CN111879934A - 一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒 - Google Patents

一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒 Download PDF

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杨德全
沈海潇
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Abstract

本发明提供了一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒，属于免疫检测技术领域。犬癌胚抗原免疫梳以梳子形的PVC板为底板，每个PVC板上带有8～12个梳齿；所述梳齿的宽度为2～4mm，所述梳齿的长度为10～12mm，每两个梳齿的间距为5～7mm；在每个梳齿的一面固定有包被着80～120μg/ml癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜。本发明还提供了包括所述免疫梳的犬癌胚抗原检测试剂盒。该试剂盒利用双抗夹心的免疫学原理进行犬癌胚抗原的检测，使检测过程保留了常规ELISA的敏感、特异的优点，同时又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，达到快速诊断的目的，可在宠物医院就地进行诊断检测。

Description

一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒。
背景技术
随着宠物犬数量的增多，以及饲养和医疗条件的不断改善，犬类的增生性疾病特别是各类良恶性肿瘤的发病率不断提高。宠物医院对肿瘤疾病的检测手段有一定的局限性。肿瘤标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，癌胚抗原作为一种比较成熟的广谱肿瘤标记物已经运用在了常规体检中。当前检测癌胚抗原的技术手段主要依赖于ELISA和化学发光等检测方法，这些检测方法普遍存在检测操作繁琐，造成检测时间长，而且需借助于大型特殊仪器实现检测，需要去专门的检测机构才能得到检测结果，因此检测不方便。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒，具有快速、简便、经济、不需任何特殊仪器的特点，能够实现快速检测。
本发明提供了一种犬癌胚抗原免疫梳，所述免疫梳以梳子形的PVC板为底板，每个PVC板上带有8～12个梳齿；所述梳齿的宽度为2～4mm，所述梳齿的长度为10～12mm，每两个梳齿的间距为5～7mm；
在每个梳齿的一面固定有包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜；
所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度为80～120μg/ml。
优选的，所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度为100μg/ml。
优选的，所述包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜是将癌胚抗原单克隆抗体溶解于包被液中，得到捕获抗体溶液包被在硝酸纤维素膜上，将晾干后的NC膜用封闭液封闭得到。
优选的，所述包被液为pH值9.6的NBS缓冲液；
所述包被的温度为37℃；所述包被的时间为1h。
优选的，所述封闭液为含质量浓度3％的BSA的PBS缓冲液；
所述封闭的温度为4℃，所述封闭的时间为12h。
本发明提供了一种犬癌胚抗原检测试剂盒，包括所述犬癌胚抗原免疫梳。
优选的，还包括酶标抗体、显色液、洗涤液、阳性参考品和96孔板。
优选的，所述酶标抗体的工作稀释度为1:400；所述酶标抗体的母液浓度为1.92mg/ml。
优选的，所述阳性参考品的工作浓度为5ng/ml。
优选的，所述酶标抗体中酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液为DAB显色液。
本发明提供的犬癌胚抗原免疫梳和检测试剂盒，将捕获抗体包被在蛋白吸附力极强的硝酸纤维素膜上，再将硝酸纤维素膜固定在PVC板的梳齿上，检测时利用双抗夹心的免疫学原理进行犬癌胚抗原的检测。本发明提供的犬癌胚抗原免疫梳是基于检测试纸条检测和ELISA检测的结合，将捕获抗体包被在可移动的PVC板的NC膜上，使检测过程实现快速、简便、经济、不需任何特殊仪器，保留了常规ELISA的敏感、特异的优点，同时，又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，缩短了实验周期，完全可在宠物医院就地进行诊断检测，达到快速诊断的目的。
附图说明
图1为本发明提供的犬癌胚抗原免疫梳实物图；
图2为未固定硝酸纤维素膜的PVC板实物图；
图3为不同浓度包被抗体与以及不同稀释度的酶标抗体的显色结果；
图4为不同包被液的显色结果；
图5为不同包被温度的显色结果；
图6为不同封闭液的显色结果；
图7为不同封闭条件的显色结果；
图8为不同酶标抗体反应条件的显色结果；
图9为检测灵敏度结果。
具体实施方式
本发明提供了一种犬癌胚抗原免疫梳，所述免疫梳以梳子形的PVC板为底板，每个PVC板上带有8～12个梳齿；所述梳齿的宽度为2～4mm，所述梳齿的长度为10～12mm，每两个梳齿的间距为5～7mm；
在每个梳齿的一面固定有包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜；
所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度为80～120μg/ml。
在本发明中，所述包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜优选是将癌胚抗原单克隆抗体溶解于包被液中，得到捕获抗体溶液包被在硝酸纤维素膜上，将晾干后的NC膜用封闭液封闭得到。所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度优选为100μg/ml。本发明对癌胚抗原单克隆抗体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的癌胚抗原单克隆抗体即可。在本发明实施例中，所述癌胚抗原单克隆抗体购自上海领潮生物科技有限公司，批号L1C00202。所述包被液优选为pH值9.6的NBS缓冲液。与pH值7.4的PBS缓冲液相比，pH值9.6的NBS缓冲液作为包被液有利于提高免疫梳的检测灵敏度。所述包被的温度优选为37℃；所述包被的时间优选为1h。所述37℃包被温度比室温包被更有利于癌胚抗原单克隆抗体稳定的固定在NC膜上，从而提高检测灵敏度和稳定性。所述捕获抗体溶液包被在硝酸纤维素膜上优选点布在NC膜上，固定时将点布有捕获抗体的NC膜裁剪下来备用。
在本发明中，所述封闭液优选为含质量浓度3％的BSA的PBS缓冲液；与脱脂牛奶作为封闭液相比，用BSA的PBS缓冲液封闭NC膜，有利于提高封闭效果；同时与含5％的BSA的PBS缓冲液相比，含3％的BSA的PBS缓冲液就能够实现较好的封闭效果。所述封闭的温度为4℃，所述封闭的时间为12h。37℃封闭2h后晾干、室温封闭2h后晾干与4℃过夜封闭后晾干相比，封闭效果差异不大，但是4℃过夜封闭后晾干对检测的连贯性以及便捷性最有利。
本发明对所述硝酸纤维素膜固定在PVC板的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的固定方法即可。在本发明实施例中，所述硝酸纤维素膜的固定方法是粘贴在PVC板上。
在本发明中，所述免疫的制备方法优选如下：将PVC板裁剪成梳齿状，将包被着癌胚抗原单克隆抗体的NC膜裁剪后依次固定梳齿状PVC板齿状部分，最后分装到自封袋中4℃保存备用，见图1。所述PVC板裁剪成梳齿状是指PVC板的梳齿可直接***96孔检测板一列8孔或一行12孔中；所述梳齿的齿宽优选为3mm、齿长优选为11mm、每两齿的间距优选为6mm，具体如图2所示。
在本发明中，所述免疫梳的使用方法为将待测样品溶液添加到96孔板中，将所述免疫梳同时***反应孔中孵育，孵育结束后拔出免疫梳后洗涤，再***添加有酶标抗体的反应孔中孵育，孵育结束后拔出免疫梳，再次洗涤，***显色液中显色，根据检测阳性参考品的梳齿显示强弱来判断检测样品中是否含犬癌胚抗原。本发明对所述酶标抗体、洗涤用溶液以及显色液等试剂没有特殊限制，采用本领域所熟知的上述试剂的来源即可。
本发明提供了一种犬癌胚抗原检测试剂盒，包括所述犬癌胚抗原免疫梳。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括酶标抗体、显色液、洗涤液、阳性参考品和96孔板。所述酶标抗体的工作稀释度优选为1:400；所述酶标抗体的母液浓度为1.92mg/ml。与酶标抗体用PBS溶液分别以1:1600、1:800、1:100的浓度梯度稀释相比，酶标抗体稀释倍数为1:400时，显色达到最深，检测灵敏度最高。本发明对所述酶标抗体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的癌胚抗原的单克隆抗体即可。在本发明实施例中，所述癌胚抗原的单克隆抗体购自上海领潮生物科技有限公司，批号L1C00205。所述酶标抗体的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶标记试剂盒进行标记即可。在本发明实施例中，所述酶标记试剂盒为HRP酶标记试剂盒。
在本发明中，采用上述试剂盒检测，检测灵敏度为5ng/ml，因此，将所述阳性参考品的工作浓度优选为5ng/ml。本发明对阳性参考品癌胚抗原的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的癌胚抗原即可。在本发明实施例中，所述癌胚抗原购自上海领潮生物科技有限公司，批号L2C01001。在阳性样品判断时，以阳性参考品的显色时间为准，若检测样品检出颜色较阳性参考品的颜色深，则表示该样品中CEA浓度≥5ng/ml，检测样品中含有癌胚抗原。
在本发明中，所述酶标抗体中酶优选为辣根过氧化物酶时，所述显色液优选为DAB显色液。所述洗涤液为PBST缓冲液，具体为含有0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(PBST)。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法大体与上述免疫梳的使用方法相同。所述孵育优选在37℃条件孵育1h。与室温孵育0.5h或1h以及37℃孵育0.5h相比，37℃条件孵育1h使免疫反应更加充分，结合程度最高，显色最深，确定37℃孵育1小时为最适酶标反应条件。
本发明提供的试剂盒使利用双抗夹心的免疫学原理进行犬癌胚抗原的检测，所述试剂盒具有快速、简便、经济、不需任何特殊仪器检测的特点，同时保留了常规ELISA的敏感、特异的优点，又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，缩短了实验周期，完全可在宠物医院就地进行诊断检测，达到快速诊断的目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种犬癌胚抗原免疫梳、犬癌胚抗原检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
材料来源说明
纯化的癌胚抗原(CEAAg，批号L2C01001)、鼠抗癌胚抗原单克隆抗体(Anti-CEAMcAb，批号L1C00202)、鼠抗癌胚抗原单克隆抗体(Anti-CEAMcAb，批号L1C00205)、角蛋白8抗原(CK8，批号L2C02001)、甲胎蛋白(AFP，批号L2C00201)、***抗原(PSA，批号L2C001)作为检查特异性的抗原以上均来自于上海领潮生物科技有限公司。
辣根过氧化物酶酶联标记试剂盒(Lightning-Link HRP，批号701-0000)来自于上海欣奥盛生物科技有限公司。
pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)、含有0.05％吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(PBST)、硝酸纤维膜(NC)、牛血清白蛋白(BSA)、脱脂牛奶、增强型二氨基联苯胺(DAB)显色液均为北京索莱宝科技有限公司产品。
pH值9.6的包被缓冲液NBS的配制：将0.75g碳酸钠、1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml得到。
实验中所使用的HRP标记试剂盒，可以在100μl的范围内标记100μg～400μg抗体，取100μl浓度为2.3mg/ml的癌胚抗原检测抗体加入HRP标记试剂瓶中，加入10μl修饰剂，室温放置3小时以上，再加入10μl猝灭剂，放置30分钟后得到浓度为1.92mg/ml的HRP标记的检测抗体120μl。
实施例1
1、免疫梳及试剂盒的制备方法
将癌胚抗原单克隆抗体(批号L1C00202)溶解于pH值9.6的NBS缓冲液中，得到浓度100μg/ml的捕获抗体溶液点布在硝酸纤维素膜上，在37℃包被1小时后晾干，将晾干后的NC膜用含3％BSA的PBS缓冲液封闭，在4℃下封闭过夜，得到包被捕获抗体的NC膜。
将PVC板裁剪成梳齿状，可直接***96孔检测板一列8孔，齿宽3mm、齿长11mm、每齿间距6mm。将包被好的NC膜裁剪后依次固定梳齿状PVC板齿状部分，最终于自封袋中4℃保存备用。
2、免疫梳及试剂盒的检测方法：
将待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号，其中每8孔设置一阴性孔以及一浓度为5ng/ml的阳性对照孔(每孔≥100μl)。将包被CEA捕获抗体的免疫梳检测齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，37℃条件下轻轻震荡作用1h；取出免疫梳用PBST缓冲液冲洗5次；同时将稀释好的，将洗过的免疫梳依次伸入含有酶标抗体(1：400)溶液的另一排酶标反应板孔中(每孔≥200μl)，37℃孵育1h；取出免疫梳用PBST缓冲液冲洗5次后置于干净的方盒中加入DAB显色液，闭光显色1～15min，再用蒸馏水冲洗免疫梳并观察记录反应结果。
结果判读标准：以阳性样本显色时间为准，若检测样品检出颜色较阳性样本颜色深，则表示该样品中CEA浓度≥5ng/ml，检测血清样品为阳性样品。
实施例2
对包被抗体用缓冲液分别以0μg/ml(空白，仅PBS)、10μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的浓度梯度稀释CEA捕获抗体；酶标抗体用PBS溶液分别以1:1600、1:800、1:400、1:100的浓度梯度稀释HRP标记的酶标抗体。采用方阵法按照实施例1的检测方法进行测定，得到结果如图3。
图3为不同浓度包被抗体与以及不同稀释度的酶标抗体的显色结果。由图3可见，当包被抗体浓度为100μg/ml、酶标抗体稀释倍数为1:400时，颜色已达到最深，可知此时的灵敏度最高。因此，确定本实验最适包被抗体浓度为100μg/ml，酶标抗体最适稀释度为1：400。
实施例3
分别以pH值9.6的NaHCO3-Na2CO3(NBS)以及pH值7.4的PBS为包被液。按照实施例1的检测方法进行测定，观察其颜色，结果见如图4。图4为不同包被液的显色结果。由图4可见，当包被液为pH值9.6的NBS缓冲液时，显色最深，检测灵敏度最高。因此，确定最适包被液位pH值9.6的NBS缓冲液。
实施例4
以包被抗体浓度100μg/ml、酶标抗体稀释度1:400为条件，在包被抗体和酶标抗体的浓度、封闭液、底物和作用时间与实施例1相同的情况下，分别以37℃和室温包被1h后晾干作为包被条件，按照实施例1的检测方法进行测定。
结果见图5。图5为不同包被温度的显色结果。由图5可见，当包被液条件为37℃包被1小时后晾干时，显色最深，确定最适包被条件为37℃包被1小时。
实施例5
以包被抗体浓度100μg/ml、酶标抗体稀释度1:400为条件，在包被缓冲液、抗体的浓度、底物和作用时间与实施例1相同的情况下，分别以3％BSA(PBS稀释)、5％BSA(PBS稀释)、3％脱脂牛奶、5％脱脂牛奶作为封闭液。按照实施例1的检测方法进行测定，观察其颜色。
结果如图6。图6为不同封闭液的显色结果。由图6可见，当封闭液为3％BSA(PBS稀释)时，颜色已达到最深，检测灵敏度最高。因此，确定3％BSA(PBS稀释)作为最适封闭液。
实施例6
以包被抗体浓度100μg/ml、酶标抗体稀释度1:400为条件，在包被缓冲液、抗体的浓度、封闭液、底物和作用时间与实施例1相同的情况下，以37℃封闭2h后晾干、室温封闭2h后晾干、4℃过夜封闭后晾干为封闭条件，按照实施例1的检测方法进行测定，观察显示情况。
结果见图7。图7为不同封闭条件的显色结果。由图7可见，3种封闭条件的效果基本相同，但是4℃过夜封闭后晾干对实验的连贯性以及便捷性最有利，故本实验确定4℃过夜后晾干为最适封闭条件。
实施例7
以包被抗体浓度100μg/ml、酶标抗体稀释度1:400为条件，在包被缓冲液、抗体浓度、封闭液、底物和作用时间与实施例1相同的情况下，分别以37℃0.5h、37℃1h、室温0.5h、室温1h作为酶标抗体作用条件，按照实施例1的检测方法进行测定，观察显示情况。
结果见图8。图8为不同酶标抗体反应条件的显色结果。由图8可见，37℃孵育1小时的结合程度最高、显色最深，检测灵敏度最高。因此，确定37℃孵育1小时为最适酶标反应条件。
实施例8
灵敏度检测
以包被抗体浓度100μg/ml、酶标抗体稀释度1:400为条件，分别对0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1μg/ml浓度的CEA抗原。按照实施例1的检测方法进行测定，观察显示情况。
结果见图9。图9为检测灵敏度结果。由图9可见，可检出的CEA抗原最低浓度为5ng/ml，因此，本方法的最低检出量为5ng/ml。
实施例9
分别对癌胚抗原(CEA)、角蛋白8抗原(CK8)、甲胎蛋白(AFP)、***抗原(PSA)进行检测，浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，显色记为“+”，未显色记为“-”。结果见表1。
表1特异性对比结果
Figure BDA0002629039380000081
Figure BDA0002629039380000091
用CEA免疫梳分别检测不同浓度的癌胚抗原(CEA)、角蛋白8抗原(CK8)、甲胎蛋白(AFP)、***抗原(PSA)溶液，发现此免疫梳与其他蛋白没有交叉反应，只和CEA有特异性结合。
实施例10
按实施例1制备免疫梳，每隔一个月对浓度为100ng/ml的CEA抗原进行检测，连续监测6个月，观察其颜色以验证稳定性，结果见表2。经验证，CEA免疫梳在4℃下可保存3个月，检测结果没有发现改变，免疫梳在4℃下稳定性良好。
表2稳定性结果
Figure BDA0002629039380000092
实施例11
按照实施例1制备的检测试剂盒，对浓度为100ng/ml的CEA抗原重复进行十次检测。结果见表3，经验证，CEA免疫梳重复性良好。
表3重复性结果
Figure BDA0002629039380000093
实施例12
对宠物临床收集的80份犬血采用实施例1制备的试剂盒和检测方法进行检测，其中35例疑似患肿瘤性疾病，45例健康犬。同时采用化学发光检测方法检测同样来源的血清样本。
80份血清样品的检测结果见表4，以化学发光法检测结果为标准，按公式a计算免疫梳方法的相对特异性，按照公示b计算相对敏感度。
Figure BDA0002629039380000094
Figure BDA0002629039380000095
表4两种检测方法检测结果
Figure BDA0002629039380000101
以化学发光法检测结果为标准对本实验室研发的犬癌胚抗原免疫梳检测方法进行实际效果评价，得到相对特异性为100％，相对敏感度为91.30％的结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种犬癌胚抗原免疫梳，其特征在于，所述免疫梳以梳子形的PVC板为底板，每个PVC板上带有8～12个梳齿；所述梳齿的宽度为2～4mm，所述梳齿的长度为10～12mm，每两个梳齿的间距为5～7mm；
在每个梳齿的一面固定有包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜；
所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度为80～120μg/ml。
2.根据权利要求1所述免疫梳，其特征在于，所述癌胚抗原单克隆抗体的包被浓度为100μg/ml。
3.根据权利要求1或2所述免疫梳，其特征在于，所述包被着癌胚抗原单克隆抗体的硝酸纤维素膜是将癌胚抗原单克隆抗体溶解于包被液中，得到捕获抗体溶液包被在硝酸纤维素膜上，将晾干后的NC膜用封闭液封闭得到。
4.根据权利要求3所述免疫梳，其特征在于，所述包被液为pH值9.6的NBS缓冲液；
所述包被的温度为37℃；所述包被的时间为1h。
5.根据权利要求3所述免疫梳，其特征在于，所述封闭液为含质量浓度3％的BSA的PBS缓冲液；
所述封闭的温度为4℃，所述封闭的时间为12h。
6.一种犬癌胚抗原检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述犬癌胚抗原免疫梳。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括酶标抗体、显色液、洗涤液、阳性参考品和96孔板。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的工作稀释度为1:400；酶标抗体的母液浓度为1.92mg/ml。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述阳性参考品的工作浓度为5ng/ml。
10.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体中酶为辣根过氧化物酶时，所述显色液为DAB显色液。
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