CN111909857B - 一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法 - Google Patents

一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，取斜面保存的米曲霉划线至麦芽汁平板上培养，选取最优米曲霉单菌落；无菌操作挑取筛选的米曲霉单菌落接种于液体培养液中，摇床培养得一级种子液；吸取一级种子液涂布于平板上，待平板上长出孢子后，用孢子洗液轻轻冲洗，过滤，收集滤液，离心弃上清得米曲霉孢子；将制备好的米曲霉孢子接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，发酵培养；发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得米曲霉固态发酵产品。本发明制备的米曲霉在储存过程中仍然能够保证存活率，延长菌种制品的保存期限，低温存放12个月后米曲霉菌种的繁殖能力、中性蛋白酶活力和对原料的分解能力均未表现出下降的现象。

Description

一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法。
背景技术
米曲霉是曲霉属的一种，其最重要的作用是生成蛋白水解酶类，即将原料中大分子分解成小分子物质，构成酱油呈味物质、风味物质或其前体。其中包括分解蛋白质的蛋白酶、肽酶和与蛋白质有关的酶类以及分解碳水化合物的酶和其他酶。这些酶类中最重要的是蛋白酶、肽酶和有关酶类，因为提高了蛋白酶、肽酶活力，就可以提高蛋白质水解率，也可以缩短酿造周期。米曲霉构成芳香物质的源泉，米曲霉的作用除生成上述水解酶并转化成呈味成分外，同样重要的作用是生成芳香物质或其前体。米曲霉生成的有机酸、多种醇类的本身或转化成的酯类，都是曲或发酵醪香气的重要成分。
米曲霉菌落生长快，10d直径达5～6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150～300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12～25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40～50μm。小梗一般为单层，12～15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，衰老后大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。该菌株在生物技术领域具有一定的应用，然而在常用的培养基中米曲霉增殖速度较慢，同时易发生染菌现象。
我国的白酒酿造行业每年产生的丢糟产量在3500万吨以上，这些鲜白酒糟酸度大，水分含量60％以上，并且含有10％左右的粗脂肪、17％左右的粗蛋白、25％左右的粗纤维、B族维生素以及磷、钾等无机元素。此外，白酒糟中还存在由微生物菌体产生的氨基酸、核糖核酸及嘌呤等微量有效成分，这些都是谷物所不能比拟的。若未及时加以处理，酒糟容易腐败变质，这不仅造成资源大量浪费，还会严重污染周围环境。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法。
为实现上述技术目的，本发明提供一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，包括以下步骤：
(1)取斜面保存的米曲霉划线至麦芽汁平板上培养，挑取3-5个典型单菌落连续纯化传代复壮3次，选取最优米曲霉单菌落，作为一级种子液菌种；
(2)无菌操作挑取筛选的米曲霉单菌落接种于液体培养液中，摇床培养得一级种子液；
(3)吸取一级种子液涂布与麦芽汁平板上，继续培养，待平板上长出大量孢子后，用孢子洗液轻轻冲洗，过滤，收集滤液，离心弃上清得米曲霉孢子；
(4)将制备好的米曲霉孢子接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，发酵培养；
(5)发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得米曲霉固态发酵产品。
优选的，所述步骤(1)中划线培养温度25-30℃，培养时间2-3天。
优选的，所述步骤(2)中所述液体培养基以质量分数计，由以下组分组成：葡萄糖4％，酵母膏0.2％，NaNO30.3％，KCl 0.05％，余量水，pH 6.8，115℃高压灭菌15min；培养温度25-30℃，转速150-200rpm，培养时间12-24h。
优选的，步骤(3)中，吸取1mL上述培养物涂布于麦芽汁平板上，28℃培养4-5天，待平板上长出大量孢子后，用孢子洗液轻轻冲洗，双层尼龙布过滤，收集滤液，5000rpm离心10min，弃上清得米曲霉孢子。
优选的，步骤(4)中含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中含有以下成分：经过预处理的白酒糟30-60份，酵母浸粉0.1-2份，水30-40份，pH值6-7.5，高温灭菌；接种量0.1-2％，培养温度25-30℃，培养时间3-5d。
优选的，所述预处理的白酒糟的制备方法包括以下步骤：
①将鲜白酒糟置于水中，调节pH值为6-8，浸泡处理后干燥、***粉碎得白酒糟粉；
②所得白酒糟粉和玉米淀粉加水调和均匀后进行膨化处理，粉碎过筛得膨化白酒糟/玉米淀粉混合物。
优选的，步骤①中，浸泡时间12-48h，浸泡温度为60-80℃。
优选的，步骤②中，白酒糟和玉米粉的混合比例为(6-8)∶2，加水量为白酒糟粉和玉米淀粉混合物总量的30-50％。
优选的，步骤②中，膨化温度为100-150℃，膨化处理后粉碎过60目筛。
优选的，步骤(5)中30-50℃烘干至含水量在10-15％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)选取经过纯化和复壮后的米曲霉具有更强的适应能力以及繁殖能力，可以保证其在含白酒糟的固态培养基仍然具有高的繁殖活力；
(2)将白酒糟置于碱性溶液中在一定温度下浸泡有助于提高白酒糟中纤维素和半纤维素的降解率，同时，在后续与玉米粉混合膨化时，能够促进二者发生膨化反应，为米曲霉提供更加丰富的营养物质成分，使酒糟在作为米曲霉培养基时，更容易被吸收，为后续作为固态培养基提供基础。
(3)经过碱性溶液浸泡白酒糟中富含的稻壳成分纤维组织完全溃散成膨松状态，再经过***粉碎使紧紧包围在纤维素外面的木质素全部被撕裂而脱落，形成立体结构，从而有助于米曲霉的依附繁殖和营养物质成分的利用。
(3)白酒糟中富含粗蛋白质，能够为菌体提供充足氮源，但是由于其中的碳源已经基本被利用完全，因此碳源不足，玉米粉含糖较高，为菌体提供充足的碳源，二者协同作用促进米曲霉在发酵池保持较高的生长活性。同时将经过预处理的白酒糟和玉米粉共同混合均匀后进行膨化处理，膨化过程中，一方面，玉米粉中的淀粉凝胶化，淀粉分子间氢键断裂形成糊化淀粉，部分淀粉降解成还原糖，显著提高玉米淀粉的消化利用率，另一方面，膨化使液态水汽化蒸发，谷物组织遭到强大的***伸张作用，使谷物变为无数细致多孔的海绵体，谷物体积增大几倍到几十倍挤压，膨化使玉米粉体积增大，比表面积增加，从而增大了米曲霉的接种面积；
(4)由于经过预处理的白酒糟是和玉米粉以混合物形式存在的，预处理的白酒糟中富含氨基化合物，玉米粉含糖较高，在膨化过程中，可以促使氨基化合物中游离氨基酸与羰基化合物的游离羧基缩合形成亚胺衍生物，发生美拉德反应，美拉德反应产物能够对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等表现出很强的抑制效果，由此可以避免在固态培养过程中杂质菌对米曲霉的抑制作用。同时还赋予了米曲霉发酵产物特殊的风味物质。
(5)经过预处理的白酒糟是和玉米粉以混合物的形式进行膨化反应能够使二者更加充分的混匀和结合反应，当米曲霉附着在膨化混合物当中时更能保证各方面营养物质的供应，从而使固态培养基不需要添加其他原料的前提下就可以满足米曲霉各方面的营养物质需求。
(6)发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得米曲霉固态发酵成品，所得固态发酵产品中，微生物仍然是附着在具有孔隙结构的固态培养基上的，因此，在储存过程中仍然能够为米曲霉提供必要的营养物质供应，从而能够保证米曲霉在储存过程中的存活率，从而延长菌种制品的保存期限，低温存放12个月后米曲霉菌种的繁殖能力、中性蛋白酶活力和对原料的分解能力均未表现出下降的现象。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)取斜面保存的米曲霉(购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13575)划线至麦芽汁平板上培养，挑取3-5个典型单菌落连续纯化传代复壮3次，选取最优米曲霉单菌落，作为一级种子液菌种；
(2)无菌操作挑取筛选的米曲霉单菌落接种于5ml葡萄糖4％，酵母膏0.2％，NaNO30.3％，KCl 0.05％，余量水，pH 6.8的液体培养液中，28℃，180rpm摇床培养16h得一级种子液；
(3)吸取1ml一级种子液涂布于麦芽汁平板上，28℃继续培养，5天平板上长出大量孢子，用孢子洗液轻轻冲洗，过滤，收集滤液，5000rpm离心10min，弃上清得米曲霉孢子；
(4)将制备好的米曲霉孢子以2％的接种量接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，28℃，培养5d；
固态发酵培养基制备方法：
①将鲜白酒糟置于水中，调节pH值为8，80℃浸泡处理24h后干燥、***粉碎得白酒糟粉；
②所得白酒糟粉和玉米淀粉以8:2比例混合后加水40％调和均匀，进行120℃膨化处理，粉碎过60目筛得膨化白酒糟/玉米淀粉混合物。
③膨化白酒糟/玉米淀粉混合物60份，酵母浸粉0.1份，水30份，pH值6.8，高温灭菌得固态培养基；
(5)发酵结束后，将发酵产物30℃烘干至含水量为12％，粉碎得米曲霉固态发酵产品。
实施例2
同实施例1，区别在于，步骤(4)中步骤①将鲜白酒糟分筛出稻壳后置于水中，调节pH值为8，80℃浸泡处理24h后干燥、粉碎过40目筛得白酒糟粉和玉米淀粉以8∶2比例混合膨化。
实施例3
同实施例1，区别在于，步骤①未进行***粉碎。
实施例4
同实施例1，区别在于，步骤①未进行碱性浸泡。
实施例5
同实施例1，区别在于，未进行步骤①。
实施例6
同实施例1，区别在于，步骤②未进行膨化处理。
实施例7
同实施例1，区别在于，不经过步骤(1)的菌种纯化和复壮过程，直接扩大培养得二级种子液。
实施例8
同实施例1，区别在于，步骤(4)所用固态培养基为豆粕10份、米糠2份，麸皮10份，碳酸钙1份，酵母浸粉0.1份，纯化水78份。
效果验证例
对实施例1-8制备米曲霉菌种，-20℃保存1个月和12个月的米曲霉菌种分别接种于含麸皮培养基的三角瓶中，在33℃的温度和80％的湿度下恒温培养72h，分别取少量三角瓶中的米曲霉菌种，检测米曲霉孢子的发芽率，结果见表1；
从上述三角瓶中分别取1g米曲菌接种到99g面粉混合制成菌种粉，取黄豆、面粉及菌种粉混合均匀制得酱油大曲，分别检测酱油大曲的中性蛋白酶活力，结果见表1；
将上述酱油大曲分别与2倍体积的22波美的盐水混合，发酵30天，过滤出油，检测天然油的氨基酸含量，结果见表1。
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取斜面保存的米曲霉划线至麦芽汁平板上培养，挑取3-5个典型单菌落连续纯化传代复壮3次，选取最优米曲霉单菌落，作为一级种子液菌种；
(2)无菌操作挑取筛选的米曲霉单菌落接种于液体培养液中，摇床培养得一级种子液；
(3)吸取一级种子液涂布于麦芽汁平板上，继续培养，待平板上长出孢子后，用孢子洗液轻轻冲洗，过滤，收集滤液，离心弃上清得米曲霉孢子；
(4)将制备好的米曲霉孢子接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，发酵培养；
(5)发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得米曲霉固态发酵产品；
所述步骤(4)中含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中含有以下成分：经过预处理的白酒糟30-60份，酵母浸粉0.1-2份，水30-40份，pH值6-7.5，高温灭菌；接种量0.1-2％；
所述预处理的白酒糟的制备方法包括以下步骤：
①将鲜白酒糟置于水中，调节pH值为8，浸泡处理后干燥、***粉碎得白酒糟粉；
②所得白酒糟粉和玉米淀粉加水调和均匀后进行膨化处理，粉碎过筛得膨化白酒糟/玉米淀粉混合物。
2.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，所述步骤(1)中划线培养温度25-30℃，培养时间2-3天。
3.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述液体培养基以质量分数计，由以下组分组成：葡萄糖4％，酵母膏0.2％，NaNO30.3％，KCl0.05％，余量水，pH6.8，115℃高压灭菌15min；培养温度25-30℃，转速150-200rpm，培养时间12-24h。
4.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，步骤(3)中，吸取1mL上述培养物涂布于麦芽汁平板上，28℃培养4-5天，待平板上长出大量孢子后，用孢子洗液轻轻冲洗，双层尼龙布过滤，收集滤液，5000rpm离心10min，弃上清得米曲霉孢子。
5.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，步骤①中，浸泡时间12-48h，浸泡温度为60-80℃。
6.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，步骤②中，白酒糟和玉米粉的混合比例为(6-8)∶2，加水量为白酒糟粉和玉米淀粉混合物总量的30-50％。
7.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，步骤②中，膨化温度为100-150℃，膨化处理后粉碎过60目筛。
8.根据权利要求1所述的利用白酒糟生产米曲霉的技术方法，其特征在于，步骤(5)中30-50℃烘干至含水量在10-15％。
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