CN111912892B

CN111912892B - 气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化及相关酶分析中的应用

Info

Publication number: CN111912892B
Application number: CN201910375230.9A
Authority: CN
Inventors: 龙亿涛; 应佚伦; 蒋杰; 李孟寅; 杨洁; 于汝佳
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN111912892A

Abstract

本发明公开了一种气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化及相关酶分析中的应用。具体为构建气单胞菌溶素纳米孔通道，并在构建的气单胞菌溶素纳米孔通道的两端施加电压，将待测物或待测物相关探针分子加入检测池的一端，在电压的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号及阻断电流时间，通过对阻断电流信号及阻断电流时间进行比较分析，获得待测分子相应的检测信息。本发明公开了气单胞菌溶素纳米孔通道的新用途，可以将其用于核酸、多肽、蛋白的磷酸化检测分析，不需要DNA马达蛋白，灵敏度高，检测方便，且可进一步实现对激酶、磷酸酶、酶抑制剂等多种酶的活性分析和定量分析，并可实现酶活的实时监测。

Description

气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化及相关酶分析中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及气单胞菌溶素纳米孔在生物磷酸化及相关酶分析中的应用。

背景技术

DNA或蛋白的磷酸化以及去磷酸化是核酸代谢过程中非常重要的两个过程。其中DNA 3'端异常磷酸化或5'端去磷酸化都与阿尔茨海默病和癌症等疾病有关。因此对DNA或蛋白磷酸化及去磷酸化的精准分析至关重要。其中DNA磷酸化及去磷酸化主要包括四种不同状态：5'末端磷酸化，5'末端去磷酸化，3'末端磷酸化和3'末端去磷酸化。目前对于DNA或蛋白磷酸化及去磷酸化的检测手段主要有高分辨率质谱，荧光和放射性同位素标记等方法，然而，质谱的方法通常在确定DNA上的磷酸化位点时电离效率低，聚合酶链式反应(PCR)的方法样品未经预处理也会将误差引入最终质谱的结果中；此外，标记的方法受限于复杂的标记过程以及磷酸化抗体的低特异性，仅能反映出DNA 3'或5'端单个磷酸化的状态。因此对于单个DNA分子、蛋白分子、多肽分子多种磷酸化状态的直接识别仍面临巨大的挑战，目前理想的方法是单分子分析的手段。

现有技术中，α-溶血素纳米孔已被用于分辨单个DNA分子，但对于DNA分子的多个磷酸化的状态的识别灵敏度不够；而对于CsgG纳米孔，由于其对DNA马达蛋白的需求，无法满足同时检测DNA磷酸化状态和DNA测序的双重需要。因此，目前的研究方向主要是探索有效的纳米孔传感界面，使其与DNA的带电基团具有稳固的相互作用，实现多种磷酸化状态的直接测定。

可逆磷酸化的过程在调节几乎所有生物学功能中起着至关重要的作用，体内DNA/蛋白质的磷酸化水平主要通过激酶和磷酸酶调节，且信号传导过程需要多种激酶和磷酸酶共同作用。虽然长期的研究已经表明了激酶和磷酸酶的重要性，但动态磷酸化的过程、多种激酶和磷酸酶共同作用的研究仍然是一个巨大的挑战。为了充分理解这种动态复杂过程，目前亟需一种同时分辨、表征激酶和磷酸酶同步介导细胞磷酸化的过程。目前对于激酶和磷酸酶活性的评估的方法主要有放射性测定、荧光、电化学、表面等离子体共振和质谱等方法，但这些方法仅对一种酶(激酶或磷酸酶)或一种底物(DNA或蛋白质)有效，此外，以上方法还分别有如下局限：有害的放射性标记；复杂且昂贵的荧光标记肽，检测步骤繁多，反应物接触不充分以及特异性识别蛋白昂贵，因此，以上方法很难发展成一种不受底物限制同时评估激酶和磷酸酶效力的普适性方法，更加无法在单分子水平上实现激酶/磷酸酶信号通路抑制剂的筛选以及催化磷酸化过程的实时监测。因此开发同时适用于激酶和磷酸酶对DNA、多肽和蛋白质磷酸化催化过程的检测方法仍然是一个巨大的挑战。

已有报道的一些纳米孔可用于研究不同抑制剂及底物对激酶效力的影响，但需要将激酶底物肽通过基因工程技术编码至生物纳米孔上或通过化学修饰的方法将相应的DNA序列连至底物模型上。此外，先前的报道利用α-溶血素作为纳米孔，但该纳米孔与DNA分子相互作用弱，DNA分子极易穿过纳米孔而对于磷酸化状态的检测不够灵敏。因此，目前亟需一种有效的纳米孔传感界面使其与磷酸化基团有较强的相互作用，从而实现对DNA或蛋白质底物磷酸化/去磷酸化的直接检测，进一步实现在相关酶分析中的应用。

公告号CN 104651500 B的发明专利公开了一种气单胞菌溶素纳米孔通道，它能够在水溶液中自组装形成七聚体结构并经过构象变化***磷脂膜中，形成纳米尺寸的通道，可以应用于DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术中的问题，本发明提供了气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或/和相关酶的分析检测中的应用，提供了气单胞菌溶素纳米孔通道的新用途。

技术方案：本发明提供了气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或/和相关酶的分析检测中的应用。

其中，生物磷酸化的分析检测包括核酸磷酸化、核酸去磷酸化、多肽磷酸化、多肽去磷酸化、蛋白磷酸化和蛋白去磷酸化的分析检测(如磷酸化位置、磷酸化程度等)中的一种或几种；相关酶即生物磷酸化的相关酶，相关酶的分析检测包括酶活性分析、酶活实时监测和酶定量分析中的一种或几种。

所述核酸磷酸化包括5'末端磷酸化或/和3'末端磷酸化，所述核酸去磷酸化包括5'末端去磷酸化或/和3'末端去磷酸化。

所述的核酸为1～10kbp如1-20bp、5-50bp、10～100bp、1k～3kbp的DNA或RNA；核酸为1～10kbp的DNA或RNA；多肽长度为2～100个如2～20、10～50、50～80个氨基酸；蛋白分子量为1～500kDa；所述的相关酶为水解酶、激酶、磷酸酶、酶抑制剂、磷酸化酶、磷酸酯酶或糖基转移酶。

核酸例如DNA 3'或5'端的磷酸化的过程会显著降低该端(即磷酸化的一端)首先进入气单胞菌溶素纳米孔产生的阻断电流信号的阻断时间，因此，核苷酸的每个末端的磷酸化或去磷酸化过程可以从PI/PII的持续时间直接读出。主要是由于核酸末端磷酸化会在其相应的末端增加了两个负电荷，使其在检测体系下受到更大的电场力，从而加速了该端率先进入纳米孔的穿孔事件速度，从而大大降低该电流阻断信号的阻断时间，而对于另外未磷酸化的一端率先进入纳米孔的穿孔事件速度影响不大，因此该电流阻断信号的阻断时间未表现出明显的变化。

未磷酸化的多肽在施加正电位的情况下很难产生阻断电流信号，从而在阻断时间-阻断电流的散点图上分布较少，当多肽被磷酸化后，其进入气单胞菌溶素纳米孔的电泳力增强，产生较多阻断电流信号，因此可以通过多肽磷酸化前后穿孔的事件频率来评估多肽磷酸化程度。

磷酸酶如碱性磷酸酶可催化核酸分子脱掉磷酸基团，使DNA或RNA末端的磷酸基团转换成羟基，而激酶可以将磷酸基团转移至底物上，研究发现在反应前后，穿过气单胞菌溶素纳米孔的阻断电流信号、阻断电流时间等均发生明显变化，且阻断信号的频率与磷酸酶或激酶的浓度正相关，因此，利用气单胞菌溶素纳米孔可以对磷酸酶或激酶进行定性、定量分析，还可以进一步实时检测。

分析检测方法包括：在电压作用下，待测物质或待测物相关探针分子通过以气单胞菌溶素构建的纳米孔通道，分析产生的阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测物质相应的检测信息。进一步的，具体步骤包括：包括：

(1)构建气单胞菌溶素纳米孔通道：组装好检测池并在检测池两端加入电解质溶液，在检测池内构建形成气单胞菌溶素纳米孔通道；

(2)在构建的气单胞菌溶素纳米孔通道的两端施加电压，将待测物或待测物相关探针分子加入检测池的一端(Cis端)，在电压的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号和阻断电流时间；

(3)对阻断电流信号及阻断电流时间进行比较分析，获得待测物相应的检测信息。

步骤(1)中，所述气单胞菌溶素为野生型气单胞菌溶素和气单胞菌溶素突变体中的一种。

所述的电解质溶液选自缓冲液、细胞裂解液、血液和细胞内液中的一种或几种。

所述缓冲液为浓度0.1～3mol/L的Tris缓冲液；所述的缓冲液的pH范围为4～11进一步为7～9；在多肽磷酸化、蛋白磷酸化、相关酶的分析检测中，电解质液加入10～30mmol/L Mg²⁺、10～30mmol/L Ca²⁺或10～30mmol/L Zn²⁺。

步骤(2)中所述的电压为-300mV～+300mV，0V除外。

本发明中的气单胞菌溶素纳米孔通道一般是将气单胞菌溶素活化后嵌入磷脂双分子层中得到，磷脂双分子层可以采用提拉法制备，嵌入磷脂双分子层时，通过向检测池的顺端加入气单胞菌溶素，然后施加100～300mV电压，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升。

有益效果：

(1)气单胞菌溶素纳米孔通道可实现对核酸分子多种磷酸化状态的直接识别，不需要DNA马达蛋白，灵敏度高，可检测溶液中超低浓度的核酸(100fmol/L)，并对不同磷酸化程度(未磷酸化，一端磷酸化，两端磷酸化)及不同磷酸化位点(5’磷酸化或3’磷酸化)进行识别，而现有α-溶血素纳米孔技术难以对此进行有效识别。兼具核酸磷酸化状态和核酸序列的直接测定。

(2)利用气单胞菌溶素纳米孔通道可实现对多肽磷酸化的检测，且不需要通过基因工程或化学修饰的方法对多肽进行修饰，灵敏度高、检测方便。

(3)利用气单胞菌溶素纳米孔可实现对激酶、磷酸酶、酶抑制剂等多种酶的活性分析和定量分析，并可实现酶的实时监测。

(4)利用气单胞菌溶素纳米孔可以实现对核酸磷酸化/去磷酸化过程的检测，实现酶信号通路的研究以及催化磷酸化过程的实时监测。

附图说明

图1为5’-dA14-3’去磷酸化/磷酸化的不同状态下阻断电流信号分析图；

图2为P-5’-dA14-3’-P与碱性磷酸酶作用前后阻断信号分布图；

图3为多肽LRRASLG(S-peptide)和磷酸化的多肽LRRASLG(P-peptide)阻断电流信号图；

图4为阻断信号的频率与激酶A(PKA)的浓度关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

下述实施例1～实施例4中，步骤(1)构建气单胞菌溶素纳米孔通道参照公告号CN104651500 B、发明名称为气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用的专利所公布的方法，例如具体可采用该专利中实施例1的方法，具体如下：

(1)气单胞菌溶素的前处理

将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养10min，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在-20℃冰箱中存储，储存浓度为0.1mg/ml。

(2)用提拉法制备磷脂双分子层

用聚缩醛树脂检测池作为载体制备磷脂双分子层，所述聚缩醛树脂检测池含有检测池I(也即顺室1)和检测池II(也即反室)，所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层形成后将所述聚缩醛树脂检测池分为两个区域：由于所述气单胞菌溶素纳米孔***磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是顺室(即检测池I)，与小口端对应的为反室(即检测池II)；在所述检测池II上有直径为50μm的小孔，用于形成磷脂双分子层；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔，用于***注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜所用的1，2-二植烷酰基磷脂储存在氯仿溶液中，保存在-20℃冰箱中。具体过程为：

①涂抹磷脂正癸烷溶液，备磷脂双分子层膜前须先将1，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μl正癸烷加入抽好的1，2-二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液。

②涂抹磷脂正癸烷溶液，用貂毛画笔在1mL检测池II的小孔4内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烷溶液并用N2吹干。

③施加电压，将检测池I和检测池II组装后分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加100mV电压并指定顺室为虚拟接地端。

④反复提拉溶液，在反室的小孔处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层成膜过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子层膜的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV电压。

⑤检测与重复，若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜。

(3)形成气单胞菌溶素纳米孔通道

在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室中加入10μl气单胞菌溶素，施加100mV电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在100mV电压下获得电流在50±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。

实施例1：核酸磷酸化/去磷酸化检测

(1)构建气单胞菌溶素纳米孔通道：组装好检测池并在检测池两端加入pH＝8的电解质溶液(Tris缓冲液，1mol/L)，在检测池内上的50μm的微孔处构建磷脂双分子层，在检测池一端加入气单胞菌溶素，待其在磷脂双分子层上形成气单胞菌溶素纳米孔；

(2)在气单胞菌溶素纳米孔通道的两端施加300mV电压，将10ul待测物(加入量根据检测需求而定，一般在1-100uL)加入检测池的一端(Cis端)，在电位的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号及阻断电流时间；

所述的待测物分别为未经磷酸化的5’-dA14-3’、5’端磷酸化的5’-dA14-3’、3’端磷酸化的5’-dA14-3’以及5’和3’同时磷酸化的5’-dA14-3’的DNA为待测物，分别进行检测，分析比较阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测分子相应的检测信息，检测结果图如图1所示。

图1中，I₀定义为气单胞菌溶素纳米孔的开孔电流，I定义为单个阻断电流信号的电流值，I/I₀则为单个待测分子穿过纳米孔在孔内造成的阻断电流程度，duration为单个阻断电流信号的阻断时间，Current为电流值。以阻断时间为纵坐标，阻断电流程度为横坐标，不同磷酸化状态的5’-dA14-3’均产生大量的阻断电流信号，且在坐标轴上有明显不同的分布。利用气单胞菌溶素纳米孔检测未经磷酸化的5'-dA14-3'，该过程产生两种不同的阻断电流状态，一种为阻断电流程度较小而阻断时间较长定义为PI，另外一种阻断电流程度稍大的信号成为PII，这两种类型的信号由5’-dA14-3’穿孔过程中不同的方向造成的，即3'端(PI)或者5'端(PII)首先进入纳米孔发生穿孔的行为。随后，利用单胞菌溶素纳米孔检测5'-dA14-3'的任意一端及两端共同磷酸化的5’-dA14-3’，利用数据分析处理的软件对每个电流阻断信号进行还原后做散点图可知，5’-dA14-3’的磷酸化会大大缩短其穿孔过程的阻断时间。对于5'端磷酸化的5'-dA14-3'，其PII分布的阻断时间缩短了近30倍，而PI分布的阻断时间几乎不变；相反地，对于3'端磷酸化的5'-dA14-3'，其PI分布的阻断时间大幅缩减，约为52倍，而PII分布的阻断时间几乎不变；5'端、3'端共同磷酸化P-5'-dA14-3'-P，其PI、PII分布的阻断时间均大幅降低。以上数据表明3'或5'端的磷酸化的过程会显著降低该端首先进入纳米孔产生的阻断电流信号的阻断时间，由此可知，寡聚核苷酸的每个末端的磷酸化或去磷酸化过程可以从PI/PII的持续时间直接读出。

另外，该方法同样适用于RNA的磷酸化/去磷酸化检测，检测方法及检测结果分析与DNA的磷酸化/去磷酸化检测相同。

实施例2：碱性磷酸酶的检测

(1)构建气单胞菌溶素纳米孔通道：组装好检测池并在两端加入含有MgCl₂的pH＝7.5的电解质溶液(Tris缓冲液，1mol/L)，MgCl₂的浓度为20mmol/L，在检测池内上的50μm的微孔处构建磷脂双分子层，在检测池一端加入气单胞菌溶素，待其在磷脂双分子层上形成气单胞菌溶素纳米孔；

(2)在气单胞菌溶素纳米孔通道的两端施加100mV电压，将10ul待测物加入检测池的一端(Cis端)，在电位的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号；

所述的待测物分别为磷酸化的DNA链(P-5’-dA₁₄-3’-P)及其与碱性磷酸酶反应的产物，分别进行检测，通过分析比较阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测分子相应的检测信息。检测结果图如图2所示。

图2中，I₀定义为气单胞菌溶素纳米孔的开孔电流，I定义为单个阻断电流信号的电流值，I/I₀则为单个待测分子穿过纳米孔在孔内造成的阻断电流程度，Duration为单个阻断电流信号的阻断时间。以阻断时间为纵坐标，阻断电流程度为横坐标，磷酸化的DNA链(P-5’-dA₁₄-3’-P)与加入碱性磷酸酶反应后的产物在坐标轴上有明显不同的分布。磷酸化的DNA链(P-5’-dA₁₄-3’-P)与加入碱性磷酸酶反应后的产物在坐标轴上有明显不同的分布。磷酸化的DNA链(P-5’-dA₁₄-3’-P)在加入碱性磷酸酶反应后信号量明显增多，且阻断时间增加，这主要是由于碱性磷酸酶催化P-5’-dA₁₄-3’-P脱去3’端及5’端的磷酸基团，并依次生成P-5’-dA₁₄-3’及5’-dA₁₄-3’。通过对比反应前后阻断电流信号，可以获得碱性磷酸酶的活性信息，阻断信号的频率与碱性磷酸酶的浓度正相关，进而可以对碱性磷酸酶进行定量分析，并对比磷酸酶对核酸不同位点去磷酸化的催化活性。

该方法同样适用于碱性磷酸酶对RNA的催化活性分析及碱性磷酸酶的定量分析。

实施例3：多肽磷酸化的检测

(2)在纳米通道的两端施加300mV电压，将10ul待测物加入检测池的一端(Cis端)，在电位的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号及阻断电流时间。

所述的待测物以LRRASLG为模型多肽，分别对未经磷酸化的多肽LRRASLG(S-peptide)和磷酸化的多肽LRRASLG(P-peptide)进行检测，通过分析比较阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测物相应的检测信息，检测结果图如图3所示。

图3中，I₀定义为气单胞菌溶素纳米孔的开孔电流，I定义为单个阻断电流信号的电流值，I/I₀则为单个待测分子穿过纳米孔在孔内造成的阻断电流程度，duration为单个阻断电流信号的阻断时间。以阻断时间为纵坐标，阻断电流程度为横坐标，S-peptide与磷酸化的P-peptide产生不同的阻断电流信号，且在坐标轴上有明显不同的分布。首先利用气单胞菌溶素纳米孔检测S-peptide，该多肽在pH＝7.5是净电荷为+2，因为在施加正电位的情况下很难产生阻断电流信号，从而在阻断时间-阻断电流的散点图上分布较少，当Ser-5磷酸化后，P-peptide的净电荷降至0，使其进入气单胞菌溶素纳米孔的电泳力增强，产生较多阻断电流信号，因此可以通过S-peptide与P-peptide穿孔的事件频率来评估多肽磷酸化程度。

实施例4：激酶A的磷酸化活性

(2)在纳米通道的两端施加+100mV电压，将10ul待测物加入检测池的一端(Cis端)，在电位的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号及阻断电流时间。

以未经磷酸化的多肽LRRASLG(S-peptide)为底物，待测物分别为S-peptide和与不同浓度激酶A(PKA)作用的产物(在ATP和Mg²⁺存在下将S-peptide与PKA充分反应，加热猝灭反应并使酶失活，PKA将ATP的γ-磷酸基团转移到S-peptide的丝氨酸残基上，将反应后的溶液加入气单胞菌溶素纳米孔检测池内进行分析)，通过分析比较阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测分子相应的检测信息，检测结果图如图4所示。

图4中以PKA的浓度为横坐标，阻断电流频率(阻断信号出现周期的倒数)为纵坐标，在+100mV电位下，S-peptide几乎不产生阻断的电流信号，而与PKA作用后产生明显的阻断电流信号，且该阻断信号的频率与PKA的浓度正相关，因此可对PKA进行定性和定量分析。

以上方法还可用于PKA的实时检测中，实验具体步骤如上，使反应物与PKA反应，在不同反应时刻(0-48h)采集反应后的溶液加入气单胞菌溶素纳米孔检测池内进行分析，随反应时间的进行，反应产物浓度逐渐升高，特征阻断电流的频率与反应时间正相关，对信号频率与反应时间作图，可获得不同时刻PKA催化反应的信息，实现对PKA的实时分析。

本发明不仅适用于碱性磷酸酶和激酶A的活性分析、实时检测和定量分析，对于其它激酶、磷酸酶以及酶抑制剂也同样适用。

Claims

1.气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，生物磷酸化的分析检测包括核酸磷酸化、核酸去磷酸化、多肽磷酸化、多肽去磷酸化、蛋白磷酸化和蛋白去磷酸化的分析检测中的一种或几种，相关酶的分析检测包括酶活性分析、酶活实时监测和酶定量分析中的一种或几种，在电压作用下，待测物质或待测物相关探针分子通过以气单胞菌溶素构建的纳米孔通道，分析产生的阻断电流信号和阻断电流时间，获得待测物质相应的检测信息；其应用具体包括：

（1）构建气单胞菌溶素纳米孔通道：组装好检测池并在检测池两端加入电解质溶液，在检测池内构建形成气单胞菌溶素纳米孔通道；

（2）在构建的气单胞菌溶素纳米孔通道的两端施加电压，将待测物或待测物相关探针分子加入检测池的一端，在电压的驱动下待测物穿过气单胞菌溶素纳米孔产生阻断电流信号和阻断电流时间；

（3）对阻断电流信号及阻断电流时间进行比较分析，获得待测物相应的检测信息。

2.根据权利要求1所述的气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，核酸磷酸化包括5'末端磷酸化或/和3'末端磷酸化，核酸去磷酸化包括5'末端去磷酸化或/和3'末端去磷酸化。

3.根据权利要求1所述的气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，其特征在于，核酸为1~10kbp的DNA或RNA；多肽长度为2~100 个氨基酸；蛋白分子量为1~500 kDa；所述的相关酶为水解酶、激酶、磷酸酶、酶抑制剂、磷酸化酶、磷酸酯酶或糖基转移酶。

4.根据权利要求1所述的气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，所述气单胞菌溶素为野生型气单胞菌溶素和气单胞菌溶素突变体中的一种。

5.根据权利要求1所述的气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的电解质溶液选自缓冲液、细胞裂解液、血液和细胞内液中的一种或几种；步骤（2）中所述的电压为-300mV~+300mV，0V除外。

6.根据权利要求5所述的气单胞菌溶素纳米孔通道在生物磷酸化或相关酶的分析检测中的应用，其特征在于，所述缓冲液为浓度0.1~3mol/L 的Tris缓冲液；所述的缓冲液的pH范围为4~11；在多肽磷酸化、蛋白磷酸化、相关酶的分析检测中，电解质溶液中加入10~30mmol/L Mg²⁺、10~30 mmol/L Ca²⁺或10~30 mmol/L Zn²⁺。