CN111925944A - 一种短密青霉菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种霉菌及其用途，涉及微生物技术领域。本发明的菌株命名为W‑B23,所述霉菌菌株为具有纤维素降解能力的短密青霉(Penicillium brevicompactum)。其形态特征：在PDA培养基上培养，菌落形状近圆形，深绿色，***为白色，表面绒毛状，产孢结构大量形成，菌落背面青黑色，无水溶性色素。本发明能高效降解纤维素。

Description

一种短密青霉菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种短密青霉菌，同时涉及该短密 青霉菌在降解纤维素中的用途。
背景技术
纤维素是世界上最丰富也是最重要的可再生资源，利用微生物生产的纤维 素酶将纤维素降解为单糖，再转化为能源、食物和化工原料等，均可以为人类 解决环境污染和资源短缺等问题。
自然界中各种各样的生物都能生产纤维素酶，微生物包括细菌、霉菌和放 线菌等，还有植物和动物来源。
相比于其它产纤维素酶的微生物，霉菌具有以下优点：一、产生的纤维素 酶为胞外酶，便于分离和提取；二、产酶效率高，且生产的纤维素酶酶系结构 较为合理。从工业化制备及应用纤维素酶的角度出发，研究和采用霉菌产酶具 有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的霉菌，其属于短密青霉菌属。
本发明的一种短密青霉菌，其形态特征：在PDA培养基上培养，菌落形状 近圆形，深绿色，***为白色，表面绒毛状，产孢结构大量形成，菌落背面青 黑色，无水溶性色素。
该菌种已于2020年6月4日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)， 保藏号：CGMCC NO：19908，名称：短密青霉(Penicillium brevicompactum) W-B23。
本发明的一种短密青霉(Penicillium brevicompactum)W-B23的分离，包 括以下步骤：
(一)对短密青霉的分离：
称取霉变果屑样品5g，置于盛有90mL无菌生理盐水且含玻璃珠的三角瓶 中，28℃，180r/min震荡60min。取上清作为10-1，依次稀释至10-2，10-3，10-4， 10-5。吸取100μL稀释好的菌液涂布初筛培养基平板。将涂布好的平板置于28℃ 恒温培养箱中培养4-5d。用接种环挑取分离出的单菌落在PDA培养基平板上 涂布纯化，并置于28℃下培养至长出单菌落。挑取单菌落点种在PDA培养基斜 面上，28℃下培养，4℃保存。将保种菌株平板涂布活化后，挑取单菌落在产酶 筛选培养基平板上点种，分离温度下培养3-5d。培养结束后在平板上滴加1-2mL 1mg/ml的刚果红染液染色30min(尽量避免滴加到菌落上)，用1mol/L的NaCl 溶液脱色30min后，测量菌落直径(d)与水解圈直径(D)，并计算D/d的比值， 以此判断所分离菌株对纤维素的分解能力。选出D/d比值较高的菌株，进行编 号。
(二)培养基：
初筛培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离 子水1000mL，自然pH。
产纤维素酶筛选培养基：CMC-Na(羧甲基纤维素钠)6g，蛋白胨0.75 g，Na2HPO40.75g，KH2PO4 0.45g，琼脂6g，去离子水300mL，自 然pH。
产纤维素酶发酵液：液体产酶培养基：CMC-Na 10g，蛋白胨3.0g，酵 母膏0.2g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3g，去离子水1000mL。
(三)菌种的保种和传代：
1.菌种保藏培养基：
PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离子 水1000mL，自然pH。
2.保存方法：
(1)斜面低温保藏法：将分离纯化后的菌株转接种至斜面PDA培养基上， 置于恒温培养箱中28℃培养7d，菌落长满试管斜面，观察确认没有污染，将菌 种放入于4℃的冰箱中保存。这种保藏方法适合实验条件下各菌种的保藏，保藏 时间一般为三个月到六个月，且传代培养次数过多时容易导致菌株发生变异与 退化。
(2)甘油保存法：接种接种针挑取纯化后的菌丝的孢子，分别接种于装有 100mL新配制PDB的250mL三角瓶中，放置于转速设置为180rpm的恒温摇床上 28℃培养7d后，取500μL菌液转移至1.5mL离心管中，再加入300μL 50％甘 油，在1.5mL离心管的管壁贴上菌株编号标签，然后放入-20℃冰箱内保藏。此 种方法法保存分离菌株的时间要比试管斜面保存法的更长，可以保藏1-2年。
菌种的生态特征：
该菌形成的菌落在PDA培养基上，28℃培养7d，菌落形状近圆形，深绿色， ***为白色，表面绒毛状，产孢结构大量形成，菌落背面青黑色，无水溶性色 素。
菌种的培养特性：
(1)培养温度20℃～30℃，最适温度28℃～30℃；
(2)培养pH 6～7.5，最佳范围为6.5～7.2。
根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征及相关分子生物学鉴别实验，参 照《真菌鉴定手册》鉴定该霉菌菌株为短密青霉。
本发明的一种短密青霉菌在降解纤维素中的用途。
与现有技术相比，本发明发现了一种对纤维素有较强降解能力的菌株。本 发明的菌株经液体发酵产生的纤维素酶酶活较现有工业产酶菌株酶活更高。
说明书附图
图1是短密青霉W-B23、康宁木霉40108滤纸酶活曲线；
图2是短密青霉W-B23、康宁木霉40108羧甲基纤维素(CMC)酶活曲线。
具体实施方式
本发明一种短密青霉(Penicillium brevicompactum)W-B23的分离，包 括以下步骤：
(一)对短密青霉的分离：
称取霉变果屑样品5g，置于盛有90mL无菌生理盐水且含玻璃珠的三角瓶 中，28℃，180r/min震荡60min。取上清作为10-1，依次稀释至10-2，10-3，10-4， 10-5。吸取100μL稀释好的菌液涂布初筛培养基平板。将涂布好的平板置于28℃ 恒温培养箱中培养4-5d。用接种环挑取分离出的单菌落在PDA培养基平板上涂 布纯化，并置于28℃下培养至长出单菌落。挑取单菌落点种在PDA培养基斜面 上，28℃下培养，4℃保存。将保种菌株平板涂布活化后，挑取单菌落在产酶筛 选培养基平板上点种，分离温度下培养3-5d。培养结束后在平板上滴加1-2mL 1mg/ml的刚果红染液染色30min(尽量避免滴加到菌落上)，用1mol/L的NaCl 溶液脱色30min后，测量菌落直径(d)与水解圈直径(D)，并计算D/d的比值， 以此判断所分离菌株对纤维素的分解能力。选出D/d比值较高的菌株，进行编 号。
(二)培养基：
初筛培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离 子水1000mL，自然pH。
产纤维素酶筛选培养基：CMC-Na(羧甲基纤维素钠)6g，蛋白胨0.75 g，Na2HPO40.75g，KH2PO4 0.45g，琼脂6g，去离子水300mL，自 然pH。
产纤维素酶发酵液：液体产酶培养基：CMC-Na 10g，蛋白胨3.0g，酵 母膏0.2g，KH2PO44.0 g，MgSO4·7H2O 0.3g，去离子水1000mL。
(三)菌种的保种和传代：
1.菌种保藏培养基：
PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离子 水1000mL，自然pH。
2.保存方法：
(1)斜面低温保藏法：将分离纯化后的菌株转接种至斜面PDA培养基上， 置于恒温培养箱中28℃培养7d，菌落长满试管斜面，观察确认没有污染，将菌 种放入于4℃的冰箱中保存。这种保藏方法适合实验条件下各菌种的保藏，保藏 时间一般为三个月到六个月，且传代培养次数过多时容易导致菌株发生变异与 退化。
(2)甘油保存法：接种接种针挑取纯化后的菌丝的孢子，分别接种于装有 100mL新配制PDB的250mL三角瓶中，放置于转速设置为180rpm的恒温摇床上 28℃培养7d后，取500μL菌液转移至1.5mL离心管中，再加入300μL 50％甘 油，在1.5mL离心管的管壁贴上菌株编号标签，然后放入-20℃冰箱内保藏。此 种方法法保存分离菌株的时间要比试管斜面保存法的更长，可以保藏1-2年。
菌种的生态特征：
该菌形成的菌落在PDA培养基上，28℃培养7d，菌落形状近圆形，深绿色， ***为白色，表面绒毛状，产孢结构大量形成，菌落背面青黑色，无水溶性色 素。
菌种的培养特性：
(1)培养温度20℃～30℃，最适温度28℃～30℃；
(2)培养pH 6～7.5，最佳范围为6.5～7.2。
根据菌株的菌落形态特征、菌体形态特征及相关分子生物学鉴别实验，参 照《真菌鉴定手册》鉴定该菌株为短密青霉。
试验例1：分解纤维素能力测定
采用DNS法分别以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和滤纸为底物，检测本发明 菌株短密青霉W-B23与工业菌株康宁木霉40108粗酶液的纤维素酶酶活。
具体步骤如下：
DNS试剂制备：取6.3g 3，5-二硝基水杨酸、21g NaOH、182.0g酒石酸钾 钠、5.0g苯酚、5.0g亚硫酸钠，分别用去离子水溶解后混合，待混合液冷却至 室温定容至1000mL。保存在棕色瓶屮，在室温下放置7d后即可使用。
(酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3， 5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21g，苯酚5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至 1000ml，贮于棕色瓶中，室温保存7d后使用。
但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或 者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中， 溶液加热温度不宜超过50摄氏度。)
葡萄糖标准曲线：取10支25mL的比色管，分别移加0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL的1mg/mL的葡萄糖标准溶液，用去离子水补加至 体积均为2.0mL，对照管中加入2.0mL去离子水，然后沿壁往各管中加入DNS试 剂3.0mL煮沸5min，马上流水冷却，去离子水定容至25mL，加盖摇匀后，于 波长540nm下测定各试样的吸光度A540，以各管中葡萄糖含量和A540值回归 曲线。做出葡萄糖标准曲线后，由待测样的A540值即可计算葡萄糖浓度。
羧甲基纤维素(CMC)酶活测定：取0.5mL粗酶液，加1mL CMC-Na柠檬酸 缓冲液，混匀后，于50℃水浴30min，然后加入DNS显色液3mL，沸水浴10min， 冷却，540nm处测吸光度。
同时使用100℃煮沸10min后失活的酶液做对照，其他步骤相同。
滤纸酶活测定：取0.5mL的粗酶液，加入pH4.8 0.1mol/mL柠檬酸－柠檬 酸钠缓冲液1mL，加入一条滤纸(1cm*6cm)于带塞试管中，50℃水浴1h，然 后加入DNS显色液3mL，沸水浴10min显色，冷却至室温，加蒸馏水定容至10mL， 混匀，静置20min，540nm处测吸光度。
同时用100℃煮沸10min后失活的酶液做对照，其他步骤相同。
得到的吸光度值根据葡萄糖标准曲线得到对应的还原糖浓度，从而计算出 纤维素酶酶活。
酶活计算公式如下所示：
Figure BDA0002572528890000061
U:纤维素酶酶活力；
n：稀释倍数
180.16：葡萄糖分子量
t：反应时间，min
v：酶液体积，mL
结果表明，所分离的短密青霉W-B23在发酵第8天滤纸酶活达到最高，为 3.15U/ml；第8天时CMC酶活达到最高，为2.23U/ml。而工业产纤维素酶菌株 40108(康宁木霉)最高滤纸酶活及CMC酶活分别为2.16U/ml，0.85U/ml。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的 限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例 所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种短密青霉菌，其特征在于：所述霉菌菌种的保藏号为CCC NO：19908，名称：短密青霉(Penicillium brevicompactum)W-B23。
2.根据权利要求1所述的一种短密青霉菌，其特征在于：所述的霉菌菌落形状近圆形，深绿色，***为白色，表面绒毛状，产孢结构大量形成，菌落背面青黑色，无水溶性色素。
3.根据权利要求1所述的一种短密青霉菌，其特征在于：所述的霉菌菌种的培养特性：
(1)培养温度20℃～30℃，最适温度28℃～30℃；
(2)培养pH 6～7.5，最佳范围为6.5～7.2。
4.根据权利要求1所述的一种短密青霉菌，其特征在于：所述的霉菌菌种的保存方法：
(1)斜面低温保藏法：将分离纯化后的菌株转接种至斜面PDA培养基上，置于恒温培养箱中28℃培养7d，菌落长满试管斜面，观察确认没有污染，将菌种放入于4℃的冰箱中保存，保藏时间为三个月到六个月，且传代培养次数过多时容易导致菌株发生变异与退化；
或(2)甘油保存法：接种接种针挑取纯化后的菌丝的孢子，分别接种于装有新配制PDB的瓶中，放置于转速设置为180rpm的恒温摇床上28℃培养7d后，取菌液转移至离心管中，再加入体积比3:5的50％甘油，然后放入-20℃冰箱内保藏，保藏时间1-2年。
5.如权利要求1所述的短密青霉在纤维素降解中的用途。
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