供的该用途的具体实施例中，所述肿瘤为B-ALL。值得注意的是，本发明的CAR特征在于它包含C5aR胞内结构域作为其胞内结构域。所述C5aR胞内结构域包括具有相同功能的其变体。术语“变体”是指包含一个或几个至多个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体，条件是所述变体基本上保留原始序列所具有的相同功能。

本发明的嵌合抗原受体除可以有效检测CAR-T细胞数，还可以显著提高肿瘤靶细胞的体外杀伤效率，为CAR-T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。

本发明提出了一种体内检测CAR-T细胞数的方法，操作方便，测量结果精确，通过定期抽取患者外周静脉血或骨髓，可获知CAR-T细胞在体内的变化情况，从而为有效的指导细胞治疗进一步安全的实施提供依据。

因C5aR主要表达于单核细胞、内皮细胞等，在T细胞的细胞表面和细胞内均基本不表达，因此我们在CAR-T分子胞内引入C5aR胞内结构域,通过破膜剂将CAR-T细胞破膜，通过流式方法检测T细胞内C5aR表达率，即为CAR-T细胞数，避免了传统方法引入异种蛋白可能产生抗CAR-T抗体，导致CAR-T细胞功能丧失；或者在胞外引入IGG4、IGG1等本身影响转染率及检测结果不准等情况出现。目前国内外还没有在CAR-T胞内引入C5aR胞内结构域作为检测CAR-T细胞数的方法构建，更无法预期构建后的CAR-T效果如何。本发明首次通过实验证实C5aR胞内结构域可用于CAR-T细胞数检测，而且还发现引入C5aR胞内结构域不仅不影响CAR-T细胞杀伤功能、反而具有增强CAR-T细胞杀伤功能作用，因此引入C5aR胞内结构域作为检测CAR-T细胞数的方法具有很广泛的应用前景。

附图说明

图1a为含有C5aR胞内结构域组合的病毒载体示意图。

图1b为不含有C5aR胞内结构域组合的病毒载体示意图。

图2a为流式检测CAR-T细胞本身细胞外C5aR，细胞外基本不表达C5aR。因此在CAR-T细胞引进C5aR可以做为检测CAR-T细胞数的标志。

图2b为流式检测CAR-T细胞破膜后C5aR表达情况，细胞内基本不表达C5aR。因些在CAR-T细胞引进C5aR可以做为检测CAR-T细胞数的标志。

图3a为使用传统方法流式检测GFP方法，检测CAR-T细胞数。

图3b为CAR-T分子胞内引入C5aR胞内结构域，即CAR19C5aR T细胞，通过破膜剂将CAR-T细胞破膜，通过流式方法检测CAR-T细胞内C5aR表达率与GFP表达率一致(图3a)，因此C5aR可代替GFP检测CAR-T细胞数。

图4为GFP T、CAR19T和CAR19C5aR T细胞对表达CD19的NALM6-GL细胞的体外杀伤效应结果图，结果表明，CAR19C5aR T优于GFP T、CAR19T，图中NALM6表示NALM6-GL细胞。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都落入本发明保护范围。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1含有CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ(CAR19)、抗CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ-C5aR(CAR19C5aR)

质粒的制备

按如下步骤制备本发明携带含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体基因的质粒：

(1)通过基因合成、分子克隆等手段得到含抗CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ(CAR19)的质粒pUC57-CAR19基因包含抗CD19单抗ScFV、CD28跨膜区和4-1BB、CD3ζ胞内区，即CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ。

(2)通过基因合成、分子克隆等手段得到含抗CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ-C5aR(CAR19)的质粒pUC57-CAR19基因包含抗CD19单抗ScFV、CD28跨膜区和4-1BB、CD3ζ、C5aR胞内区，即CD19ScFv-4-1BB-CD3ζ-C5aR(CAR19C5aR)，C5aR为NCBI Reference Sequence:NM_001736.3核酸系列的一部分或全部。(图1)

实施例2CAR质粒的慢病毒包装

使用实施例1制备的本发明CAR质粒以及相关对照质粒、通过慢病毒包装，获得分别表达GFP(空白对照)、CAR19-GFP(对照)、CAR19C5aR-GFP的三种慢病毒。本实施例2和3中，将含CAR质粒统一描述为为pWPXLd-CAR-GFP质粒，将过表达CAR的慢病毒统一描述为CAR慢病毒。

具体步骤如下:

(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为：DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；

(2)待150mm培养皿中的293T细胞密度达80-90％时，更换培养基：DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；

(3)更换培养基培养2-6小时后，用PEI分别将pWPXLd-CAR-GFP二种质粒(即，分别包含CAR19、CAR19C5aR)或空白对照质粒pWPXLd-GFP分别与慢病毒包装辅助质粒pMD2.G、psPAX2共同转导入293T细胞，加入试剂及剂量如下表1：

表1

试剂	剂量
		pWPXLd-CAR-GFP二种质粒或对照质粒	9ug
pMD2.G辅助质粒	3ug
		psPAX2	12ug
PEI	72ug

(4)分别转化后24、48和72小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基(DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗)；

(5)培养基上清收集完毕，将上清2500g离心0.5小时后；

(6)取离心上清，用0.45um过滤器过滤后，利用超高速离心机28000rpm离心1.5小时；

(7)超高速离心后，轻轻去除上清，加入200ul PBS，置于4度12-16小时溶解，即得2种CAR慢病毒或空白对照GFP慢病毒；

(8)病毒溶解后，收集病毒分装于冻存管，冻存于-80℃待用。

实施例3使用包装的CAR病毒感染人体T细胞

(1)T细胞的分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞，经红细胞裂解液裂解去除红细胞后，再通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

(2)分选出来的T细胞用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/ml+链霉素0.1mg/ml)稀释至细胞浓度2.5×10⁶个/ml待用；

(3)通过包被CD2、CD3、CD28抗体的磁珠(产品来源：德国美天旎)刺激T细胞，即包被磁珠与T细胞以1∶2比例混合，T细胞最终密度应为5×10⁶个/ml/cm2。混合后，置于37℃、5％CO2培养箱培养刺激48小时。

(4)慢病毒转染T细胞：将激活的T细胞-磁珠混合液中的磁珠通过磁场作用去除，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入表达CAR和GFP(空白对照)慢病毒(病毒加入量为MOI＝10)后，加入8μg/ml的polybrene和300IU/ml IL-2。置于37℃，5％CO2培养箱培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/ml IL-2的新鲜培养基重悬，即得过表达CAR的T细胞。

(5)CAR T细胞扩增：将CAR T细胞密度维持在1×10⁶个/ml左右，每2-3天进行一次半量换液。两周后，CAR T细胞数可扩增100倍。

实施例4 C5aR代替GFP检测CAR-T细胞数

GFP是目前检测CAR-T细胞数的精确方法，但因GFP为异种蛋白，可能产生抗CAR-T抗体，导致CAR-T细胞功能受损。将CAR19C5aR同时表达GFP，验证C5aR是否可以代GFP做为检测。

具体步骤为：1.准备效应细胞(对照组T细胞或CAR T细胞)；其中一部分加入2mlPBS洗涤，300g离心5min，去除上清，加入300ul PBS上机检测GFP。其中一部分加入表面抗体5ul CD3及相对应同型抗体，4℃避光孵育30min，加入1ml PBS洗涤，300g离心5min，去除上清，加入破膜固定剂(ebioscience公司，破膜剂：稀释液＝1:3，新鲜配制)1ml，4℃避光孵育35min。2.35min后加入2ml破膜缓冲液(缓冲液：纯水＝1:9)，混匀，300g离心5min。3.去上清，加入C5AR抗体5ul，4℃避光孵育30min。4.30min后加入2mlPBE洗涤，300g离心5min。5.每管加入400ulPBS重悬上机检测C5aR。结果显示C5aR与GFP检测效能一致，可以代替GFP，用于检测CAR-T细胞数。(图2a～图2b、图3a～图3b)

实施例5 CAR T细胞体外识别杀伤肿瘤的效应

将实施例3制备的GFP T(空白对照)、CAR19-GFP T(对照)、CAR19C5aR-GFP T细胞以不同比例分别与5x10⁴的肿瘤细胞混合，加入到96孔U型板中，每组设3个复孔，并设单独加肿瘤细胞组作为阳性对照，250g离心5min后，置于37度5％CO2培养箱共培养24h；体外比较GFP T、CAR19-GFP T、CAR19C5aR-GFP T细胞对血液肿瘤的识别杀伤功能时，肿瘤细胞选用NALM6-GL白血病细胞系。

CFSE/PI双染细胞毒性检测方法评估定量评估杀伤效率：1.准备效应细胞(GFP T(空白对照)、CAR19-GFP T(对照)、CAR19C5aR-GFP T细胞)和靶细胞，计数，将CAR T细胞的GFP％用同一批次的WT细胞进行校准，使各组GFP％大小相近；用1640+10％FBS+1％P/S培养基稀释T细胞8x10⁶/ml。2.所需量的靶细胞Nalm6细胞，1ml 1640培养基重悬，加入5umolCSFE，37℃避光孵育20min后，加入10ml培养基终止5min，离心，去上清，靶细胞稀释为5x10⁵/ml。3.将T细胞进行倍比稀释，用排枪在V型底96孔板内预先加入100ul新鲜培养基，第一排不加，然后第一排加入T细胞100ul，第二排加入T细胞100ul，然后用排枪吹打第二排5次以上，吸取100ul放入第三排，以此类推，将T细胞顺着排数进行倍比稀释，全部孔内加入100ul靶细胞，使T细胞与靶细胞以不同比例混合(16:1，8:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4)。4.将混合好的细胞放培养箱内培养24小时。5.将96孔板内的细胞吸取，离心。6.用4℃的PBS洗涤一次，加入100ul 1x IP Buffer，再加入5ul PI，避光孵育15min后，再加入200ul 1x IPBuffer，1小时内上机检测。7.杀伤率计算：以不加T细胞的靶细胞孔作为参照，杀伤百分比＝目的孔CSFE+PI+％-对照孔CSFE+PI+％。结果表明，CAR19C5aR T和对表达CD19的肿瘤靶细胞的体外杀伤效率都显著高于CAR19T细胞(图4)。

通过以上实验结果，我们发明一种新的检测CAR-T细胞数的方法，引入C5aR胞内信号传导结构域可以有效检测CAR-T细胞数，还可以显著提高肿瘤靶细胞的体外杀伤效率，为CAR-T细胞治疗领域提供一种新的思路和选择。

申请人声明通过上述实施实例来说明本发明的产品、用途及其使用方式，但本发明并不局限于上述详细用途或使用方式，即不意味着本发明必须依赖上述详细用途和使用方式才能实验。所属技术领域的人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广东省人民医院（广东省医学科学院）

<120> 一种检测CAR-T细胞数的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 410

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

cttgggcagg agggaccttc gatcctcggg gagcccagga gaccagaaca tgaactcctt 60

caattatacc acccctgatt atgggcacta tgatgacaag gataccctgg acctcaacac 120

ccctgtggat aaaacttcta acacgctgcg tgttccagac atcctggcct tggtcatctt 180

tgcagtcgtc ttcctggtgg gagtgctggg caatgccctg gtggtctggg tgacggcatt 240

cgaggccaag cggaccatca atgccatctg gttcctcaac ttggcggtag ccgacttcct 300

ctcctgcctg gcgctgccca tcttgttcac gtccattgta cagcatcacc actggccctt 360

tggcggggcc gcctgcagca tcctgccctc cctcatcctg ctcaacatgt 410

Claims (7)

1.一种检测CAR-T细胞数的方法，其特征在于：在CAR-T分子胞内引入C5aR胞内结构域，检测C5aR的表达率从而获得CAR-T细胞数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：构建一种嵌合抗原受体，其包含能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，所述至少一个胞内结构域是指C5aR胞内结构域，或与C5aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：与C5aR胞内结构域串联的信号传递区域的胞内结构域选自CD3ζ、CD28、4-1BB中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述胞内结构域还包括CD3ζ胞内结构域，所述C5aR胞内结构域配置在CD3ζ胞内结构域的C末端侧。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述胞内结构域为自N末端侧开始依次连接的4-1BB胞内结构域、CD3ζ胞内结构域和C5aR胞内结构域。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述C5aR含有如序列表1所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过破膜剂将CAR-T细胞破膜，通过流式方法检测T细胞内C5aR表达率，即为CAR-T细胞数。

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