CN111909407A - 一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料及其制备与应用 - Google Patents

一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料及其制备与应用，涉及新材料领域。方法为：先制备半固化膜；取耐药杆菌悬浮液，稀释后滴加在灭菌的基板上静置，然后在无菌环境中除去溶剂；将载有耐药杆菌的基板压入半固化膜中，使耐药杆菌作为模板分子在半固化膜上形成印迹；然后加热完全固化；将印迹膜从基板上剥离，得到印迹膜前体物，洗去该前体物上作为模板分子的耐药杆菌，对该前体物表面进行硅烷化处理，以增强膜的亲水性；在印迹膜上引入微孔结构，即得到选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料。本发明在保证传统细菌印迹材料识别能力的基础上，可避免非耐药菌的干扰而促使耐药菌产生选择性移动和识别以达到选择性分离细菌的目的。

Description

一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料及其制备与应用
技术领域
本发明涉及新材料领域，更具体地，涉及一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料及其制备与应用，尤其涉及一种基于细菌趋化性的选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料的制备和应用。
背景技术
近年来，病原体对抗菌药物逐渐产生耐药，尤其是多重耐药菌的出现，给临床抗感染治疗，以及医院感染防控带来严峻挑战。因此，开发更加精确的，与食品安全、疾病预防以及临床诊疗息息相关的耐药菌检测技术和耐药菌灭菌技术至关重要。而在开发精准的耐药菌检测和灭菌技术过程中，耐药菌的高选择性分离是检测和灭菌方法取得成功的前提条件与关键步骤(Mandal P.,Biswas A.,Choi K.et al.,Methods for rapid detection offoodborne pathogens:an overview.American Journal of Food Technology,2011,6,87-102)。但是作为结构复杂的微生物，耐药菌本身的某些生物特性也会影响耐药菌的分离。例如，同类细菌在形状和直径大小等方面没有差异，从而降低依赖细菌形状和大小的分离技术的效果。同时，不同种类细菌细胞壁上均含有结构相似的肽聚糖层，这种相似的化学结构又增加了依赖细菌细胞壁化学结构来实现耐药菌分离技术的难度。另外，在增殖和代谢过程中，同种细菌在不同内因和外因的共同作用下，会产生个体差异性(J Davison,Genetic exchange between bacteria in the environment.Plasmid,1999,42,73-91)，这无形中也增加了耐药菌鉴定的难度。因此，对耐药菌进行选择性分离在微生物分析检测领域具有重要意义。
目前细菌分离方法主要有传统培养法、物理分离法、生物亲和法。传统培养方法分离细菌过程所需时间较长，并且仅仅适用于少数能够在特定培养基中生长的细菌。物理分离法选择性不足，无法将与目标菌大小相仿的其它细菌完全分离，难以实现结构相近细菌的分离且后续洗涤处理过程也较为繁琐。生物亲和法不具备普遍性、很难实现结构相近细菌(仅胞内物质组成和含量有差异)的分离。分子印迹技术作为一种能够特异性识别靶物质的新兴分子识别技术已广泛应用于细菌分离领域。研究人员采用表面单层印迹、细菌介导光刻等技术制备的细菌印迹聚合物材料实现了整个耐药菌的识别(N.Idil,B.Mattiasson.Imprinting of microorganisms for biosensor applications.Sensors,2017,17,708)。溶胶-凝胶法作为制备微生物印迹的重要方法，直接将模板细菌包埋于分子印迹聚合物中，阻碍了模板细菌的洗脱与识别，很难实现同源的若干个细菌(仅胞内物质组成和含量有差异)的选择性分离(T.Cohen,J.Starosvetsky,U.Cheruti,R.Armon.Wholecell imprinting in sol-gel thin films for bacterial recognition in liquids:Macromolecular fingerprinting.Int.J.Mol.Sci.,2010,11,1236-1252)。因此，针对微生物检验分析中精细分离的需求，开发一种高选择性分离耐药菌的新型材料具有重要意义。
发明内容
本发明解决了现有技术中分离耐药菌的选择性不足，模板细菌的洗脱与识别困难，针对现有细菌分离方法无法有效精细分离耐药菌，无法满足现有微生物检验分析越来越精细的要求等问题，本发明提供了一种选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料，该材料利用细菌本身具有的“识别环境”的趋化能力，将传统的细菌被动识别与细菌趋化性诱导的主动识别相结合，通过耐药菌引诱剂和非耐药菌驱避剂的释放，促进耐药菌的选择性移动和识别以及避免非耐药菌的干扰，从而提高耐药菌的选择性分离。
根据本发明的第一方面，提供了一种选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将硅氧烷类主剂与交联剂溶于挥发性烷烃溶剂中，并涂于基板上，然后加热进行半固化，得到半固化膜；
(2)取耐药杆菌悬浮液，滴加在灭菌的基板上静置，使所述耐药杆菌沉降，然后在无菌环境中除去溶剂；
(3)将步骤(2)中得到的载有所述耐药杆菌的基板压入步骤(1)得到的半固化膜中，并保持一段时间，该过程中耐药杆菌保持完整的形态，且半固化膜中的基团与耐药杆菌表面发生相互作用；然后加热固化，使所述半固化膜完全固化；
(4)将步骤(3)得到的印迹膜从基板上剥离，洗去该印迹膜上作为模板分子的耐药杆菌，形成与所述耐药杆菌尺寸和结构相互匹配的印迹孔穴；然后将甲基三氯硅烷或六甲基二硅氮烷与该印迹膜共同置于密闭容器中，挥发的甲基三氯硅烷或六甲基二硅氮烷结合于该印迹膜表面进行硅烷化处理，以增强印迹膜的亲水性；在印迹膜上引入微孔结构，所述微孔结构用于将引诱剂和驱避剂从印迹膜的一侧渗透到另一侧，即得到选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料。
优选地，步骤(1)中所述硅氧烷类主剂为聚二甲基硅氧烷、四乙氧基硅烷或二乙基三乙氧基硅烷，所述挥发性烷烃溶剂为环己烷或正庚烷。
优选地，步骤(1)中所述半固化是在60～90℃条件下加热3～5min；步骤(2)中所述静置的温度为3～6℃，以降低细菌游动活力，从而促进细菌沉降；步骤(3)中载有所述耐药杆菌的基板压入半固化膜后，在36.5℃～38℃下保持6h～8h；步骤(3)中所述固化是在70～90℃条件下加热0.5～2h。
优选地，步骤(2)所述的耐药杆菌处于对数生长期，稀释后滴加在灭菌的基板上静置，稀释后的耐药杆菌悬浮液的光密度值为0.06～0.08。
优选地，所述耐药杆菌为耐药大肠杆菌、耐药肺炎杆菌或耐药芽孢杆菌。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述方法制备得到的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料，所述印迹膜材料表面分布有与所述耐药杆菌尺寸和结构相互匹配的印迹孔穴，且所述印迹膜材料表面分布有微孔结构。
按照本发明的另一方面，提供了所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料用于分离耐药杆菌的应用。
优选地，所述应用包括以下步骤：
(1)将耐药杆菌和非耐药杆菌的混合液加入容器中，并且加满至容器口，然后将印迹膜材料置于容器顶部且与菌液接触；
(2)将所述耐药杆菌耐受的抗生素和杆菌生长的营养物质滴加至印迹膜表面，并通过印迹膜上的微孔结构渗透进入菌液中；所述耐药杆菌耐受的抗生素作为非耐药杆菌的驱避剂，所述杆菌生长的营养物质作为耐药杆菌的引诱剂，所述驱避剂和引诱剂的共同作用促使耐药大肠杆菌产生选择性移动和识别，直至到达印迹膜的印迹孔穴中，实现耐药杆菌的分离。
优选地，所述非耐药杆菌驱避剂的筛选方法为：
(1)设置多组驱避剂组和多组对照组；每一组驱避剂组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，并加入同一种抗生素，各组驱避剂组中加入的抗生素不同，然后将吸入缓冲液的毛细管分别***加入了抗生素的悬浮液中；每组驱避剂组相应的对照组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，并加入与所述抗生素同体积的缓冲液，然后将吸入缓冲液的毛细管分别***加入了缓冲液的悬浮液中；
(2)将步骤(1)中的驱避剂组和对照组中的细菌培养一段时间后，取出毛细管，用缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内的悬浮液转移至试管中，稀释后取相同体积的悬浮液进行平板培养，统计菌落数并计算趋化比值，计算公式为：(驱避剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量，选取非耐药杆菌趋化比值大于0.5，且耐药杆菌趋化比值小于0.5的驱避剂组中的抗生素作为非耐药杆菌的驱避剂。
优选地，所述耐药杆菌引诱剂的筛选方法为：
(1)设置多组引诱剂组和多组对照组；每一组引诱剂组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，然后将吸入杆菌生长的同一种营养物质的毛细管分别***同一组引诱剂组的悬浮液中，各组引诱剂组悬浮液中***的毛细管中吸入的营养物质不同；每组引诱剂组相应的对照组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，然后***吸入了与营养物质同体积的缓冲液的毛细管；
(2)将步骤(1)中的引诱剂组和对照组中的细菌培养一段时间后，取出毛细管，用缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内的悬浮液转移至试管中，稀释后取相同体积的悬浮液进行平板培养，统计菌落数并计算趋化比值，计算公式为：(引诱剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量，选取耐药杆菌趋化比值与非耐药杆菌趋化比值的差值大于0.5的引诱剂组中加入的营养物质作为耐药杆菌的引诱剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明提供的细菌印迹薄膜材料能够特异性识别耐药杆菌，特别是在耐药杆菌引诱剂及非耐药菌驱避剂的作用能够进一步有效选择性识别耐药菌，通过非耐药菌驱避剂的释放有效避免非耐药菌的干扰，通过耐药杆菌引诱剂的释放促进耐药杆菌的选择性移动和主动识别，从而达到有效精细分离耐药菌的目的。
(2)本发明与现有的细菌印迹聚合物材料相比，本发明利用细菌生物体本身的识别能力，将细菌趋化性引入分子印迹技术中，设计出可同时被动及主动识别耐药菌的细菌印迹薄膜材料，实现耐药菌的高选择性分离。
(3)本发明与现有的采用表面(界面)印迹技术制备的细菌印迹材料相比，本发明将多孔结构应用于细菌印迹材料中引诱剂及驱避剂的装载及缓慢释放，使印迹聚合物材料对耐药菌产生趋化性。在耐药菌的识别过程中引诱剂及驱避剂缓慢释放形成浓度梯度，在保证传统细菌印迹材料识别能力的基础上，可避免非耐药菌的干扰而促使耐药菌产生选择性移动和识别以达到选择性分离细菌的目的。该方法将传统的细菌被动识别与耐药菌趋化性诱导的主动识别相结合，提供了一种印迹薄膜材料分离耐药菌的新方法，提高耐药菌的选择性。
(4)本发明采用细菌趋化性诱导的主动识别增强细菌印迹薄膜材料对耐药菌的分离选择性，可应用于同源细菌(如非耐药菌与耐药菌)等结构相近细菌的分离。这种选择性分离同源细菌的分离方法解决了微生物分析检验领域亟待解决的难题，具有重要的生物及临床应用前景。
附图说明
图1是本发明一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的合成示意图。
图2是细菌印迹薄膜材料选择性吸附耐药大肠杆菌的过程。
图3是选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的电镜图。
图4是非印迹薄膜材料的电镜图。
图5是多孔结构对细菌印迹薄膜材料吸附效果的影响。
图6是单一菌液中细菌印迹薄膜材料在引诱剂辅助下吸附耐药大肠杆菌的效果。
图7是细菌印迹薄膜在混合菌液中吸附耐药大肠杆菌与非耐药大肠杆菌的效果。
图8是耐药大肠杆菌引诱剂的筛选。
图9是非耐药大肠杆菌驱避剂的筛选。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)和交联剂溶于适量环己烷中，并将溶液涂于玻璃板上，置于60～90℃进行微固化3～5min，其中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)与交联剂的体积比为1:0.08～0.15，环己烷体积为1～2mL。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，稀释到适当浓度(OD600＝0.06～0.08)，并取1～3mL细菌悬浮液滴加于灭菌的玻璃板上，在3～6℃下静置2～4h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。然后将载有模板细菌的玻璃板压入微固化的载有PDMS和交联剂的玻璃板表面，于37.5℃下保持6～8h，进一步在70～90℃下固化0.5～2h。
步骤二：将印迹薄膜从玻璃板上剥离，获得细菌印迹薄膜前体物。将该前体物在超声条件下利用去离子水清洗去除模板细菌，然后利用适量的甲基三氯硅烷溶液在适宜条件下对该前体物表面进行硅烷化处理，以增加其亲水性，其中甲基三氯硅烷溶液的浓度为0.05～0.15％，体积为5～10mL，反应条件为50～70℃下4～6h。将该前体物进一步利用去离子水超声清洗1～5min。将其分成直径均一的圆形薄片(直径1～2cm)，利用纳米微针在圆形薄片表面引入多孔结构，每片150～250个孔，在这些微孔中装载相应的细菌引诱剂或驱避剂，即得到细菌印迹薄膜材料。
本发明还提供了一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的选择性分离耐药大肠杆菌的过程方法，具体步骤如下：
取相同大小的细菌印迹薄膜材料并于紫外灯下照射30～60min进行消毒。利用PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释耐药大肠杆菌至OD600＝0.06～0.08。将上述细菌悬浮液加入EP管中，每管体积为2～3mL(EP管加满)。然后将消毒后的细菌印迹膜置于EP管顶部且与菌液接触，最后将200～400μL浓度为10-4～10-6mol L-1的耐药菌引诱剂/非耐药菌驱避剂溶液滴加至印迹膜表面，置于37.5℃培养1～4h。取出细菌印迹薄膜材料，并用pH 7.4的PBS溶液洗脱其上吸附的细菌，稀释80～200倍后涂平板，于37.5℃培养15～24h，进行菌落计数。
一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的制备，图1为本发明一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料的合成示意图。
实施例1
将2mL聚二甲基硅氧烷(PDMS)和0.2mL交联剂溶于1mL环己烷，并全部均匀涂于玻璃板上，在80℃条件下微固化4min后备用。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，用pH 7.4的PBS缓冲液清洗，并稀释到OD600＝0.07。取2mL上述细菌悬浮液滴加在灭菌的玻璃板上，在4℃下静置2h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。将涂有细菌的无菌玻璃板压入上述微固化的PDMS表面，于37.5℃下保持7h，进一步在80℃继续固化1h。将印迹薄膜从玻璃板上剥离，然后在超声条件下利用去离子水将模板细菌清洗去除。将印迹薄膜与10mL浓度为0.1％的甲基三氯硅烷溶液共同置于密闭空间，并在60℃条件下保持4h以完成印迹薄膜表面的硅烷化，进一步利用去离子水超声清洗1min，晾干。然后将印迹薄膜分成面积为2cm2的圆形薄片，用纳米微针(36孔)在清洗干净的圆形薄片表面打孔，每片膜180个孔，这些微孔用于渗透相应的细菌引诱剂或驱避剂。
通过电镜图可以看到细菌印迹薄膜材料表面存在耐药大肠杆菌形状的印迹孔穴(见图3)，而非印迹薄膜材料则没有印迹孔穴(见图4)。进一步探讨了纳米微针在该材料表面制备的多孔结构对耐药大肠杆菌吸附效果的影响，如图5所示，无多孔结构的细菌印迹薄膜吸附的耐药菌数量为58590CFU/片，而具有多孔结构的细菌印迹薄膜吸附的耐药菌数量为64410CFU/片。通过多次实验以及统计学分析表明多孔结构并不影响细菌印迹薄膜材料对耐药菌的吸附效果。
实施例2
将2mL聚二甲基硅氧烷(PDMS)和0.16mL交联剂溶于2mL环己烷，并全部均匀涂于玻璃板上，在90℃条件下微固化3min后备用。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，用pH 7.4的PBS缓冲液清洗，并稀释到OD600＝0.08。取1mL上述细菌悬浮液滴加在灭菌的玻璃板上，在3℃下静置3h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。将涂有细菌的无菌玻璃板压入上述微固化的PDMS表面，于37.5℃下保持6h，进一步在70℃继续固化2h。将印迹薄膜从玻璃板上剥离，然后在超声条件下利用去离子水将模板细菌清洗去除。将印迹薄膜与5mL浓度为0.15％的甲基三氯硅烷溶液共同置于密闭空间，并在50℃条件下保持6h以完成印迹薄膜表面的硅烷化，进一步利用去离子水超声清洗5min，晾干。然后将印迹薄膜分成面积为2cm2的圆形薄片，用纳米微针(36孔)在清洗干净的圆形薄片表面打孔，每片膜150个孔，这些微孔用于渗透相应的细菌引诱剂或驱避剂。
实施例3
将2mL聚二甲基硅氧烷(PDMS)和0.3mL交联剂溶于1.5mL环己烷，并全部均匀涂于玻璃板上，在60℃条件下微固化5min后备用。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，用pH 7.4的PBS缓冲液清洗，并稀释到OD600＝0.06。取3mL上述细菌悬浮液滴加在灭菌的玻璃板上，在6℃下静置4h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。将涂有细菌的无菌玻璃板压入上述微固化的PDMS表面，于37.5℃下保持8h，进一步在90℃继续固化0.5h。将印迹薄膜从玻璃板上剥离，然后在超声条件下利用去离子水将模板细菌清洗去除。将印迹薄膜与9mL浓度为0.05％的甲基三氯硅烷溶液共同置于密闭空间，并在70℃条件下保持4.5h以完成印迹薄膜表面的硅烷化，进一步利用去离子水超声清洗2min，晾干。然后将印迹薄膜分成面积为2cm2的圆形薄片，用纳米微针(36孔)在清洗干净的圆形薄片表面打孔，每片膜250个孔，这些微孔用于渗透相应的细菌引诱剂或驱避剂。
实施例4
将2mL四乙氧基硅烷和0.2mL交联剂溶于2mL正庚烷，并全部均匀涂于玻璃板上，在80℃条件下微固化4min后备用。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，用pH 7.4的PBS缓冲液清洗，并稀释到OD600＝0.07。取2mL上述细菌悬浮液滴加在灭菌的玻璃板上，在5℃下静置3h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。将涂有细菌的无菌玻璃板压入上述微固化的四乙氧基硅烷表面，于36.5℃下保持8h，进一步在70℃继续固化0.5h。将印迹薄膜从玻璃板上剥离，然后在超声条件下利用去离子水将模板细菌清洗去除。将印迹薄膜与5mL浓度为0.10％的六甲基二硅氮烷溶液共同置于密闭空间，并在60℃条件下保持5h以完成印迹薄膜表面的硅烷化，进一步利用去离子水超声清洗3min，晾干。然后将印迹薄膜分成面积为2cm2的圆形薄片，用纳米微针(36孔)在清洗干净的圆形薄片表面打孔，每片膜200个孔，这些微孔用于渗透相应的细菌引诱剂或驱避剂。
实施例5
将2mL二乙基二乙氧基硅烷和0.3mL交联剂溶于2mL正庚烷，并全部均匀涂于玻璃板上，在60℃条件下微固化5min后备用。同时取适量处于对数生长期的耐药大肠杆菌，用pH7.4的PBS缓冲液清洗，并稀释到OD600＝0.08。取2mL上述细菌悬浮液滴加在灭菌的玻璃板上，在4℃下静置2h使细菌沉降，然后在无菌通风环境中去除多余的溶剂。将涂有细菌的无菌玻璃板压入上述微固化的四乙氧基硅烷表面，于37℃下保持6h，进一步在90℃继续固化1h。将印迹薄膜从玻璃板上剥离，然后在超声条件下利用去离子水将模板细菌清洗去除。将印迹薄膜与7mL浓度为0.15％的六甲基二硅氮烷溶液共同置于密闭空间，并在70℃条件下保持4h以完成印迹薄膜表面的硅烷化，进一步利用去离子水超声清洗5min，晾干。然后将印迹薄膜分成面积为2cm2的圆形薄片，用纳米微针(36孔)在清洗干净的圆形薄片表面打孔，每片膜250个孔，这些微孔用于渗透相应的细菌引诱剂或驱避剂。
一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料分离耐药大肠杆菌的应用，图2为细菌印迹薄膜材料选择性吸附耐药大肠杆菌的过程图。
实施例6
将2.3mL OD600＝0.07的耐药大肠杆菌悬浮液置于2mL EP管中(EP管已加满)，然后将紫外灯消毒后的细菌印迹薄膜材料置于细菌悬浮液上方，将300μL浓度为10-5mol L-1的引诱剂溶液加至细菌印迹薄膜上方，将该装置于37.5℃培养2h。取出细菌印迹薄膜，用PBS(pH 7.4)轻轻冲洗膜表面的细菌，然后放入3.5cm的培养皿，加入1mL PBS(pH 7.4)吹打，将取吹打后的悬浮液稀释100倍，然后取100μL涂平板，37.5℃培养过夜后进行菌落计数。该细菌印迹薄膜材料在未装载引诱剂时(对照组)对目标细菌的吸附量为2.82×104CFU/片，而装载引诱剂甘氨酸后对目标细菌的吸附量增至8.08×104CFU/片，是对照组的5.1倍(见图6)。
实施例7：一种选择性分离耐药大肠杆菌的印迹薄膜材料分离混合菌液中耐药大肠杆菌的应用
将该细菌印迹薄膜材料置于混合细菌悬浮液(耐药大肠杆菌OD600＝0.06和非耐药大肠杆菌OD600＝0.06)上方，然后将150μL浓度为10-5mol L-1甘氨酸溶液(耐药大肠杆菌的引诱剂)以及150μL 1g L-1氨苄西林溶液(非耐药大肠杆菌的驱避剂)加至印迹薄膜材料上方，37.5℃培养2h。取出印迹薄膜材料，用PBS(pH＝7.4)轻轻冲洗膜表面的细菌，然后放入3.5cm的培养皿，加入1mL PBS(pH＝7.4)吹打，将取吹打后的悬浮液稀释100倍，然后取100μL涂平板，37.5℃培养过夜后进行菌落计数。
结果如图7所示，未使用引诱剂和驱避剂时，细菌印迹薄膜材料吸附耐药大肠杆菌(对照组)为7950CFU/片，使用引诱剂甘氨酸时，细菌印迹薄膜材料对耐药大肠杆菌的吸附量增加为79666CFU/片，约为非印迹薄膜材料的4.6倍；使用驱避剂氨苄西林时，细菌印迹薄膜材料吸附耐药菌耐药大肠杆菌为47333CFU/片，约为非印迹薄膜材料的3.3倍，表明该驱避剂对耐药大肠杆菌无驱避效果；当引诱剂甘氨酸与驱避剂氨苄西林联合使用时，细菌印迹薄膜材料吸附耐药大肠杆菌为1.01×105CFU/片，约为非印迹薄膜材料的5.7倍，因此引诱剂甘氨酸与驱避剂氨苄西林的联合使用能够有效降低干扰菌(非耐药大肠杆菌)对耐药大肠杆菌吸附效果的影响。上述结果进一步表明耐药菌引诱剂和非耐药菌驱避剂的使用能够有效促进细菌印迹薄膜对同源细菌混合液中耐药菌的精准分离。
实施例8：耐药大肠杆菌引诱剂与非耐药大肠杆菌驱避剂的筛选
基于耐药菌常需要的营养物质，选择葡萄糖、甲硫氨酸、甘氨酸等物质作为耐药大肠杆菌引诱剂。具体筛选方法如下：分别取OD600＝0.07的耐药大肠杆菌与非耐药大肠杆菌悬浮液于5000rpm离心3min，然后用pH 7.4的PBS缓冲液进行离心洗涤，反复三次，最后悬浮于2mL PBS缓冲液。然后将吸入了5μL浓度为10-5mol L-1引诱剂的一次性微量毛细管(已封住尾端)***细菌悬浮液，置于37.5℃条件下培养2h。对照组毛细管中以等量的PBS缓冲液代替营养物质，其余处理与引诱剂组相同。取出一次性微量毛细管，用PBS缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内悬浮液转移至EP管中，用PBS缓冲液稀释1000倍，进行细菌平板培养，统计细菌菌落数，利用公式(引诱剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量计算趋化比值。引诱剂的趋化比值越大则说明对细菌引诱作用越大。由于作为引诱剂的营养物质对目标菌(耐药大肠杆菌)和干扰菌(非耐药大肠杆菌)均有一定的引诱作用，因此利用目标菌与干扰菌趋化比值的差值筛选最优引诱剂，当两者差值大于0.5时，可认为引诱剂对目标菌(耐药大肠杆菌)的引诱作用明显高于干扰菌(非耐药大肠杆菌)，因此选择耐药大肠杆菌趋化比值为1.3，非耐药大肠杆菌趋化比值为0.7，趋化比值差值为0.6(大于0.5)的甘氨酸作为耐药大肠杆菌的引诱剂(见图8)。
同样基于影响细菌生命活动的物质，选择磺胺嘧啶、氯化钠、氨苄西林作为非耐药大肠杆菌驱避剂。驱避剂的筛选方法与引诱剂相似，具体筛选方法如下：分别取OD600＝0.07的耐药大肠杆菌与非耐药大肠杆菌悬浮液于5000rpm离心3min，然后用pH 7.4的PBS缓冲液进行离心洗涤，反复三次，最后悬浮于2mL PBS缓冲液，然后将50μL浓度为10-5mol L-1的驱避剂加入到细菌悬浮液中。将吸入了5μL pH 7.4的PBS缓冲液的一次性微量毛细管(已封住尾端)***细菌悬浮液，置于37.5℃条件下培养2h。对照组细菌悬浮液中以等量的PBS缓冲液代替抗生素，其余处理与驱避剂组相同。取出一次性微量毛细管，用PBS缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内悬浮液转移至EP管中，用PBS缓冲液稀释1000倍，进行细菌平板培养，统计细菌菌落数，利用公式(驱避剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量计算趋化比值。驱避剂的趋化比值越大则说明对细菌的驱避作用越大，当趋化比值大于0.5时，可认为抗生素对细菌具有明显的驱避作用，因此根据趋化比值选择细菌的最优驱避剂。驱避剂对非耐药大肠杆菌具有驱避作用(趋化比值大于0.5)，对目标菌(耐药大肠杆菌)无明显驱避作用(趋化比值小于0.5)，因此选取非耐药大肠杆菌趋化比值为4.4，耐药大肠杆菌趋化比值为0.2的氨苄西林作为非耐药大肠杆菌驱避剂(见图9)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将硅氧烷类主剂与交联剂溶于挥发性烷烃溶剂中，并涂于基板上，然后加热进行半固化，得到半固化膜；
(2)取耐药杆菌悬浮液，滴加在灭菌的基板上静置，使所述耐药杆菌沉降，然后在无菌环境中除去溶剂；
(3)将步骤(2)中得到的载有所述耐药杆菌的基板压入步骤(1)得到的半固化膜中，并保持一段时间，该过程中耐药杆菌保持完整的形态，且半固化膜中的基团与耐药杆菌表面发生相互作用；然后加热固化，使所述半固化膜完全固化；
(4)将步骤(3)得到的印迹膜从基板上剥离，洗去该印迹膜上作为模板分子的耐药杆菌，形成与所述耐药杆菌尺寸和结构相互匹配的印迹孔穴；然后将甲基三氯硅烷或六甲基二硅氮烷与该印迹膜共同置于密闭容器中，挥发的甲基三氯硅烷或六甲基二硅氮烷结合于该印迹膜表面进行硅烷化处理，以增强印迹膜的亲水性；在印迹膜上引入微孔结构，所述微孔结构用于将引诱剂和驱避剂从印迹膜的一侧渗透到另一侧，即得到选择性分离耐药杆菌的印迹薄膜材料。
2.如权利要求1所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述硅氧烷类主剂为聚二甲基硅氧烷、四乙氧基硅烷或二乙基三乙氧基硅烷，所述挥发性烷烃溶剂为环己烷或正庚烷。
3.如权利要求1所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述半固化是在60～90℃条件下加热3～5min；步骤(2)中所述静置的温度为3～6℃，以降低细菌游动活力，从而促进细菌沉降；步骤(3)中载有所述耐药杆菌的基板压入半固化膜后，在36.5℃～38℃下保持6h～8h；步骤(3)中所述固化是在70～90℃条件下加热0.5～2h。
4.如权利要求1所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的耐药杆菌处于对数生长期，稀释后滴加在灭菌的基板上静置，稀释后的耐药杆菌悬浮液的光密度值为0.06～0.08。
5.如权利要求1所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料的制备方法，其特征在于，所述耐药杆菌为耐药大肠杆菌、耐药肺炎杆菌或耐药芽孢杆菌。
6.如权利要求1-5任一所述方法制备得到的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料，其特征在于，所述印迹膜材料表面分布有与所述耐药杆菌尺寸和结构相互匹配的印迹孔穴，且所述印迹膜材料表面分布有微孔结构。
7.如权利要求6所述的选择性分离耐药杆菌的印迹膜材料用于分离耐药杆菌的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将耐药杆菌和非耐药杆菌的混合液加入容器中，并且加满至容器口，然后将印迹膜材料置于容器顶部且与菌液接触；
(2)将所述耐药杆菌耐受的抗生素和杆菌生长的营养物质滴加至印迹膜表面，并通过印迹膜上的微孔结构渗透进入菌液中；所述耐药杆菌耐受的抗生素作为非耐药杆菌的驱避剂，所述杆菌生长的营养物质作为耐药杆菌的引诱剂，所述驱避剂和引诱剂的共同作用促使耐药大肠杆菌产生选择性移动和识别，直至到达印迹膜的印迹孔穴中，实现耐药杆菌的分离。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述非耐药杆菌的驱避剂的筛选方法为：
(1)设置多组驱避剂组和多组对照组；每一组驱避剂组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，并加入同一种抗生素，各组驱避剂组中加入的抗生素不同，然后将吸入缓冲液的毛细管分别***加入了抗生素的悬浮液中；每组驱避剂组相应的对照组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，并加入与所述抗生素同体积的缓冲液，然后将吸入缓冲液的毛细管分别***加入了缓冲液的悬浮液中；
(2)将步骤(1)中的驱避剂组和对照组中的细菌培养一段时间后，取出毛细管，用缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内的悬浮液转移至试管中，稀释后取相同体积的悬浮液进行平板培养，统计菌落数并计算趋化比值，计算公式为：(驱避剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量，选取非耐药杆菌趋化比值大于0.5，且耐药杆菌趋化比值小于0.5的驱避剂组中的抗生素作为非耐药杆菌的驱避剂。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述耐药杆菌的引诱剂的筛选方法为：
(1)设置多组引诱剂组和多组对照组；每一组引诱剂组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，然后将吸入杆菌生长的同一种营养物质的毛细管分别***同一组引诱剂组的悬浮液中，各组引诱剂组悬浮液中***的毛细管中吸入的营养物质不同；每组引诱剂组相应的对照组为取耐药杆菌与非耐药杆菌悬浮液分别于缓冲液中，然后***吸入了与营养物质同体积的缓冲液的毛细管；
(2)将步骤(1)中的引诱剂组和对照组中的细菌培养一段时间后，取出毛细管，用缓冲液清洗毛细管外壁，并将毛细管内的悬浮液转移至试管中，稀释后取相同体积的悬浮液进行平板培养，统计菌落数并计算趋化比值，计算公式为：(引诱剂组细菌数量-对照组细菌数量)/对照组细菌数量，选取耐药杆菌趋化比值与非耐药杆菌趋化比值的差值大于0.5的引诱剂组中加入的营养物质作为耐药杆菌的引诱剂。
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