CN111892637B - 一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种7‑脱氢‑25‑羟基胆固醇的制备方法,包括如下步骤:首先将式1所示的化合物与式2所示的化合物反应得到式3所示的化合物;其次将式3所示的化合物加入到嗜盐放线多孢放线菌的发酵液中进行发酵处理,得到式4所示的化合物;最后将式4所示的化合物经还原反应得到所述7‑脱氢‑25‑羟基胆固醇。本发明提供了一种7‑脱氢‑25‑羟基胆固醇的制备方法,利用式1所示的化合物为底物,通过化学和生物相结合的方法合成得到了7‑脱氢‑25‑羟基胆固醇,不仅原料简单易得,而且反应步骤简便,对25‑羟基的选择性高,副产物较少,是一种较为理想的合成7‑脱氢‑25‑羟基胆固醇的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,涉及有机化学技术领域。
背景技术
25-羟基维生素D3作为一种饲料添加剂,已在全世界范围内广泛使用。根据文献Applied Microbiology and Biotechnology,1992,38(2):152-157的报道,可用微生物Amycolata sp.strains将维生素D3氧化生产25-羟基维生素D3,但是该氧化过程选择性差,会进一步氧化生产1,25-二羟基维生素D3、及24-羟基、26-羟基维生素D3等多种杂质。这些杂质与目标产物混合在一起,很难分离纯化,并且维生素D3的转化收率低,发酵浓度低,经济效益差,特别是副产物1,25-二羟基维生素D3,是一种活性最强的维生素D3代谢物,如果不完全除去,在饲料添加剂中存在会造成养殖动物大量的钙化,导致死亡。
另一种生产25-羟基维生素D3的方法是通过制备7-脱氢-25-羟基胆固醇,现有技术中生产7-脱氢-25-羟基胆固醇大多采用化学合成方法,例如申请号为201510251926.2的中国专利,其公开了利用25-羟基胆固醇反应得到7-脱氢-25-羟基胆固醇,反应式如下:
但是该方法的起始物料25-羟基胆固醇并不易得,并且存在反应收率低,纯化难,生产成本高,7-位氧化选择性差等问题;
或者,也有以24-脱氢-7脱氢胆固醇为起始物料,反应式如下(Journal ofChemical Research,2016,40(4):213-215.):
但是该方法同样存在起始物料24-脱氢-7-脱氢胆固醇原料不易得,以及24-位氧化选择性差,脱溴难以实现等问题。
发明内容
本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,用于解决现有的制备方法中原料不易得,选择性差等问题。
本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,包括如下步骤:
1)、将式1所示的化合物与式2所示的化合物反应得到式3所示的化合物;
2)、将式3所示的化合物加入到保藏编号为CGMCC4.1219的嗜盐放线多孢放线菌的发酵液中进行发酵处理,得到式4所示的化合物;
3)、将式4所示的化合物经还原反应得到所述7-脱氢-25-羟基胆固醇;
在式1-式4中,R1为氢、酰基保护基、苄基保护基、硅烷基保护基、醚保护基中的一种;R2为氢、苯基、对甲苯基、间甲苯基、对硝基苯基、间硝基苯基、甲基、乙基、异丙基、苄基中的一种。
本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,7-脱氢-25-羟基胆固醇的结构式如下图所示:
制备方法具体包括:首先,选择式1所示的化合物为原料,采用式2所示的化合物将式1所示化合物经过5,7共轭双烯保护得到式3所示的化合物;其次,采用生物发酵的方法,将式3所示的化合物加入到保藏编号为CGMCC4.1219的嗜盐放线多孢放线菌的发酵液中继续进行发酵处理,利用该菌株将式3所示的化合物转化得到式4所示的化合物,具体地,该嗜盐放线多孢放线菌的拉丁学名为Actinopolyspora halophila,保藏编号为CGMCC4.1219,保藏日期为1991年01月01号,保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心;最后将式4所示的化合物经过还原反应,将式2所示的双烯保护基团脱去后得到7-脱氢-25-羟基胆固醇。在式1-式4所示的化合物中,R1为氢、酰基保护基、苄基保护基、硅烷基保护基、醚中的一种,其中,酰基保护基是含有-COR基团的保护基,例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、苯甲酰基、对甲苯酰基、间甲苯酰基、对氯苯酰基、间氯苯酰基、对硝基苯甲酰基、间硝基苯甲酰基、3,5-二硝基苯甲酰基等;苄基保护基是指含有-CH2C6H5基团的保护基,例如对甲基苄基、间甲基苄基、对氯苄基、间氯苄基、苄基;硅烷基保护基是指包含有硅烷的基团,例如三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、二甲基叔丁基硅烷基等。R2为氢、苯基、对甲苯基、间甲苯基、对硝基苯基、间硝基苯基、甲基、乙基、异丙基、苄基中的一种。本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,利用式1所示的化合物为底物,通过化学和生物相结合的方法合成得到了7-脱氢-25-羟基胆固醇,不仅原料简单易得,而且反应步骤简便,对25-位碳原子的羟基化的选择性高,副产物较少,是一种较为理想的合成7-脱氢-25-羟基胆固醇的方法。
在一种具体实施方式中,为了进一步降低原料的成本,可对R1或R2进行进一步选择,具体地,R1为氢、乙酰基、苯甲酰基中的一种;进一步地,R1为H,即原料为7-脱氢胆固醇。
申请人研究发现,当式2所示的化合物中R2基团不同时,终产物7-脱氢胆固醇的收率也不相同,为了进一步提高终产物的收率,R2为苯基、间苯甲基、对硝基苯基、间硝基苯基、苄基中的一种;进一步地,R2为对硝基苯基、间硝基苯基中的一种;更进一步地,R2为对硝基苯基,即式2所示的化合物为4-(对硝基苯基)-1,2,4-三氮唑-3,5-二酮。
以下对本发明具体制备步骤进行详细介绍:
首先,步骤1)中,将式1所示的化合物与式2所示的化合物反应得到式3所示的化合物:
具体地,将式1所示的化合物和式2所示的化合物在溶剂中混合,反应得到式3所示的化合物,反应收率为82-99%。其中,式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比为1:(0.6-2),进一步地,式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比为1:(0.9-1.5),更进一步地,式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比为1:1.05;溶剂可以为化学反应中所接受的溶剂,例如:乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃,进一步地,溶剂为二氯甲烷。
其次,步骤2)中,采用生物发酵的方法将式3所示的化合物转化得到式4所示的化合物,具体包括:通过常规方法对该嗜盐放线多孢放线菌进行液体发酵,随后将式3所示的化合物加入到该放线菌的发酵液中继续进行发酵处理,利用该株嗜盐放线多孢放线菌将式3所示的化合物转化得到式4所示的化合物,具体地:
该菌株的基内菌丝(营养菌丝)为淡黄色,分枝且有横隔,气生菌丝为白色,分枝,产生卷曲的孢子链,孢子椭圆形;菌丝成节段,在节段间的凹陷处或者节段中间长出芽的方式进行出芽生长。菌落淡黄色,圆形,褶皱,致密,菌落色素为黄色。
将菌株接种到含有营养源的固体培养基中进行活化培养,并采用常规液体发酵法对该菌株进行发酵处理,得到包含该菌株的发酵液,所述发酵液通过包括以下过程的制备方法得到:
将所述嗜盐放线多孢放线菌加入到液体培养基中,在23-33℃、pH为6-7.5的条件下培养2-8天。
具体地,首先,将该嗜盐放线多孢放线菌在固体培养基上生长好的菌块加入到配置好的液体培养基中,并进行发酵处理。其中,液体培养基为现有技术中常用的培养基,包括各种合成、半合成或天然介质液体培养基。该培养基包括碳源、氮源,其中,碳源可以为葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖和蔗糖中的一种或多种。氮源可以为有机氮源或无机氮源,有机氮源可以为蛋白胨、肉提取物、大豆粉、酪蛋白、氨基酸、酵母提取物和尿素等有机氮源中的一种或多种,无机氮源可以为硝酸钠和硫酸铵中的一种或两种,此外,还可以添加盐,例如氯化钠,氯化钾,碳酸钙,硫酸镁,磷酸钠,磷酸钾和氯化钴以及其他重金属盐和维生素等成分。当在培养过程中出现泡沫时,可以在培养基中添加现有技术中常用的消泡剂。
在对该菌株进行发酵过程中,应当控制发酵条件保证该菌株的良好生长。本领域技术人员可依据现有技术控制发酵条件,具体地,可将该菌株在23-33℃、pH为6-7.5的条件下培养2-8天,本领域技术人员可以根据该菌株的种类、特性以及外部条件适当地改变上述培养条件。
当该菌株的生长状况稳定后,在所述发酵液中加入步骤1得到的式3所示的化合物,继续进行发酵处理,利用该菌株将式3所示的化合物转化得到式4所示的化合物。
经申请人研究发现,式3所示的化合物的添加量对式4所示的化合物的收率影响较大,申请人发现,随着式3所示的化合物的浓度不断提高,式4所示的化合物的收率也不断提高,但当式3所示的化合物的浓度大于0.6mg/L时,式4所示的化合物的收率反而降低,因此,为了进一步提高式4所示化合物的收率,在所述发酵液中,式3所示的化合物的添加量为0.15-0.60mg/L,即基于每升的发酵液,式3所示的化合物的添加量为0.15-0.60mg。
进一步地,所述发酵液中,式3所示的化合物的添加量为0.5mg/L。
式3所示的化合物可以以粉末状或者溶液的形式加入到发酵液中,其中,溶剂可以为乙醇,即将式3所示的化合物溶于乙醇,并将其乙醇溶液加入到发酵液中。
将式3所示化合物加入到所述发酵液中,在27-31℃条件下继续发酵,本发明还对发酵过程中式4所示化合物的产量进行分析,研究发现,当在发酵液中加入式3所示的化合物后,继续发酵1-3天时,式4所示的化合物的收率最高。由于菌株的生长状况和发酵条件的差异,在发酵过程中,可使用高效液相监控发酵进程,以判断最佳发酵时间。具体地,高效液相监控方法包括:取适量发酵液并加入甲醇,混合均匀并离心后取上清液用HPLC分析,并按外标法检测式3所示的化合物和式4所示化合物的含量,其中,色谱柱为C18型柱,其内径为4.6mm,长度为150mm,粒度为5μm,检测波长:282nm,柱温为30℃,流速为1.5mL/min,进样量为20uL,记录时间为主峰保留时间的2倍。
当式3所示的化合物基本转化得到式4所示的化合物时,即可终止发酵,并从发酵产物中得到式4所示的化合物,为了后续发酵使用,还可对菌株进行回收保存。
本领域技术人员可依据常规手段从发酵产物中得到式4所示的化合物,具体地:将过滤掉菌株后的发酵产物转移到提取罐中,加同等体积的溶剂进行萃取,萃取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯、氯仿等有机溶剂中的一种,例如,乙酸乙酯。萃取后的有机相经浓缩并用柱层析纯化得到式4所示的化合物。
菌株回收保存方法包括:发酵结束后,直接通过离心或过滤将细胞从发酵产物中分离出来,并将分离得到的细胞悬浮在溶液中,作为待使用的细胞悬浮液保存备用。其中,溶液可以为上述使用到的液体培养基或细胞缓冲溶液,细胞缓冲液可以为三(羟甲基)氨基甲烷-乙酸,三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸,琥珀酸钠,柠檬酸钠,磷酸钠和钾磷酸盐中的一种或多种,细胞缓冲溶液的pH值优选为7.0-8.5。
最后,将式4所示的化合物经过还原反应得到7-脱氢-25-羟基胆固醇,收率80%-95%。
例如:将式4所示的化合物溶于四氢呋喃并加入四氢锂铝反应得到所述7-脱氢-25-羟基胆固醇。具体地,将式4所示的化合物溶于四氢呋喃中,并缓慢的加入过量的四氢锂铝,加热回流后利用高效液相监控反应进程,待反应完全后使用常规柱层析的方法提纯得到7-脱氢-25-羟基胆固醇。
综上,本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,利用式1所示的化合物为底物,通过化学和生物相结合的方法合成得到了7-脱氢-25-羟基胆固醇,不仅原料简单易得,而且反应步骤简便,对25-羟基的选择性高,副产物较少,是一种较为理想的合成7-脱氢-25-羟基胆固醇的方法。
本发明的实施,至少具有以下优势:
1、本发明提供了一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,利用式1所示的化合物为底物,通过化学和生物相结合的方法合成得到了7-脱氢-25-羟基胆固醇,不仅原料简单易得,而且反应步骤简便,对25-羟基的选择性高,副产物较少,是一种较为理想的合成7-脱氢-25-羟基胆固醇的方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明的实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备包括如下步骤:
步骤1:将20g的式1-1所示的化合物中溶于200ml的二氯甲烷,并加入12g的式2-1所示的化合物,采用加热回流的方式反应30min,反应结束后进行减压蒸馏,随后加入300ml的乙酸乙酯继续加热回流,待冷却到20-25℃时过滤,得到28.8g的式3-1所示的化合物,收率为90%;
1H NMR(CDCl3)δ:8.4(d,2H),7.8(d,2H),5.9(s,2H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.22-2.02(m,23H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
步骤2a:将0.5g嗜盐放线多孢放线菌固体菌种加入到液体培养基中,在28℃、pH为7.0的条件下以转速为220rpm、振幅为70mm摇动培养2天,得到发酵液。
其中,液体培养基的制备方法包括:在400ml的锥形瓶中加入100ml水,1.5%葡萄糖,1.5%大豆粉,0.5%玉米浆,3.4%氯化钠,0.2%碳酸钙,调节pH为7.0,在120℃下灭菌20min,得到该液体培养基。
步骤2b:按照0.5mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并溶于乙醇配制成溶液后加入到步骤2a得到的发酵液中,在30℃的旋转振动器中继续发酵17-36h,发酵结束后,加入与发酵液等体积的乙酸乙酯,萃取两次后将有机相减压浓缩并提纯后得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.33mg/L,收率为66%:
其中,提纯采用柱层析的方法,使用Inertsil Prep-ODS(20×250mm)的层析柱,在流动相为90%甲醇、流速为10ml/min条件下提纯得到式4-1所示的化合物。
1H NMR(CDCl3)δ:8.4(d,2H),7.8(d,2H),5.9(s,2H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.22-2.02(m,22H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
步骤3:称取13g式4-1所示的化合物溶于130mL的无水四氢呋喃中,待降温至-10-0℃后,缓慢加入含有7g四氢锂铝的四氢呋喃溶液,控制反应温度低于20℃,待四氢锂铝加入完成后,加热回流进行还原反应,待反应结束后,降温至-10-0℃,缓慢滴加饱和酒石酸水溶液,随后,加入200ml的乙酸乙酯提取三次,无水硫酸钠干燥2小时后,过滤、旋干、甲醇重结晶后,得7-脱氢-25-羟基胆固醇7g,收率为83%。
7-脱氢-25-羟基胆固醇为纯白色固体,熔点185-187℃。
1H NMR(CDCl3)δ:5.55(m,1H),5.36(m,1H),3.62(s,1H),1.22-2.55(m,26H),1.23(s,6H),0.94(d,6H),0.55(s,3H)。ESI-MS(m/z):423.37[M+Na]+
实施例2
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例1,具体条件如下:步骤2b中,按照0.7mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.28mg/L,收率为40%。
实施例3
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例1,具体条件如下:步骤2b中,按照0.3mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.11mg/L,收率为37%。
实施例4
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例1,具体条件如下:步骤2a中,液体培养基中包括2%葡萄糖,1.0%大豆粉,0.5%玉米浆,磷酸钾0.04%,2.04%氯化钠,0.2%碳酸钙,100mL的水,调节pH为7.4。
步骤2b中,按照0.5mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.38mg/L,收率为76%。
实施例5
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例4,具体条件如下:步骤2b中,按照0.7mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.32mg/L,收率为46%。
实施例6
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例4,具体条件如下:步骤2b中,按照0.3mg/L的添加量称取式3-1所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-1所示的化合物,式4-1所示的化合物的浓度为0.14mg/L,收率为47%。
实施例7
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备包括如下步骤:
本实施例提供的制备方法参见实施例4,具体条件如下:
步骤1:将20g的式1-1所示的化合物溶于200ml的二氯甲烷,并加入12g的式2-2所示的化合物,得到26.2g的式3-2所示的化合物,收率为82%;
1H NMR(CDCl3)δ:7.58(t,3H),7.43(d,2H),5.9(s,2H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.22-2.02(m,23H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
步骤2b:按照0.5mg/L的添加量称取式3-2所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-2所示的化合物,式4-2所示的化合物的浓度为0.31mg/L,收率为62%。
1H NMR(CDCl3)δ:7.58(t,3H),7.43(d,2H),5.9(s,2H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.22-2.02(m,23H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
实施例8
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法可参考实施例7,具体条件如下:步骤2b中,按照0.7mg/L的添加量称取式3-2所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-2所示的化合物,式4-2所示的化合物的浓度为0.28mg/L,收率为40%。
实施例9
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法可参考实施例7,具体条件如下:步骤2b中,按照0.3mg/L的添加量称取式3-2所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-2所示的化合物,式4-2所示的化合物的浓度为0.08mg/L,收率为27%。
实施例10
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备包括如下步骤:
本实施例提供的制备方法参见实施例4,具体条件如下:
步骤1:将20g的式1-1所示的化合物溶于200ml的二氯甲烷,并加入12g的式2-3所示的化合物,得到27.52g的式3-3所示的化合物,收率为86%。
1H NMR(CDCl3)δ:5.9(s,2H),4.41(m,1H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.48-2.02(m,12H),1.47(d,6),1.22-1.46(m,10H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
步骤2b:按照0.5mg/L的添加量称取式3-3所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-3所示的化合物,式4-3所示的化合物的浓度为0.21mg/L,收率为42%。
1H NMR(CDCl3)δ:5.9(s,2H),4.41(m,1H),3.96(m,1H),2.80-2.85(m,1H),2.55-2.58(m,1H),2.39-2.43(m,1H),2.29(dd,J=7.6,13.0Hz,1H),2.15-2.23(m,1H),1.48-2.02(m,12H),1.47(d,6),1.22-1.46(m,10H),1.23(s,6H),0.94(d,J=6.4Hz,3H,21-CH3),0.55(s,3H,18-CH3)。
实施例11
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例10,具体条件如下:步骤2b中,按照0.7mg/L的添加量称取式3-3所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-3所示的化合物,式4-3所示的化合物的浓度为0.28mg/L,收率为40%。
实施例12
本实施例提供的7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法参见实施例10,具体条件如下:步骤2b中,按照0.3mg/L的添加量称取式3-3所示的化合物,并加入到步骤2a得到的发酵液中发酵得到式4-3所示的化合物,式4-3所示的化合物的浓度为0.07mg/L,收率为23%。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)、将式1所示的化合物与式2所示的化合物反应得到式3所示的化合物;
2)、将式3所示的化合物加入到保藏编号为CGMCC4.1219的嗜盐放线多孢放线菌的发酵液中进行发酵处理,所述发酵处理包括:将式3所示化合物加入到所述发酵液中,在27-31℃条件下发酵1-3天,得到式4所示的化合物;
3)、将式4所示的化合物经还原反应得到所述7-脱氢-25-羟基胆固醇;
在式1-式4中,R1为氢;R2为苯基、对硝基苯基中的一种;
所述发酵液中,式3所示的化合物的添加量为0.5mg/L;
步骤2)中,所述发酵液通过包括以下过程的制备方法得到:
将所述嗜盐放线多孢放线菌加入到液体培养基中,在23-33℃、pH为6-7.5的条件下培养2-8天;
所述液体培养基包括碳源、氮源和盐,碳源可以为葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖和蔗糖中的一种或多种;氮源为有机氮源或无机氮源,有机氮源可以为蛋白胨、肉提取物、大豆粉、酪蛋白、氨基酸、酵母提取物和尿素等有机氮源中的一种或多种,无机氮源为硝酸钠和硫酸铵中的一种或两种,盐为氯化钠,氯化钾,碳酸钙,硫酸镁,磷酸钠,磷酸钾和氯化钴中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中,式1所示化合物与式2所示化合物的摩尔比为1:(0.6-2)。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述发酵处理得到的发酵产物经萃取、提纯后得到式4所示的化合物。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤3)包括:
将式4所示的化合物溶于四氢呋喃并加入四氢锂铝反应得到所述7-脱氢-25-羟基胆固醇。
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