CN111925957A - 一种矿化微生物增量制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种矿化微生物增量制备方法，可用于量大面广的工程材料领域，如岩土工程、环境岩土工程、废渣利用和水泥基材料。首先将矿化微生物接种到种子罐中培养，种子罐中每升培养基含有牛肉膏2～5g，蛋白胨3～8g、铵盐0～3g、钠盐3～8g，金属离子选用锰离子、镁离子、锌离子等的一种或几种，以达到促进矿化微生物向芽孢转化的目的；当种子罐中细胞总数达到(1～3)×108个/mL时，接种到大容量发酵罐中增量培养；当增量培养的细胞总数达到(1～3)×108个/mL后，通过喷雾干燥技术制备矿化微生物菌粉。该矿化微生物增量培养后活性未发生变化，便于保存，可直接使用。

Description

一种矿化微生物增量制备方法
技术领域
本发明属于微生物学和土木工程材料领域的交叉科学技术，具体涉及一种矿化微生物增量制备方法，可用于岩土工程、环境岩土工程、废渣利用和水泥基材料领域。
背景技术
研究者受自然界中微生物成岩现象启发，提出一种绿色、温和的微生物矿化技术，可用于量大面广的工程材料领域，如岩土工程、环境岩土工程、废渣利用和水泥基材料。在岩土工程领域，微生物矿化技术可有效固结砂粒，降低砂体孔隙和渗透系数，在边坡防护、土壤胶结等方面具有显著效果。在环境岩土工程领域，利用微生物矿化技术，可有效沉淀重金属离子或形成共沉淀结合态，从而实现重金属污染土壤和水体的修复，效果显著。在废渣利用领域，微生物矿化技术可有效增强再生骨料性能；针对钢渣在建材中的利用，微生物方法可有效提高钢渣中钙镁离子利用效率。在水泥基材料领域，微生物诱导碳酸钙沉积可对混凝土裂缝进行有效封堵，提高耐久性，实现混凝土自修复；同时微生物矿化技术可用于制备自清洁混凝土，提高混凝土表观质量，使得混凝土材料既美观又实用。
近年来微生物矿化技术在世界范围内得到了广泛关注，但仍存在诸多问题急需解决，如矿化微生物的增量制备方法，以获得便于保存的矿化微生物并提高其存活率，促进微生物矿化技术在工程材料领域的推广应用。
发明内容
发明目的：为了矿化微生物能更好的保存和提高微生物在工程材料中的存活率，本发明提出一种矿化微生物增量制备方法，以促进温和、绿色的微生物技术在工程材料领域中的推广应用。
技术方案：本发明所述的一种矿化微生物增量制备方法，通过将矿化微生物接种至培养基中增量培养，至菌液中细胞总数为(1～3)×108个/mL，喷雾干燥制备矿化微生物菌粉，并验证矿化能力；其中，所述培养基成分包括牛肉膏、蛋白胨、铵盐、钠盐、金属离子。
所述矿化微生物可产芽孢，能诱导矿化产物生成，对人体无害且生态性良好。
所述培养基成分包括牛肉膏、蛋白胨、铵盐、钠盐、金属离子，通过添加金属离子可促进耐碱性矿化微生物向芽孢进行转化；其中，每升培养基含有牛肉膏2～5g，蛋白胨3～8g、铵盐0～3g、钠盐3～8g。
所述金属离子包括锰离子、镁离子、锌离子等的一种或几种。其中优选的锰离子由5-10mg一水合硫酸锰提供，镁离子由0.10-0.15g六水合氯化镁提供，锌离子由0.1-0.2g氯化锌提供。
进一步的，所述增量培养过程为：先在灭菌小容量种子罐中接种培养矿化微生物，当细胞总数达到(1～3)×108个/mL后接种到灭菌大容量发酵罐中。即先在小容量发酵罐培养至菌液中细胞总数约为(1～3)×108个/mL，然后将小容量发酵罐作为种子罐，取出培养至要求细胞数量的菌液，在大容量发酵罐中接种培养，培养至菌液中细胞总数约为(1～3)×108个/mL。
其中，所述发酵罐灭菌处理过程为：首先对空气过滤器灭菌，保持压力为0.10～0.11MPa，灭菌20-30min；随后对发酵罐灭菌，温度为115-125℃。发酵罐冷却方式可为自然冷却或冷却水加速冷却。
本申请中，所述细胞总数测试方法包括血球计数板计数法、流式细胞仪法或OD值法。
所述干燥技术优选喷雾干燥技术，其特点是：瞬间干燥，产品质量好，可根据需要调节和控制产品质量指标等。
所述微生物矿化能力验证方法为：在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和底物，并置于25-30℃振荡培养箱中培养，3-5d后取出，对沉淀产物进行验证。其中，所述底物属于有机钙源。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明采用的矿化微生物可产芽孢，适用于工程材料领域，对人体无害且生态性良好；
(2)本发明通过培养基优化，特别是添加金属盐离子，以达到促进芽孢转化的目的，且效果优异；
(3)本发明提出了一种矿化微生物增量制备方法，且该方法不影响矿化微生物活性，便于保存，可直接掺加到工程材料中使用，可用于岩土工程、环境岩土工程、废渣利用和水泥基材料领域。
附图说明
图1为采用倒置荧光显微镜观测的矿化微生物形貌图；
图2为不同培养方式获取微生物的生长繁殖曲线；
图3矿化微生物芽孢的SEM图像；
图4为沉淀产物示意图；
图5为沉淀产物的SEM图像和EDS结果。
具体实施方式
为更好的理解本发明，将结合具体实施例进一步阐述本发明所述内容。
本发明提供一种矿化微生物增量制备方法，具体操作过程如下：
1.对小容量发酵罐进行灭菌处理，包括空气过滤器和空发酵罐的灭菌，灭菌后通过自然冷却或冷却水加速冷却后备用；
2.在小容量发酵罐中，将矿化微生物接种至灭菌后培养基中培养；其中培养基成分包括牛肉膏、蛋白胨、铵盐、钠盐、金属离子，金属离子可促进矿化微生物向芽孢进行转化；培养基需在121℃条件下灭菌30min；培养过程中每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，直至细胞总数约为(1～3)×108个/mL后停止培养；
3.对大容量发酵罐进行灭菌处理，包括空气过滤器和空发酵罐的灭菌，灭菌后通过自然冷却或冷却水加速冷却后备用；
4.将小容量发酵罐作为种子罐，取出培养至要求细胞数量的菌液，在大容量发酵罐中接种培养，培养至菌液中细胞总数约为(1～3)×108个/mL后停止培养；
5.将增量制备的矿化微生物菌液通过喷雾干燥技术制备为菌粉保存；
6.在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和有机钙源，并置于30℃振荡培养箱中培养，4d后取出，对沉淀产物进行验证。
实施例1：
(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，MgCl2·6H2O0.1g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min；
(2)在小容量发酵罐中接种矿化微生物培养，每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.59×108个/mL，采用倒置荧光显微镜观测的矿化微生物形貌如图1所示，可见试验选取的矿化微生物外形为杆状。停止培养接种至大容量发酵罐；在大容量发酵罐中每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.52×108个/mL，停止培养，由图2中不同培养方式获取的微生物生长繁殖曲线可见，增量制备方法不影响矿化微生物活性。将获得的发酵液通过喷雾干燥技术制备成芽孢，微结构如图3所示。
(3)在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和有机钙源，并置于30℃振荡培养箱中培养，4d后取出，形成沉淀产物如图4所示，可见孔隙溶液中矿化微生物可诱导沉淀生成，最后对沉淀产物进行验证。由图5中SEM/EDS结果可见，沉淀产物主要元素为C、O、Ca，沉淀产物为生物碳酸钙，可见该微生物具有诱导矿化产物沉积的能力。
实施例2：
(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NH4Cl2.8g/L，NaCl5g/L，MgCl2·6H2O0.12g/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min；
(2)在小容量发酵罐中接种矿化微生物培养，每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.65×108个/mL，停止培养接种至大容量发酵罐；在大容量发酵罐中每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.71×108个/mL，停止培养，通过喷雾干燥技术制备成芽孢；
(3)在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和有机钙源，并置于30℃振荡培养箱中培养，4d后取出，对沉淀产物进行验证。通过SEM/EDS验证其为碳酸钙。
实施例3：
(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，MnSO4·H2O5mg/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min；
(2)在小容量发酵罐中接种矿化微生物培养，每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.75×108个/mL，停止培养接种至大容量发酵罐；在大容量发酵罐中每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.77×108个/mL，停止培养，通过喷雾干燥技术制备成芽孢；
(3)在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和有机钙源，并置于30℃振荡培养箱中培养，4d后取出，对沉淀产物进行验证。通过SEM/EDS验证其为碳酸钙。
实施例4：
(1)称取牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，MnSO4·H2O10mg/L，配置成液体培养基，在121℃条件下灭菌30min；
(2)在小容量发酵罐中接种矿化微生物培养，每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.81×108个/mL，停止培养接种至大容量发酵罐；在大容量发酵罐中每间隔2h从发酵罐中取样，测试菌液中细胞总数，当培养时间为24h时，测得细胞总数为1.82×108个/mL，停止培养，通过喷雾干燥技术制备成芽孢；
(3)在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和有机钙源，并置于30℃振荡培养箱中培养，4d后取出，对沉淀产物进行验证。通过SEM/EDS验证其为碳酸钙。

Claims (10)

1.一种矿化微生物增量制备方法，其特征在于，将矿化微生物接种至培养基中增量培养，至菌液中细胞总数为(1～3)×108个/mL，喷雾干燥制备成矿化微生物菌粉，并验证矿化能力；其中，所述培养基成分包括牛肉膏、蛋白胨、铵盐、钠盐、金属离子。
2.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述矿化微生物可产芽孢，能诱导矿化产物生成，对人体无害且生态性良好。
3.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，每升培养基含有牛肉膏2～5g，蛋白胨3～8g、铵盐0～3g、钠盐3～8g。
4.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述金属离子包括锰离子、镁离子、锌离子等的一种或几种其中，所述锰离子由5-10mg一水合硫酸锰提供，镁离子由0.10-0.15g六水合氯化镁提供，锌离子由0.1-0.2g氯化锌提供。
5.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述增量培养过程为：先在灭菌小容量种子罐中接种培养矿化微生物，当细胞总数达到(1～3)×108个/mL后接种到灭菌大容量发酵罐中。
6.根据权利要求5所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，发酵罐灭菌处理过程为：首先对空气过滤器灭菌，保持压力为0.10～0.11MPa，灭菌20-30min；随后对发酵罐灭菌，温度为115-125℃。
7.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述细胞总数测试方法包括血球计数板计数法、流式细胞仪法或OD值法。
8.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述干燥技术优选喷雾干燥技术。
9.根据权利要求1所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述微生物矿化能力验证方法为：在模拟孔隙溶液中掺加矿化微生物和底物，并置于25-30℃振荡培养箱中培养，3-5d后取出，对沉淀产物进行验证。
10.根据权利要求9所述的矿化微生物增量制备方法，其特征在于，所述底物属于有机钙源。
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