CN111909960B

CN111909960B - 一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法

Info

Publication number: CN111909960B
Application number: CN202010818161.7A
Authority: CN
Inventors: 张志乾
Original assignee: Guangzhou Qianxiang Cosmetics Co ltd
Current assignee: Guangzhou Qianxiang Cosmetics Co ltd
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2024-06-25
Anticipated expiration: 2040-08-14

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法。本发明公开的筛选方法通过将表达不同目的蛋白的重组质粒分别导入毛囊真皮***部干细胞中过表达，然后再与人表皮细胞进行共培养，当人表皮细胞内衰老基因下调明显时，检测各组毛囊真皮***部干细胞中目的基因的mRNA或蛋白的相对表达量，该相对表达量即为组合物中各种肽和/或蛋白质的质量比。本发明首次将组合物中的各成分在细胞中的相对表达量与其在组合物中的使用比例建立关联，通过相对表达量来确定使用比例，该筛选方法可以得到组合物中各成分最适宜的使用比例，从而高效利用组合物中各种成分，且不会对皮肤造成损伤。

Description

一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法。

背景技术

当前化妆品中会使用多种小分子肽类作为活性成分，但小分子肽类的浓度并非越高越好，多种小分子肽类一起使用时适宜人面部皮肤细胞的浓度和比例难以得知，从而使得一些高浓度小分子肽类的使用容易造成皮肤细胞损伤，低浓度的使用难以起到较好的效果。

发明内容

本发明提供了一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法，解决了化妆品中多种小分子肽类组合使用时，使用比例不适宜会造成皮肤细胞损伤或难以起到较好的效果的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1：将表达肽和/或蛋白质组合物中任意一种组分的重组质粒转染至毛囊真皮***部干细胞，得到表达目的蛋白的毛囊真皮***部干细胞，再将表达目的蛋白的毛囊真皮***部干细胞与人表皮细胞共培养12～24h，所述肽和/或蛋白质组合物中剩余的组分重复上述步骤；

步骤2：检测所述共培养后的毛囊真皮***干细胞中目的基因的mRNA或蛋白的相对表达量，即为所述肽和/或蛋白质组合物中各种组分的质量比。

本发明步骤1中，肽和/或蛋白质组合物可以包括两种以上的肽类，或两种以上的蛋白质，或蛋白质和肽类的混合物，优选为两种以上的肽；所述肽类为多肽或小分子肽；重组质粒转染过程中，每组重组质粒的转染量相同；

本发明组合物中的每种肽或蛋白质需功能相似或一致，例如：为抗衰老的和/或抗衰老相关的肽类或蛋白质。

本发明中，所述重组质粒包括：载体质粒和报告基因；

所述载体质粒为载体质粒pLentilox 3.7和包装质粒pRSV-REV；

所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP、增强型蓝色荧光蛋白EBFP或增强型青色荧光蛋白ECFP，优选为EGFP。

本发明中，人表皮细胞能较好的模拟正常人体皮肤。由于表皮细胞无法分化和***，属于成熟的细胞，导入之后最多只能对本细胞产生影响，很难作用于其他细胞。而导入干细胞后，其表达对其它细胞的影响较大(此类干细胞对周围其他表皮细胞和真皮层细胞的影响主要用过旁分泌和分化两个方式，因此对此类干细胞进行导入能更好的模拟其在体内的情况。而且作用效果也更好。)

所述共培养中，所述毛囊真皮***部干细胞与人表皮细胞的数量比为(1:3)-(1:6)，优选为1：5；

所述共培养时间优选为18～24h，更优选为24h。

将毛囊真皮***干细胞与人表皮细胞共培养，监测人表皮细胞衰老基因的表达情况，当共培养至12～24h时，人表皮细胞衰老基因下调明显，进行步骤2；

基质金属蛋白酶(MMP)是一类锌依赖性内肽酶。虽然基质金属蛋白酶1(MMP-1)能切割I型胶原，但MMP-2能降解弹性蛋白以及包括IV型和VII型胶原的基底膜(BM)化合物。MMP-1主要负责老化过程中真皮胶原的降解，MMP-2和MMP-9降解影响皮肤厚度和皱纹形成的细胞外基质(ECM)蛋白。真皮细胞外基质中的化合物，包括胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖，因为它们具有水结合能力，对皮肤的外观有重要影响。基质金属蛋白酶(MMPs)，一个结构相关的基质降解酶家族，降解和修饰各种真皮细胞外基质成分。紫外线辐射可提高MMP-1的产生，从而降解人体皮肤中的胶原分子。因此，本发明中所述衰老基因为MMP-1和/或MMP-2。

I型胶原是真皮细胞外基质的主要结构蛋白，因此，本发明优选在检测人表皮细胞衰老基因的蛋白表达水平同时还检测了I型胶原的蛋白表达水平。

本发明步骤2中检测每组所述毛囊真皮***干细胞中目的基因的mRNA或蛋白的相对表达量的相对表达量之后还包括：

排除表达受抑制的目的基因，所述组合物中剩余肽和/或蛋白质在所述毛囊真皮***干细胞中的mRNA或蛋白的相对表达量即为组合物中剩余肽和/或蛋白质的质量比。

本发明步骤2中所述相对表达量可以为平行实验中任意一组相对表达量，也可以为平均相对表达量。

本发明将组合物中各组分的重组质粒分别导入不同毛囊真皮***部干细胞，使其在毛囊真皮***部干细胞中表达，再将该毛囊真皮***干细胞分别与人表皮细胞进行共培养，监测人表皮细胞衰老基因的表达情况，当共培养至12～24h时，衰老基因下调明显，此时检测毛囊真皮***干细胞的目的基因的mRNA或蛋白的表达水平，其相对表达量即为组合物中各组分的最适配比。本发明实施例中，组合物具体为五种小分子肽，将分别表达五种小分子肽的五组重组质粒分别导入五组毛囊真皮***部干细胞，再将五组毛囊真皮***部干细胞分别与五组人表皮细胞进行共培养，当共培养至24h时，人表皮细胞中的衰老基因下调明显，检测五组毛囊真皮***部干细胞中各小分子肽的基因和蛋白的表达水平，五种小分子肽的基因或蛋白的相对表达量即为五种小分子肽的质量比。使用该比例的肽类组合物应用皮肤上，可以有效修复皮肤损伤，美白抗皱效果好，且对皮肤不产生其它伤害。

本发明还提供了一种肽类组合物，包括：至少两条肽，所述肽类组合物中的肽类为小分子肽和/或多肽；

所述肽类组合物中每种肽的质量比由上述筛选方法筛选得到。

本发明中，所述小分子肽由2～10个氨基酸组成，所述多肽由10～100个氨基酸组成。

本发明中，所述肽类组合物优选由Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11组成。

四肽PKEK(Tetrapeptide PKEK，脯氨酸-赖氨酸-谷氨酸-赖氨酸)可降低紫外光胁迫角质形成细胞中白细胞介素-6、白细胞介素-8和肿瘤坏死因子以及环氧合酶基因的表达。PKEK对UVB诱导的IL-1、IL-6、IL-8、TNF及POMC、酪氨酸酶基因表达上调有明显抑制作用。PKEK与抗坏血酸磷酸酯钠联合使用6周后，面部色素斑明显消退。

六胜肽-11(Hexapeptide-11)能够影响内在和外在老化的成纤维细胞、外在老化的毛***细胞的衰老开始。

铜三肽(Copper Tripeptide)它作为信号和载体肽，促进胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖胺聚糖的合成，并提供抗炎和抗氧化反应。刺激细胞调节分子和再生，愈合皮肤和其他组织，对老化过程有较好的抑制作用。

五肽-18(Pentapeptide-18)模拟脑啡肽的自然机制，抑制神经元活动和儿茶酚胺释放。它的作用效果与肉毒杆菌样的效果相似；并且它可以有效的减少细纹和皱纹，滋润皮肤，提高硬度和肤色。

大豆多肽(Glycine max)具有抗氧化、降血压、降血脂等多种生物学活性。局部应用Glycine max数据显示，UVB照射后***表皮中Bcl-2蛋白表达显著增加，环丁烷嘧啶二聚体阳性细胞、晒伤细胞、凋亡细胞、p53蛋白表达和Bax蛋白表达显著降低。局部使用的大豆多肽可以保护人类皮肤。

本发明实施例在共培养至24h时，此时衰老基因下调明显，检测所述毛囊真皮***干细胞中肽的相对表达量，通过多组实验结果发现Hexapeptide-11在衰老基因下调明显时转录受抑制，也即Hexapeptide-11对人表皮细胞衰老相关基因的表达下调无促进作用，所以肽类组合物除去Hexapeptide-11。

通过本发明提供的筛选方法筛选得到所述Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的质量比为(5-5.5):(3.2-4):(6.8-8.3)：(9.3-10)：(0-0.3)，优选为(5-5.5):(3.2-4):(6.8-8.3)：(9.3-10)：0，更优选为5：4：7：10：0。

本发明优选采用基因工程菌实现肽类组合物的量产，采用基因工程菌纯生物合成的方法生产肽类，得到的肽类纯度较高，应用到化妆品或药品中效果倍增。

本发明中，工程菌优选采用大肠杆菌。

本发明还提供了一种化妆品，包括上述肽类组合物、抗氧化剂、表面活性剂、美白剂、保湿剂、湿润剂、润滑剂和水。

本发明中，按重量份计，所述肽类组合物0.3-0.5份、湿润剂2～3份、保湿剂0.1～0.2份、美白剂0.5～0.7份、抗氧化剂0.1～0.3份、表面活性剂0.1～0.2份、润滑剂0.1～0.2份、水93～94份。

所述抗氧化剂选自维生素C、半胱氨酸、超氧化物歧化酶或金属硫蛋白，优选为维生素C；

所述表面活性剂选自椰油酰胺丙基甜菜碱、脂肪酸皂、十二烷基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸钠或十八烷基三甲基氯化铵，优选为椰油酰胺丙基甜菜碱，椰油酰胺丙基甜菜碱是一种温和的表面活性剂，可以辅助柔软皮肤；

所述美白剂选自烟酰胺、熊果苷、曲酸、果酸或水杨酸，优选为烟酰胺，烟酰胺美白的同时还可以阻止黑色素的聚集；

所述保湿剂选自尿囊素、透明质酸、海藻糖、吡咯烷酮羧酸钠或芦芭胶，优选为尿囊素，尿囊素可以缓解皮肤刺激；

所述湿润剂选自丙二醇、甘油或乳酸钠，优选为丙二醇，丙二醇可以促进与皮肤的粘性和吸附性；

所述润滑剂选自甘油聚醚-26、柠檬酸或氢氧化钾，优选为甘油聚醚-26，甘油聚醚-26可以柔软润滑皮肤。

优选地，按重量份计，肽类组合物0.5份、丙二醇2份、尿囊素0.15份、烟酰胺0.5份、维生素C0.3份、椰油酰胺丙基甜菜碱0.2份、甘油聚醚-26 0.1份、水93.95份。

本发明中，所述化妆品还包括：乙醇。按重量份数计，所述乙醇2～3份，优选为2份。乙醇可以辅助收缩毛孔及清洁油脂成份。

本发明提供的化妆品可以有效修复皮肤损伤，美白抗皱效果好，具有抗衰老功能，对皮肤无伤害。

本发明所述化妆品包括：护肤品和彩妆，本发明优选为护肤品。所述护肤品包括：化妆水、乳液、精化液、眼霜、面霜或面膜液。本发明还提供了一种药物，包括上述肽类组合物和药学上可接受的辅料。

本发明中，所述药物可以用于治疗皮肤相关疾病。

所述药物的剂型包括：喷雾剂、软膏剂、洗剂或涂膜剂。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法，该筛选方法通过将表达不同目的蛋白的重组质粒分别导入毛囊真皮***部干细胞中过表达，然后再与人表皮细胞进行共培养，观测目的蛋白的过表达对人表皮细胞内衰老基因的影响，当共培养至12～24h时，此时衰老基因下调明显，检测各组毛囊真皮***部干细胞中目的基因的mRNA或蛋白的相对表达量，该相对表达量即为组合物中各种肽和/或蛋白质的质量比。本发明首次将肽和/或蛋白质组合物中的各组分在细胞中的相对表达量与其在组合物中的使用比例建立关联，通过相对表达量来确定各组分在组合物中的使用比例，该筛选方法可以得到组合物中各组分最适宜的使用比例，从而可以高效利用组合物中各种成分，且不会对皮肤造成损伤，避免各组分用量过高对皮肤造成二次伤害，用量过低效果差的问题。该筛选方法可以应用在含肽和/或蛋白质的个人护理产品或药物中，对皮肤效果好且不会产生副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的慢病毒载体***中的载体质粒pLentilox 3.7图谱和包装质粒pRSV-REV图谱；

图2为本发明实施例1提供的六组重组质粒转染毛囊真皮***部干细胞的荧光显微镜图(放大倍数200倍)，其中，(a)为Tetrapeptide PKEK，(b)为Copper Tripeptide，(c)为Pentapeptide-18，(d)为Glycine max，(e)为Hexapeptide-11；

图3为本发明实施例1提供的与表达Pentapeptide-18的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中MMP-1在不同时间段的Western blot检测结果图；

图4为本发明实施例1提供的与分别表达Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中MMP-1Western blot的检测结果图；

图5为本发明实施例1提供的与分别表达Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中MMP-2Western blot的检测结果图；

图6为本发明实施例1提供的与分别表达Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中MMP-1ELISA检测结果图；

图7为本发明实施例1提供的与分别表达Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞共培养后的人表皮细胞中MMP-2ELISA检测结果图；

图8本发明实施例1提供的与分别表达Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞共培养后人表皮细胞中I型胶原ELISA检测结果图；

图9为本发明实施例1提供的与人表皮细胞共培养24h后，毛囊真皮***部干细胞中Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycinemax和Hexapeptide-11的RT-qPCR检测结果图；

图10为本发明实施例2提供的加入了不同比例Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的人表皮细胞中I型胶原、MMP-1和MMP-2的表达水平的检测结果图；

图11为本发明实施例2提供的加入Hexapeptide-11和未加入Hexapeptide-11的人表皮细胞中I型胶原、MMP-1和MMP-2的表达水平的检测结果图；

图12为本发明实施例3提供的基因工程菌发酵纯化流程示意图；

图13为本发明实施例5提供的A组小鼠背面皮肤的效果图；

图14为本发明实施例5提供的B组小鼠背面皮肤的效果图；

图15为A组小鼠皮肤组织切片图(标尺为100μm)；

图16为本发明实施例5提供的小鼠背面皮肤的效果图，其中，(a)为未进行紫外处理；(b)为紫外处理后涂抹实施例4液体化妆品；(c)为紫外处理后涂抹对比例1化妆品；

图17为图16对应小鼠的皮肤组织切片图；

图18为本发明实施例5提供的紫外损伤模型小鼠涂抹化妆品后背面皮肤的效果图，其中，(a)涂抹实施例1液体化妆品，(b)涂抹对比例2化妆品；(c)涂抹对比例3化妆品；(d)涂抹对比例4化妆品；

图19为图18对应小鼠的皮肤组织切片图；

图20为本发明实施例7提供的实验组和对照组面部正常菌群的平板图，其中，(a)为实验组，(b)为对照组；

图21为本发明实施例7提供的实验组和对照组面部正常菌群的显微镜图(放大倍数1000倍)，其中，(a)为实验组，(b)为对照组；

图22为本发明实施例7提供的实验组和对照组面部正常菌群的显微镜图(放大倍数1000倍)，其中，(a)为实验组，(b)为对照组；

图23为本发明实施例7提供的实验组和对照组面部正常菌群的显微镜图(放大倍数1000倍)，其中，(a)为实验组，(b)为对照组。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，小鼠购自购自赛业生物科技有限公司；载体质粒pLentilox 3.7和包装质粒pRSV-REV购自上海联迈生物工程有限公司；Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11由中乔新舟公司所招募健康捐赠者；毛囊真皮***部干细胞和人表皮干细胞由上海中乔新舟科技有限公司提供；大肠杆菌来由赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司提供；表皮葡萄球菌、八叠球菌、JK群棒状杆菌、痤疮丙酸杆菌从北京北纳创联生物技术研究院获取。

本发明实施例中的其它试剂和原料均为市购。

实施例1

本实施例为重组质粒的构建

请参阅图1，本实施例慢病毒载体***中的载体质粒pLentilox 3.7图谱和包装质粒pRSV-REV图谱。

表达Tetrapeptide重组质粒的构建、表达Hexapeptide-11重组质粒、表达CopperTripeptide重组质粒的构建、表达Pentapeptide-18重组质粒的构建和表达Glycine max重组质粒的构建，具体步骤如下：

Tetrapeptide加上脯氨酸修饰Lys-Glu-Lys来稳定肽结构，设计序列为(具有如SEQ ID NO：1所示序列)：

ggagcccagcatggccgggcgggctcgccgcgccgcgcgtcccggggggcctcggcgcttctcgctgccgcgcttctctacgccgcgctgggggacgtggtgcgctcggagcagcagataccgctctccgtgtaagtgccggctcctgcgccgcccggggaggggaccttgccgcctgcgacccactgtgcccaagtttgggcgcctgca

Hexapeptide-11序列Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro，设计序列为(具有如SEQ ID NO：2所示序列)：

gtagcccgccatgatttctctccttaaagctcgcgagaagcttctctctcctctcgtcagttccactatccgaagactctcctctagcctctcct

Copper Tripeptide序列Cu-Gly-L-His-L-Lys，设计序列为(具有如SEQ ID NO：3所示序列)：

ctcgtgaaggcgtcccgttcggtcggtctggagagcgtcgccgaggcgctgctcgccgggggcaccgagggtggggtcgacgcccgatga

Pentapeptide-18序列Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu，设计序列为(具有如SEQ ID NO：4所示序列)：

atgttagtttggctggccgaacatttggtcaaatattattccggctttaacgtcttttctatctgacgtttcgcgccatcgtcagcctgctgaccgcgctgttcatctcattgtggatgggcccgcgtatgattgctcatttgcaaaaactttcctttggtcaggtggtgcgtaacgacggtcctgaatcacacttcagcaagcgcggtacgccgaccatgggcgggattatgatcctgacggcgattgtgatctccgtactgctgtgggcttacccgtccaatccgtacgtctggtgcgtgttggtggtgctggtaggttacggtgttattggctttgttgatgattatcgcaaagtgtgcgtaaagacaccaaagggttgatcgctcgttggaagtatttctg gatgtcggtcatt

Glycine max设计序列为(具有如SEQ ID NO：5所示序列)：

ggagcctcgcaaagcttcccattatcgtgggtcttgatcttcttccttaccatttccttgtggggagttaaggtatcaagtgaagagcaccaccaccatggcaaatctaaagagggacctgtggtggaaagggatcaaaggaggacattacttgtcactgaatttggagagatcactgccattgacatcaaggaaggacaaaaggaactaccctaccatcttcagttcatcacattggagccaaactcgctatttctccctgtgct tctccaagcagacatggtcttttatgttcatacaggttcata

具体步骤如下：

1、摇菌(制作感受态细胞备用)

取装有液体培养基的3ml试管两支，每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒(载体质粒pLentilox 3.7)

依照质粒小提中量试剂盒(天根生物化学科技有限公司)中的说明书操作。

3、酶切(双酶切产生粘性末端)

将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

4、电泳检测

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；

检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期相符。

5、载体与目的基因连接

电泳检测酶切成功后，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收(依照胶回收试剂盒说明书操作)；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h

6、转化(连接产物转化到感受态细胞中)

依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测

(1)挑单克隆

先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5ml EP管5支(依情况可以多挑几管)，给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环(或黄枪头)挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

(2)单克隆检测

以每管摇好的菌液为模板，以上述Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中片段大小一致的正确条带，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml(有LB液体培养液，AMP+)试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5ml EP管中送上海美吉生物医药科技有限公司测序，并保种。五组重组质粒测序结果与设计的基因序列进行比对，比对结果证明本实施例五组重组质粒构建成功。

实施例2

本实施例为肽类组合物使用比例的筛选方法

1、表达Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycinemax和Hexapeptide-11毛囊真皮***干细胞的构建，具体步骤如下：

质粒纯化和细胞培养

1.1准备好实施例1构建好的五组质粒。

1.2.转染前18-24小时，将2.5×10⁶个293T细胞置于10cm培养皿中并在37℃孵育过夜。细胞应在24小时内达到65％-70％的融合。

转染293T细胞

1.3.将转移载体pLentilox 3.7和包装质粒pRSV-REV加入Opti-MEM中，通过完全移液来混合。

1.4.将转染试剂加入同一试管中，涡旋10秒钟。

1.5.在室温下孵育混合物15分钟。

1.6.将混合物逐滴添加到培养皿中，并涡旋以均匀分散在培养皿中。将培养皿放回到37℃的细胞培养箱中。

收集慢病毒上清液

1.7.孵育12-18小时后，更换10ml 293T细胞培养基并继续培养48小时。

1.8.将细胞培养上清液转移到15mL离心管中。3000g，离心15分钟，并通过过滤器(0.45微米)过滤上清液。将病毒上清液转移到新管中。

1.9.病毒颗粒制备完成，待用。

慢病毒转导

1.10.在24孔板中将每孔50,000个人毛囊***干细胞细胞铺板至转导后达50％的融合效率。

1.11.从孔中移出培养基并加入适量的慢病毒颗粒、培养基、聚凝胺。轻轻涡旋以混匀，37℃孵育。

1.12.转导后培养72小时，病毒基因组整合到毛囊***干细胞基因组中。

如图2所示，五种小分子肽重组质粒成功导入毛囊真皮***部干细胞。

2、将表达Tetrapeptide PKEK的毛囊真皮***部干细胞、Copper Tripeptide的毛囊真皮***部干细胞、Pentapeptide-18的毛囊真皮***部干细胞、Glycinemax的毛囊真皮***部干细胞和Hexapeptide-11的毛囊真皮***部干细胞分别与人表皮细胞共培养。所述共培养方法具体为：

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内细胞，从而可以研究下层培养液中各成分对细胞生长、运动等的影响。

上室中种入毛囊真皮***干细胞，下室种入人表皮细胞(毛囊真皮***干细胞与人表皮细胞的数量比为1：5)，使用相同的培养基，购买的transwell实验孔购买自Chemicon公司，自带基质胶，使用0.4μm的聚碳酸酯膜，保证细胞分泌物可以透过同时细胞不会透过。共培养24小时后开始收集细胞，采用Western blot和ELISA检测人表皮细胞相关衰老基因MMP-1和MMP-2的表达情况。

如图3所示，图3中对照组加入空白质粒，导入组加入Pentapeptide-18重组质粒。相比于对照组，与导入Pentapeptide-18重组质粒的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中的MMP-1的表达水平明显下降。

如图4～8所示，图4～8中对照组加入空白质粒。相比于对照组，与导入Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max的重组质粒的毛囊真皮***部干细胞共培养的人表皮细胞中MMP-1和MMP-2的表达水平明显下降，I型胶原的表达水明显升高，但导入Hexapeptide-11后，相比于对照组，人表皮细胞中MMP-1的表达水平没有变化，MMP-2反而升高，I型胶原的表达水平明显下降。

3、在共培养24h后，相比于空白对照组，导入组表皮细胞衰老基因MMP-1和MMP-2下调明显，采用RT-qPCR检测毛囊真皮***部干细胞的mRNA的表达水平。

如图9所示，Hexapeptide-11在衰老基因下调过程中受到抑制，TetrapeptidePKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max均不同程度的上调。因此，五种小分子肽中排除Hexapeptide-11，保留另外四种小分子肽，根据图9四组小分子肽的相对表达量，计算平均相对表达量为：Tetrapeptide PKEK：Copper Tripeptide：Pentapeptide-18：Glycine max＝5：4：7：10，也即质量比为5：4：7：10。

4、分别使用质量比为5：4：7：10加入到人表皮细胞中作为实验组、质量比为1:1:1:1、质量比为3:9:4:6、质量比为9:7:3:4、质量比为5:8:2:9的Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max加入到人表皮细胞中作为对照组1，以质量比为5：4：7：10：5的Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11加入到人表皮细胞作为对照组2，以未加入任何小分肽的人表皮细胞作为空白对照组，在相同时间内检测人表皮细胞中I型胶原、MMP-1和MMP-2的表达水平。

如图10所示，相比于对照组1和空白对照组，采用实施例2筛选得到的四种肽质量比加入人表皮细胞中，I型胶原表达明显上调，MMP-1和MMP-2表达明显下调，说明采用实施例2筛选得到的四种肽的质量比对人表皮细胞衰老基因具有较强的抑制作用，该质量比为四种肽的最佳使用比例。

如图11所示，相对于实验组，对照组2加入Hexapeptide-11，I型胶原的表达有所下调，MMP-1和MMP-2表达有所上调，进一步说明Hexapeptide-11无法抑制衰老基因的表达。

实施例3

本实施例为Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的制备

请参阅图12，基因工程菌发酵纯化方法流程图，具体步骤如下：

将实施例2筛选的Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max四种目的基因导入质粒中。本实施例选取的质粒及质粒构建及验证方法与实施例1相同。

选取大肠杆菌作为工程菌，分别将带有Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max四种目的基因的质粒导入大肠杆菌中，质粒中带有四环素抗体片段，将菌株放在四环素培养基上培养筛选出成功导入并表达四环素抗体的菌株，摇床培养24小时37摄氏度，利用蛋白质提取技术提取目的蛋白小分子肽，提取方法如下：

1、扩大培养：4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μl AMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导：加40μl IPTG诱导，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。

3、获取菌体：4℃，8000rpm离心25分钟，获得菌体。

4、超声波破碎菌体：离心后去上清，向沉淀加入(600ml PB裂解液、300μl溶菌酶、3ml PMSF)，得到菌液。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。600ml PB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5％甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

5、超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长(注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化)。

6、抽滤：用双层滤纸将上清液进行抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。24小时后抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。

7、洗杂蛋白：用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫(杂蛋白)，至胶上无泡沫为止。

8、洗脱目的蛋白：洗脱液加50ml，分3次进行(15+15+15)，每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。(OD值达到1.5为佳)将洗脱液置于透析袋中(透析袋应提前煮好)，将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液(用1×PBS溶液溶解)、1×PBS(无沉淀)洗涤，20％乙醇洗脱，装瓶。洗脱液：50mM/LTRIS-HCL、10mM/LGSH；透析液1：20mM/LTRIS-HCL、1mM/L EDTA、0.15mM/L DTT；透析液2：0.5mM/L EDTA、1×PBS。纯化后将取得的小分子肽进行质谱分析验证结果及纯度。

如表1所示，质谱分析结果现实与串联匹配序列得分高，可信度高达99.9％，同时纯度高。

表1小分子肽质谱分析验证结果和纯度检测结果

小分子肽	得分	可信度	纯度
				Tetrapeptide PKEK	68	99.98％	99.95％
Hexapeptide-11	78	99.95％	99.94％
				Copper Tripeptide	80	99.96％	99.96％
Pentapeptide-18	76	99.97％	99.94％
				Glycine max	77	99.93％	99.95％

实施例4

本实施例为化妆品的制备，配方如下：

肽类组合物0.5份、乙醇2份、丙二醇2份、尿囊素0.15份、烟酰胺0.5份、维生素C0.3份、椰油酰胺丙基甜菜碱0.2份、甘油聚醚-26 0.1份、水93.95份。

将上述原料进行混合成液体化妆品，其中，肽类组合物由实施例3提供的TetrapeptidePKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max四种肽以实施例2筛选得到的质量比5：4：7：10组成。

对比例1

本对比例为化妆品的制备

本对比例配方与实施例4的区别仅在于，Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18、Glycine max和Hexapeptide-11的质量比为5:4:7:10:5。

对比例2

本对比例为化妆品的制备

本对比例配方与实施例4的区别仅在于，Tetrapeptide PKEK、CopperTripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的质量比为5:8:2:9。

对比例3

本对比例为化妆品的制备

本对比例配方与实施例4的区别仅在于，Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的质量比为9:7:3:4。

对比例4

本对比例为化妆品的制备

本对比例配方与实施例4的区别仅在于，Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的质量比为1:1:1:1。

实施例5

本实施例对实施例4和对比例1～4制得的化妆品效果验证

1、小鼠紫外线损伤模型的构建

1.2实验动物BALB/c裸鼠10只，6周龄。日光灯模拟自然环境饲养，常规饲食和饮水，无不良因素影响，适应性饲养1w使其适应实验室环境后开始进行实验。

将小鼠10％水合氯醛(0.2ml/100g)麻醉后，在其后背标记出5cm×3cm的区域用于之后实验中的紫外线照射，将适应性饲养后的7周龄裸鼠固定，充分暴露出标记区域，将紫外灯垂直置于暴露的标记区域皮肤上方6cm处，第1周每次给予裸鼠紫外线照射量为180MJ/cm²(180MJ/cm²为最小致红斑量)，第2～4周间能量较前1w增加1/3，分别为240MJ/cm²、360MJ/cm²，此后第5周起维持360MJ/cm²至第8周照射实验结束。

2、化妆品的效果验证

2.1小鼠在完成最后一次24小时照射后，在紫外损伤模型小鼠的背面涂抹实施例4液体化妆品，随机分为两组，A组六只，B组四只，两组都按照梯度进行涂抹，A组梯度为将0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml的液体化妆品分别加入生理盐水组成都为2ml的液体总量，将其分别涂抹在小鼠背上，每天涂抹一次，一周后拍照显示结果，B组同样将0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml的液体化妆品与生理盐水组成2ml的液体总量，并分别涂抹在小鼠背上，每天一次，一周后拍照显示结果。

观察A组和B小鼠紫外线损伤处的变化，结果如图13和图14所示，图13和图14中，从左至右，液体化妆品呈梯度涂抹。从图13和图14中可以看出，实施例4制得的液体化妆品对小鼠皮肤的损伤修复、色素沉着的去除以及皱纹的去除有着很好的效果，且随着液体化妆品的用量增大，效果越明显。

将A组小鼠损伤组织进行组织切片，结果如图15所示，图15上半部分液体化妆品的使用量依次为0.05ml、0.1ml、0.2ml，下半部分使用量依次为0.3ml、0.4ml、0.5ml。从图15可以看出，小鼠皮肤损伤组织衰老和损伤的细胞明显减少，且随着液体化妆品的用量增大，效果越明显。

2.2小鼠在完成最后一次24小时照射后，将对比例1～4制得的化妆品涂抹于紫外损伤模型小鼠背面，涂抹量均为0.1ml/cm²。

观察小鼠紫外线损伤处的变化，并对涂抹化妆品的小鼠损伤进行组织切片，结果如图16～图19所示。从图16和图17中可以看出，相比于对比例1，实施例4液体化妆品对小鼠皮肤的损伤修复有着很好的效果，且损伤组织衰老和损伤的细胞明显减少，说明Hexapeptide-11的使用可能会抑制皮肤损伤的修复；从图18和19可以看出，相比于对比例2～4，实施例4液体化妆品对小鼠皮肤的损伤修复、色素沉着的去除以及皱纹的去除有着很好的效果，且损伤组织衰老和损伤的细胞明显减少，说明化妆品中小分子肽类的浓度使用不适宜会造成皮肤损伤。

实施例6

选择健康正常的志愿者100人，男女比例1:1，年龄35-65，随机分为十组，每组十人，其中五组每天使用一次，左半脸使用实施例4液体化妆品，右半脸使用安慰剂无关键成分；另外五组每组随机分两组，一组使用实施例4液体化妆品，另一组使用安慰剂，每天使用一次。使用时间30天，每次用量为10ml，测试开始前后分别使用VISIA皮肤检测***检测，结果如表2所示。

表2的结果显示实施例4液体化妆品有效，可以减少皱纹并抚平皱纹，增加皮肤的光滑度。

表2 VISIA皮肤检测***检测结果

实施例7

分别将加入到培养的面部菌群中培养，设置实验组加入菌群，并观察细胞状态。面部正常菌群有表皮葡萄球菌、八叠球菌、JK群棒状杆菌、痤疮丙酸杆菌，将其分别在培养基上培养，等可观察到菌株出现后，向实验组中加入肽类组合物质量比为5：4：7：10的Tetrapeptide PKEK、Copper Tripeptide、Pentapeptide-18和Glycine max的肽类组合物，对照组加入PBS溶液进行对照。

如图20～23所示，肽类组合物对面部正常菌群无明显影响，不会破坏面部正常菌群的平衡。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 广州市乾相化妆品有限公司

<120> 一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggagcccagc atggccgggc gggctcgccg cgccgcgcgt cccggggggc ctcggcgctt 60

ctcgctgccg cgcttctcta cgccgcgctg ggggacgtgg tgcgctcgga gcagcagata 120

ccgctctccg tgtaagtgcc ggctcctgcg ccgcccgggg aggggacctt gccgcctgcg 180

acccactgtg cccaagtttg ggcgcctgca 210

<210> 2

<211> 95

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtagcccgcc atgatttctc tccttaaagc tcgcgagaag cttctctctc ctctcgtcag 60

ttccactatc cgaagactct cctctagcct ctcct 95

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ctcgtgaagg cgtcccgttc ggtcggtctg gagagcgtcg ccgaggcgct gctcgccggg 60

ggcaccgagg gtggggtcga cgcccgatga 90

<210> 4

<211> 418

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgttagttt ggctggccga acatttggtc aaatattatt ccggctttaa cgtcttttct 60

atctgacgtt tcgcgccatc gtcagcctgc tgaccgcgct gttcatctca ttgtggatgg 120

gcccgcgtat gattgctcat ttgcaaaaac tttcctttgg tcaggtggtg cgtaacgacg 180

gtcctgaatc acacttcagc aagcgcggta cgccgaccat gggcgggatt atgatcctga 240

cggcgattgt gatctccgta ctgctgtggg cttacccgtc caatccgtac gtctggtgcg 300

tgttggtggt gctggtaggt tacggtgtta ttggctttgt tgatgattat cgcaaagtgt 360

gcgtaaagac accaaagggt tgatcgctcg ttggaagtat ttctggatgt cggtcatt 418

<210> 5

<211> 308

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ggagcctcgc aaagcttccc attatcgtgg gtcttgatct tcttccttac catttccttg 60

tggggagtta aggtatcaag tgaagagcac caccaccatg gcaaatctaa agagggacct 120

gtggtggaaa gggatcaaag gaggacatta cttgtcactg aatttggaga gatcactgcc 180

attgacatca aggaaggaca aaaggaacta ccctaccatc ttcagttcat cacattggag 240

ccaaactcgc tatttctccc tgtgcttctc caagcagaca tggtctttta tgttcataca 300

ggttcata 308

Claims

1.一种肽和/或蛋白质组合物使用比例的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2：检测所述共培养后的毛囊真皮***干细胞中目的基因的mRNA或蛋白的相对表达量，排除表达受抑制的目的基因，所述组合物中剩余肽和/或蛋白质在所述毛囊真皮***干细胞中的mRNA或蛋白的相对表达量即为所述组合物中剩余肽和/或蛋白质的质量比；

所述共培养过程中，需检测人表皮细胞中衰老基因的蛋白表达水平；

所述衰老基因包括基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶2；

检测人表皮细胞中衰老基因的蛋白表达水平的同时，还需检测所述人表皮细胞中I型胶原的蛋白表达水平；

所述毛囊真皮***部干细胞与所述人表皮细胞的数量比为(1:3)-(1:6)。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1所述共培养的时间为18～24h。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述重组质粒包括：载体质粒和报告基因；

所述载体质粒为载体质粒pLentilox 3.7和包装质粒pRSV-REV；

所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP、强型蓝色荧光蛋白EBFP或增强型青色荧光蛋白ECFP。