CN110779967B - 一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种基于传统玻碳电极的NF‑κB电化学检测方法。本发明主要是利用肽核酸(PNA)能够竞争性的结合含NF‑κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA‑DNA杂交链，NF‑κB的存在会抑制PNA‑DNA杂交链生成的原理。实验首先在激活的电极表面镀金并共价修饰PNA，PNA竞争性的结合含NF‑κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA在电极表面形成稳定的PNA‑DNA杂交链，NF‑κB的存在会与dsDNA结合并抑制PNA‑DNA杂交链的形成且NF‑κB含量的差别会导致PNA‑DNA杂交链形成量不同，选取特异性嵌合于PNA‑DNA杂交链中MB作为电信号分子，利用差分脉冲伏安法测量NF‑κB不同浓度时MB的峰电流值，绘制NF‑κB浓度与峰电流值的关系曲线得出线性方程，通过检测电信号计算待测样品中NF‑κB含量。该方法灵敏度高，为NF‑κB的检测提供新思路。

Description

一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，属于分析化学领域。
背景技术
核转录因子NF-κB是隶属于锌指结构家族的转录因子，能与B细胞免疫球蛋白κ轻链启动子区域相结合，并且调控该区域基因启动表达的蛋白。NF-κB广泛存在于哺乳动物的各个细胞类型中，不同类型研究皆发现机体在健康状态和病理状态下NF-κB的表达量有明显的差异，NF-κB的含量变化在机体免疫、代谢、炎症反应、肿瘤发展以及其他病程的发生过程中发挥着重要的指示作用，对于疾病的发展、早期诊断或预防具有重要意义。因此，建立一种灵敏、快速、便捷检测NF-κB水平的方法是非常必要的。
现今，NF-κB的检测方法包括电泳迁移率变动分析，蛋白质免疫印迹等。然而，这些方法通常需要特异性抗体，繁琐的标记或特殊仪器。众所周知，标记过程往往是非常耗时且昂贵，甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具有设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷，同时可以实现无标记检测等优点。其中玻璃碳电极具有化学稳定性高，热胀系数小，气密性好，可制成圆柱、圆盘电极形状等优点，在电化学实验中得到日益广泛的应用，近年来，被成功的应用于生物大分子定性或定量的检测。
发明内容
本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势，建立一种简单、无需标记、成本低廉和高灵敏度的NF-κB检测方法。
本发明的技术方案：一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，利用PNA与DNA的结合具有高亲和力与特异性，能够竞争性的结合dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA-DNA杂交链；MB能够嵌合于杂交双链，作为氧化还原指示剂放大电信号响应；设计了含有NF-κB结合序列的DNA，当NF-κB蛋白存在时，NF-κB蛋白与dsDNA的靶向结合能抑制PNA-DNA杂交链的生成，电极表面修饰的PNA单链与MB互作力不强，信号微弱；NF-κB含量的差别导致不同程度的信号响应，测得标准曲线，通过统计学分析得出NF-κB检测的线性方程并计算其含量。该方法具有良好的重复性，高的灵敏度，可应用于NF-κB的检测。
方法包括以下步骤：玻碳电极的预处理、金粒子修饰玻碳电极、PNA修饰镀金玻碳电极、样品与修饰电极共孵育、MB与修饰电极共孵育、NF-κB的电化学检测。
(1)玻碳电极的预处理
采用经典的预处理方式进行玻碳电极的预处理。具体步骤如下：用1、0.3μm的三氧化二粉末分别对直径为3mm圆盘玻碳电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超声5min。之后将处理好的电极置于0.5M H2SO4中，在0V-1.5V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1V/s，直至达到稳定后，室温干燥。
(2)金粒子修饰玻碳电极
将上述(1)中经过经典方法预处理的玻碳电极浸泡于5mL 2mM的氯金酸溶液(0.5MH2SO4溶解)中电沉积750s，沉积电位为-200mV。
(3)PNA修饰镀金玻碳电极
将上述(2)中镀金玻碳电极表面滴加0.5μM 5.0μL的PNA(0.1M PBS，pH＝7.4)，37℃孵育1.5h，蒸馏水冲洗。后将PNA修饰的电极置于100μL 1.0mM MCH溶液中30min进行占位去除非特异性吸附。
上述PNA的序列为：5′-Cys-ATG-GTC-GGG-ACT-TTC-CCT-3′。
(4)样品与修饰电极共孵育
对待测样品预处理：取12.5μL 0.06μM ssDNA1(0.1M PBS，0.25M NaCl，pH＝7.4)与12.5μL 0.06μM ssDNA2(0.1M PBS，0.25M NaCl，pH＝7.4)，经90℃5min→70℃10min→50℃10min→30℃10min→10℃25min杂交得dsDNA。再与25μL不同浓度(0→0.1ng/mL)NF-κBp50(50mM HEPES，1mM TCEP，50mM NaCl，pH＝7.4)溶液混合，37℃孵育0.5h。将经过上述(3)处理的电极置于dsDNA与蛋白的混合溶液中，37℃孵育2.0h。
上述ssDNA1的序列为：5′-ATG-GTC-GGG-ACT-TTC-CCT-3′；
上述ssDNA2的序列为：5′-AGG-GAA-AGT-CCC-GAC-CAT-3′
(5)MB与修饰电极共孵育
将经过上述(4)处理的电极置于100μL，浓度为20mM的MB溶液(20mM Tris-HCl，pH＝7.4)中，避光，室温孵育2h。
(6)NF-κB的电化学检测
将经过上述(5)处理的电极置于5mL 20mM Tris-HCl，pH为7.4的溶液，进行电化学定量分析，本检测采用的电化学工作站(CHI 660E)，以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。使用的扫描方法为微分脉冲伏安法，参数设置：初始电位-0.6V，终止电位0.3V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s。在NF-κB含量多的情况下，形成PNA-DNA的杂交链就越少，电信号分子MB吸附量就越少，因此得到的电化学信号也随之减小。以MB的电化学信号为纵坐标，NF-κB的浓度为横坐标，绘制标准曲线，通过计算NF-κB的浓度，即可实现NF-κB的灵敏检测。
本发明的有益效果：该方法简便快速、灵敏度高，成功实现了NF-κB的无标记检测。简化了实验步骤，避免了标记过程，对各类疾病包括癌症的监控与治疗具有重要意义。
附图说明
图1：NF-κB的检测原理图。
图2：NF-κB在不同浓度下，电化学信号值与NF-κB浓度关系的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1.NF-κB标准溶液电化学信号值-浓度标准曲线图的测定
将25μL不同浓度NF-κB标准液分别按照上述步骤与DNA共孵育后修饰于电极，经电信号分子MB处理后测得电化学信号。如图2所示电化学信号值(ip)与NF-κB浓度的变化关系曲线，NF-κB在0.02-0.1ng/mL范围内，ip与浓度存在线性关系，线性回归方程为：y＝-55.05x+7.101，R2＝0.995，式中y为DPV的峰电流ip(μA)，x为NF-κB的浓度(ng/mL)。
Figure ISA0000190365930000011

Claims (6)

1.一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是设计了针对NF-κB中p50结构域为靶标的三个探针：PNA、ssDNA1和ssDNA2；
PNA：5′-Cys-ATGGTCGGGACTTTCCCT-3′
ssDNA1：5′-ATGGTC-GGGACT-TTCCCT-3′
ssDNA2：5′-AGGGAAAGTCCCGACCAT-3′
s sDNA1和ssDNA2互补形成的双链DNA含NF-kB结合序列，ssDNA2能被肽核酸PNA竞争性的结合形成稳定的PNA-ssDNA2杂交链，利用了NF-κB的存在会抑制PNA-ssDNA2杂交链生成的原理，实验首先在经处理的传统玻碳表面镀金并共价修饰PNA，PNA竞争性的结合含NF-kB结合序列dsDNA中的互补ssDNA2在电极表面形成稳定的PNA-DNA杂交链，NF-κB的存在会与dsDNA结合并抑制PNA-DNA杂交链的形成且NF-κB含量的差别会导致PNA-DNA杂交链形成量不同，选取特异性嵌合于PNA-DNA杂交链中MB作为电信号分子，利用差分脉冲伏安法测量NF-κB不同浓度时MB的峰电流值，绘制NF-κB浓度与峰电流值的关系曲线得出线性方程，通过检测电信号计算待测样品中NF-κB含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是设计了ssDNA2能被肽核酸PNA竞争性的结合形成稳定的PNA-ssDNA2杂交链，利用了NF-κB的存在会抑制PNA-ssDNA2杂交链生成的原理。
3.根据权利要求1所述的一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是实验首先在经处理的传统玻碳表面镀金并共价修饰PNA，该修饰过程首先通过经典方法预处理玻碳电极，之后将其浸泡于5mL 0.5M H2SO4溶解的浓度为2mM的氯金酸溶液中-200mV电沉积750s，双蒸水清洗后再于电极表面滴加5.0μL含0.5μM PNA、0.1M PBS，pH值为7.4的溶液，37℃孵育1.5h，蒸馏水冲洗后，于1mM巯基己醇溶液浸泡0.5h，蒸馏水冲洗，得到PNA稳定修饰的镀金玻碳电极表面。
4.根据权利要求1所述的一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是PNA竞争性的结合含NF-κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA2在电极表面形成稳定的PNA-ssDNA2杂交链，NF-κB的存在会与dsDNA结合并抑制PNA-DNA杂交链的形成且NF-κB含量的差别会导致PNA-DNA杂交链形成量不同，实验中取用0.25M NaCl、0.1M PBS，pH值为7.4溶液溶解的0.06μM ssDNA1与0.06μM ssDNA2各12.5μL混合，经90℃5min→70℃ 10min→50℃10min→30℃ 10min→10℃ 25min杂交得dsDNA，再将其与25μL用1mM TCEP、50mM NaCl、50mM HEPES，pH值7.4的溶液溶解NF-κB标准溶液混合，37℃孵育0.5h后，将权利要求2中的玻碳电极浸泡于该溶液中，37℃孵育2.0h。
5.根据权利要求1所述的一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是选取特异性嵌合于PNA-DNA杂交链中MB作为电信号分子，利用差分脉冲伏安法测量NF-κB不同浓度时MB的峰电流值，将权利要求4中的电极浸泡在100μL含20mM MB、20mM Tris-HCl，pH值为7.4的溶液中，室温避光孵育2h，双蒸水清洗后，将电极置于5mL 20mM Tris-HCl，pH为7.4的溶液中进行差分脉冲伏安法分析，参数设置：初始电位-0.6V，终止电位0.3V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s。
6.根据权利要求1所述的一种基于传统玻碳电极的NF-κB电化学检测方法，其特征是绘制NF-κB浓度与峰电流值的关系曲线，得出线性方程：y＝-55.05x+7.101，R2＝0.995，式中y为DPV的峰电流ipμA，x为NF-κB的浓度ng/mL，通过检测电信号计算待测样品中NF-κB含量。
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