CN111868257A - 用于单分子测序的双链dna模板的生成 - Google Patents

用于单分子测序的双链dna模板的生成 Download PDF

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Abstract

本发明是一种新型核酸测序方法，其涉及制备含有线性的部分单链衔接子的双链靶标核酸的文库并测序。

Description

用于单分子测序的双链DNA模板的生成
发明领域
本发明涉及核酸分析领域，且更具体地，涉及制备用于核酸测序的模板。
发明背景
包括纳米孔测序的单分子核酸测序通常利用环形模板。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。将线性核酸转化成环状形式用于扩增和随后的检测和定量，参见美国专利号RE44265。对于其中优选线性构象的长靶标分子，环状模板构型不是理想的。本发明是使用新型的衔接子设计产生线性靶标序列的文库并进行测序的方法。该方法具有以下详细描述的多个优点。
发明概述
在一个实施方案中，本发明是对双链靶标核酸的每条链分开测序的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，所述单链区域仅包含一条未配对的链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；使引物退火至每个衔接子中的所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述衔接的靶标核酸的每条链进行测序。可以通过连接来接合至所述衔接子。所述衔接子可以包含至少一个条形码。所述衔接子可以在所述双链区域中包含至少一个修饰的核苷酸。所述修饰的核苷酸可以是5'-磷酸化的末端核苷酸、硫代磷酸酯基团或可以修改所述衔接子的双链区域的解链温度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括靶标富集步骤，例如，通过经由与固相支持物结合的靶标特异性探针的捕获或通过用靶标特异性引物扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：使所述反应混合物与选自糖基化酶和内切核酸酶的DNA损伤特异性切割剂接触，由此切割损伤的DNA。在一些实施方案中，所述靶标核酸包含两个或更多个拷贝的所述靶标序列的串联体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述串联体的序列构建靶标核酸的共有序列的步骤。
在另一个实施方案中，本发明是从样品中的双链靶标核酸制备核酸文库的方法，所述方法包括：在反应混合物中，将所述双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点。
在又另一个实施方案中，本发明是测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：形成如前述段落中所述的单链环状靶标核酸的文库；使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点，延伸所述引物，由此对所述文库中的所述靶标核酸的每条链进行测序。
在又另一个实施方案中，本发明是对双链靶标核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；使测序引物退火至所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述靶标核酸进行测序。
在又另一个实施方案中，本发明是制备靶标核酸的文库的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含退火的较短的链和较长的链，其中所述单链区域仅包含一条单链且进一步包含引物结合位点。
在又另一个实施方案中，本发明是测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：形成如前述段落中所述的衔接的靶标核酸的文库；使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述文库中的每个靶标核酸进行测序。
附图简述
图1举例说明新型衔接子，也由Seq. Id. No:1 +2代表。
图2举例说明用图1中显示的衔接子对单个长靶标序列进行测序的方法。
图3举例说明使用图1或图4中显示的衔接子的短靶标序列的串联体策略。
图4举例说明具有非核苷酸接头的图1的新型衔接子。
发明详述
定义
以下定义辅助本公开内容的理解。
术语“样品”是指含有或假定含有靶标核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪水、血细胞、器官和肿瘤，并且也是指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括***固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸。样品还可以包括无细胞材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA (ctDNA)的无细胞血液级分。
术语“核酸”是指核苷酸(例如，天然的和非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物，包括DNA、RNA及其亚类，诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可具有其他键。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)以及非天然碱基。非天然碱基的一些实例包括在例如Seela等人, (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中描述的那些。非天然碱基可以具有特定功能，例如，增加核酸双链体的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链核酸。寡核苷酸是有时用于描述较短多核苷酸的术语。通过本领域已知的任意合适方法制备寡核苷酸，例如，通过涉及直接化学合成的方法，如以下文献中所述：Narang等人(1979) Meth. Enzymol. 68:90-99；Brown等人(1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage等人(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci等人(1981) J. Am. Chem. Soc.103:3185-3191。
术语“引物”是指与靶标核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交且能够在适合这种合成的条件下充当沿着核酸的互补链的合成的起始点的单链寡核苷酸。
术语“衔接子”意指可以被添加至另一个序列以便将额外的特性输入该序列的核苷酸序列。衔接子通常是这样的寡核苷酸：其可以是单链或双链的，或者可以同时具有单链部分和双链部分。
术语“连接”是指接合两条核酸链的缩合反应，其中一个分子的5'-磷酸酯基团与另一个分子的3'-羟基基团反应。连接通常是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可以接合两条单链以产生一个单链分子。连接还可以接合两条链(每条链属于一个双链分子)，因此接合两个双链分子。连接还可以将双链分子的两条链接合至另一个双链分子的两条链，因此接合两个双链分子。连接还可以接合在双链分子内的链的两个末端，因此修复双链分子中的切口。
术语“条形码”是指可以检测和标识的核酸序列。可以将条形码并入多种核酸中。条形码是足够长的，例如2、5、20个核苷酸，使得在样品中，可以将并入条形码的核酸根据所述条形码区分或分组。
术语“多重标识符”或“MID”是指标识靶标核酸的来源(例如，衍生出核酸的样品)的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶标核酸将共享相同的MID。可以将来自不同来源或样品的靶标核酸混合并同时测序。使用MID，可以将序列读取分配至靶标核酸所起源的各个样品。
术语“独特分子标识符”或“UID”是指标识与其附接的核酸的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶标核酸将具有不同的UID。源自相同原始靶标核酸的所有或基本上所有的后代(例如，扩增子)将共享相同的UID。
术语“通用引物”和“通用引发结合位点”或“通用引发位点”是指存在于(通常，通过体外添加至)不同靶标核酸的引物和引物结合位点。使用衔接子或使用具有在5'-部分中的通用引发位点的靶标特异性(非通用)引物，将通用引发位点添加至多种靶标核酸。所述通用引物可以结合通用引发位点并指导从所述通用引发位点的引物延伸。
更通常，术语“通用”是指可以添加至任何靶标核酸并独立于靶标核酸序列执行它的功能的核酸分子(例如，引物或其他寡核苷酸)。通用分子可以通过与互补物杂交(例如通用引物与通用引物结合位点杂交或通用环化寡核苷酸与通用引物序列杂交)来执行它的功能。
如本文所用，术语“靶标序列”、“靶标核酸”或“靶标”是指要检测或分析的样品中的核酸序列的一部分。术语靶标包括靶标序列的所有变体，例如，一种或多种突变型变体和野生型变体。
术语“扩增”是指制备额外拷贝的靶标核酸的过程。扩增可以具有多于一个循环，例如，多个循环的指数扩增。扩增可以仅具有一个循环(制备单个拷贝的靶标核酸)。所述拷贝可以具有额外序列，例如存在于用于扩增的引物中的那些。扩增还可以产生数拷贝的仅一条链(线性扩增)或优选一条链(不对称PCR)。
术语“测序”是指确定靶标核酸中的核苷酸的序列的任何方法。
本发明是生成适用于单分子长读取测序的双链序列模板的方法。与现有的文库制备方法、例如利用环状模板的那些(参见美国专利号7,302,146和8,153,375)相比，本发明的方法对于长扩增子是特别有利的。
本发明包括检测样品中的靶标核酸。在一些实施方案中，所述样品源自受试者或患者。在一些实施方案中，所述样品可以包含源自受试者或患者的实体组织或实体瘤的片段，例如通过活组织检查。所述样品还可以包含体液(例如，尿液、痰液、血清、血浆或淋巴液、唾液、痰液、汗液、泪液、脑脊髓液、羊水、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、囊液、胆汁、胃液、肠液和/或粪便样品)。所述样品可以包含其中可能存在肿瘤细胞的全血或血液级分。在一些实施方案中，所述样品、尤其是液体样品可以包含无细胞材料，诸如无细胞DNA或RNA，包括无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。本发明特别适合于分析稀有和少量靶标。在一些实施方案中，所述样品是无细胞样品，例如无细胞血液来源的样品，其中存在无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。在其他实施方案中，所述样品是含有或被怀疑含有传染物或源自传染物的核酸的培养样品，例如，培养物或培养上清液。在一些实施方案中，所述传染物是细菌、原生动物、病毒或支原体。
靶标核酸是可能存在于样品中的目标核酸。在一些实施方案中，所述靶标核酸是基因或基因片段。在其他实施方案中，所述靶标核酸含有遗传变体，例如，多态性，包括单核苷酸多态性或变体(SNP或SNV)，或导致例如基因融合的遗传重排。在一些实施方案中，所述靶标核酸包含生物标志物。在其他实施方案中，所述靶标核酸是特定生物体所特有的，例如，有助于鉴定病原生物体，或病原生物体所特有的，例如，药物敏感性或药物抗性。在另外的其他实施方案中，所述靶标核酸是人受试者所特有的，例如，定义受试者的独特HLA或KIR基因型的HLA或KIR序列。在另外的其他实施方案中，样品中的所有序列都是靶标核酸，例如，在鸟枪基因组测序中。
在本发明的一个实施方案中，将双链靶标核酸转化为本发明的模板构型。在一些实施方案中，所述靶标核酸在自然界中以单链形式(例如，RNA，包括mRNA、微RNA、病毒RNA；或单链病毒DNA)存在。将单链靶标核酸转化为双链形式以实现请求保护的方法的另外步骤。
可以将较长靶标核酸片段化，尽管在一些应用中，可能期望较长靶标核酸来实现较长的读取。本发明对于更长的核酸靶标特别有利。
在一些实施方案中，本发明包括靶标富集步骤。所述富集可以通过经由一种或多种靶标特异性探针捕获靶标序列来进行。样品中的核酸可以被变性并且与单链靶标特异性探针接触。所述探针可以包含亲和捕获部分的配体，使得在形成杂交复合物之后，通过提供亲和捕获部分来捕获它们。在一些实施方案中，所述亲和捕获部分是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，且所述配体是生物素。在一些实施方案中，所述部分与固体支持物结合。如下文进一步详细描述，所述固体支持物可以包含超顺磁性球形聚合物颗粒，诸如DYNABEADS™磁性珠粒或磁性玻璃颗粒。
在本发明的一些实施方案中，衔接子分子连接至所述靶标核酸。所述连接可以是平末端连接或更有效的粘性末端连接。通过包括链填充的“末端修复”，即通过DNA聚合酶延伸3'-末端以消除5'-突出端，可以使靶标核酸变成平末端的。在一些实施方案中，通过将单个核苷酸添加至衔接子的3'-末端并将单个互补核苷酸添加至靶标核酸的3'-末端，例如通过DNA聚合酶或末端转移酶，可以使平末端的核酸具有粘性。在另外的其他实施方案中，所述衔接子和所述靶标核酸可以通过用限制性内切核酸酶消化而获得粘性末端(突出端)。所述限制酶识别位点可以是固有的或被工程改造至所述序列中。在一些实施方案中，可能需要其他酶促步骤来完成连接。在一些实施方案中，可以使用多核苷酸激酶将5'-磷酸酯添加至靶标核酸分子和衔接子分子。
在一些实施方案中，使用图1中显示的衔接子。所述衔接子具有单链和双链区域，其中所述单链区域包含引物结合位点(例如，测序引物结合位点)。为了使得能够连接所述衔接子与所述双链靶标核酸，可以将衔接子的5'-末端磷酸化。为了通过聚合酶延伸与测序引物结合位点结合的测序引物来防止衔接子的较短的链的降解，所述衔接子的较短的链的3'-末端可以在较短的链的3'-末端处或附近含有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。
在一些实施方案中，所述衔接子的双链区域包含修改(例如，增加)衔接子分子的解链温度(Tm)的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸是修饰的嘧啶，诸如甲基-dC或丙炔基-dU。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸是修饰的嘌呤，例如G-钳。
在一些实施方案中，所述衔接子的单链区域中的引物结合位点包含修饰的核苷酸，其修改(例如增加)与所述引物结合位点结合的引物的解链温度(Tm)。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸是修饰的嘧啶，诸如甲基-dC或丙炔基-dU。在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸是修饰的嘌呤，例如G-钳。
图1举例说明线性衔接子的序列和结构的实例。所述衔接子包括具有5'-磷酸酯和单个3'-T突出端的短双链部分，以促进连接至靶标***物。所述衔接子包括长臂，其具有硫代磷酸酯修饰(星号)，以避免被DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性消化。长臂进一步包含用于测序引物的结合位点，以使得聚合酶能够结合靶标***物并进行测序。
图2举例说明用图1中显示的衔接子对单个长靶标序列的测序。线性衔接子在模板的两个末端连接，其中箭头显示测序进入模板的方向。将使用来自多个孔的读取获得共有序列(分子间共有序列)。
图3举例说明短靶标序列的串联体策略。在串联之前，将具有独特分子ID (UID)的衔接子连接至每个靶标序列。可以使用来自多个孔的读取并在每个读取内使用UID获得共有序列。
图4举例说明具有18-碳非核苷酸接头(HEG)的衔接子的序列和结构。
在一些实施方案中，所述衔接子分子是体外合成的人工序列。在其他实施方案中，所述衔接子分子是体外合成的天然存在的序列。在另外的其他实施方案中，所述衔接子分子是分离的天然存在的分子。
在一些实施方案中，所述方法包括在衔接子连接前扩增靶标核酸的步骤。所述扩增可以是通过指数聚合酶链式反应(PCR)、仅一条链的线性扩增或利用寡核苷酸引物的任意其他方法。在PCR Strategies(M. A. Innis, D. H. Gelfand, 和J. J. Sninsky编,1995, Academic Press, San Diego, CA)第14章; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, 和T. J.White编, Academic Press, NY, 1990)中描述了多种PCR条件。
在一些实施方案中，扩增利用引入靶标序列的通用引物结合位点。在其他实施方案中，使用基因特异性(靶标特异性)引物或引物对。将扩增的靶标核酸连接至如本文所述的衔接子。
在一些实施方案中，所述靶标核酸被串联成更长的核酸。例如，可以将短于1千碱基长(例如，100、200、300等碱基长)的较短核酸串联成几千碱基长的片段。在串联之前，将靶标核酸的末端连接至包含条形码的双链衔接子。所得的串联体是包含两个或更多个被衔接子序列打断的靶标核酸序列的分子。如果将多拷贝的相同靶标核酸串联，则可以从这种串联体的单次读取构建出共有序列。
在一些实施方案中，通过用II型限制酶在特异性限制酶识别位点处消化衔接子末端来完成串联。该酶生成粘性末端，允许用DNA连接酶将多个衔接的靶标核酸连接。在其他实施方案中，通过Gibson组装方法独立于核酸序列完成串联(Gibson等人, (2009),Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, 6(5): 343-348和美国专利号8,968,999。
在一些实施方案中，本发明包括将条形码引入靶标核酸中。对各个分子测序通常需要分子条形码，诸如在例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所述的。独特的分子条形码是通常在体外操作的最早步骤期间添加给样品(诸如患者的样品)中的每种分子的短人工序列。所述条形码标记所述分子和它的后代。所述独特分子条形码(UID)具有多种用途。条形码允许跟踪样品中的每种单个核酸分子以评估例如循环的肿瘤DNA (ctDNA)分子在患者的血液中的存在和量，以便不经活组织检查而检测和监测癌症。参见美国专利申请14/209,807和14/774,518。独特的分子条形码还可以用于测序误差校正。单个靶标分子的整个后代用相同条形码标记并形成带条形码的家族。不被带条形码的家族的所有成员共享的序列中的变异被作为伪像抛弃且不是真突变。条形码还可以用于位置去重复(positional deduplication)和靶标定量，因为整个家族代表原始样品中的单一分子。参见同上。
在一些实施方案中，衔接子包含一个或多个条形码。在其他实施方案中，扩增引物(例如，用于在衔接子连接之前的扩增中的引物)在所述引物的5'-部分中包含条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于鉴定样品的来源的多重样品ID (MID)。条形码也可以充当用于标识每种原始分子和它的后代的独特分子ID (UID)。条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施方案中，将单个条形码用作UID和MID二者。
在一些实施方案中，每个条形码包含预定义的序列。在其他实施方案中，所述条形码包含随机序列。条形码可以是1-20个核苷酸长。
在一些实施方案中，本发明是制备如本文所述的准备测序的衔接的双链靶标核酸的文库的方法和通过该方法产生的文库。具体地，所述文库包含衍生自样品中存在的核酸的衔接的双链分子的集合。所述文库的分子包含与衔接子序列接合的靶标序列。
在一些实施方案中，本发明包括通过核酸测序来检测样品中的靶标核酸。可以将多种核酸(包括样品中的所有核酸)转化成本发明的模板构型并测序。在一些实施方案中，可以对单链环状分子的文库进行核酸测序。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括消除受损或降解的靶标以提高测序读取的质量和长度的步骤。该步骤可以包括使反应混合物与尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG或UDG)或AP核酸酶接触，以便降解此类受损的靶标核酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从文库消除受损或降解的靶标以提高测序读取的质量和长度的步骤。该步骤可以包括使文库与尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG或UDG)、AP核酸酶和Fpg(甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶)(也称为8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶)中的一种或多种接触，以降解此类受损的靶标核酸。
如上所述，所述衔接子或所述靶标特异性引物可以包含测序引物结合位点，其可以起始每条链的测序读取。
可以通过本领域已知的任意方法执行测序。特别有利的是能够读取环状靶标核酸的高通量单分子测序。此类技术的实例包括利用SMRT的Pacific BioSciences平台(Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.)或利用纳米孔技术的平台(诸如由OxfordNanopore Technologies (Oxford, UK)或Roche Sequencing Solutions (Genia) (SantaClara, Cal.)制造的那些)和任意其他目前存在的或将来的涉及或不涉及边合成边测序(sequencing by synthesis)的DNA测序技术。测序步骤可以利用平台特异性的测序引物。可以将这些引物的结合位点引入如本文中所述的本发明的方法中，即，通过成为第二衔接子或扩增引物的一部分。
分析和错误校正
在一些实施方案中，所述测序步骤涉及序列分析，其包括序列比对的步骤。在一些实施方案中，使用比对来确定来自多个序列(例如，具有相同条形码(UID)的多个序列)的共有序列。在一些实施方案中，使用条形码(UID)来确定来自都具有相同条形码(UID)的多个序列的共有序列。在其他实施方案中，使用条形码(UID)来消除伪像，即，存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。可以消除这样的源自PCR误差或测序误差的伪像。
在一些实施方案中，通过定量样品中具有每种条形码(UID)的序列的相对数目，可以定量样品中的每种序列的数目。每个UID代表在原始样品中的单个分子，且计数与每种序列变体相关的不同UID可以确定在原始样品中的每种序列的分数。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读取的数目。在一些实施方案中，有关数目是准确定量结果所必需的读取/UID (“序列深度”)。在一些实施方案中，期望的深度是5-50个读取/UID。
在一些实施方案中，本发明包括基于靶标核酸的多次读取构建共有序列的步骤。在一些实施方案中，将每个拷贝的靶标核酸连接至衔接子并测序一次。通过比较各自已经读取一次的几个拷贝的靶标核酸的读取在分子间组装共有序列。例如，以这种方式对约1kb长或更长的核酸进行测序。在一些实施方案中，将几个拷贝的靶标核酸连接在一起(串联)。然后将串联物连接质衔接子并测序一次。通过比较来自串联物中的几个拷贝的靶标核酸的读取，在分子内组装共有序列。例如，以这种方式对小于1 kb长的核酸进行测序。
实施例
实施例1. 模板制备
测序模板是线性化的pUC19质粒DNA (2.7 kb)或500bp和1.15kb HIV扩增子。使用Qubit荧光分析(ThermoFisher Scientific)定量输入的DNA。使用具有DNA 12000试剂盒的生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, Cal.)来评价DNA大小、质量和数量。根据制造商的说明，使用KAPA PureBeads (KAPA Biosystems, Inc., Wilmington,Mass.)纯化进行清洁。
实施例2. 在Pacific Biosciences RSII平台上的文库制备和测序
使用KAPA HyperPrep试剂盒文库制剂，制备模板DNA(1 ug质粒或扩增子)用于衔接子连接。简而言之，根据制造商的说明，对纯化的线性化的质粒DNA进行末端修复并进行A-加尾。该步骤之后，立即使用线性衔接子或HEG衔接子进行衔接子连接(图1或图4)。在同一管中，添加连接主混合物和衔接子，并将反应混合物在20℃下孵育30分钟。通过在65℃下进一步孵育10 min来将连接酶失活。所有衔接子均以1:200的模板:衔接子连接比率存在。连接后进行最后的0.8x KAPA Purebeads珠子清洁步骤。使用Qubit荧光分析(LifeTechnologies)定量文库产量，并使用Bioanalyzer HS试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara, CA)检查文库的大小。根据制造商的说明在Pacific Biosciences RSII平台上和在Roche纳米孔平台上对纯化的衔接的模板进行测序。RSII结果显示于表1中，其具有不同大小的扩增子，并且表2显示在Roche纳米孔平台上的结果。
表 1：RSII结果
模板 <i>聚合酶读取长度(碱基数)</i> <i>目标读取长度(碱基数)</i> <i>#高质量读取</i>
具有线性衔接子的500bp扩增子–重复1 <i>574</i> <i>574</i> <i>8440</i>
具有线性衔接子的500bp扩增子–重复2 <i>615</i> <i>615</i> <i>8821</i>
具有线性衔接子的1.15kb扩增子–重复1 <i>1268</i> <i>1268</i> <i>31800</i>
具有线性衔接子的1.15kb扩增子–重复2 <i>1292</i> <i>1293</i> <i>33858</i>
具有线性衔接子的2.7kb扩增子–重复1 <i>2339</i> <i>2336</i> <i>12244</i>
具有线性衔接子的2.7kb扩增子–重复2 <i>2409</i> <i>2406</i> <i>11927</i>
表 2：纳米孔结果
模板(测序运行次数#) 来自单孔的高质量区域的比对读取% 中值行进长度(bp)
对照(n=4) 44.88 ± 0.43 1664 ±78
对照(n=3) 29.39 ± 1.26 1769 ± 40
对照(n=3) 45.24 ± 2.96 1525 ± 79
对照(n=4) 23.63 ± 3.66 1765 ± 129
线性衔接子(n=2) 33.15 ± 0.33 2423 ± 13
线性衔接子(n=4) 34.46 ± 2.03 2043 ± 67
线性衔接子(n=8) 30.53 ± 2.18 2162 ± 147
线性衔接子(n=6) 30.66 ± 1.77 1856 ± 178
线性衔接子(n=5) 31.71 ± 0.32 2352 ± 86
实施例3. 使用新型衔接子对串联的线性模板进行测序。
在该实施例中，起始靶标序列是187 bp长的NRAS外显子3扩增子，并将该扩增子串联，连接至新型衔接子(图1)并进行测序。该实验的对照是pUC2.7 kb质粒，并与SMRTBellTM衔接子连接以生成环状文库。为了进一步测试串联的稳健性，我们串联了不同大小的肿瘤学扩增子。串联11个额外的肿瘤学扩增子(大小不同)，连接至新型衔接子，并在纳米孔平台上测序。11个扩增子是NRAS外显子3、NRAS外显子4.1、NRAS外显子4.2、KRAS外显子2、KRAS外显子3、KRAS外显子4、BRAF外显子11、PIK3CA外显子9、EGFR外显子18、EGFR外显子20、EGFR外显子21。模板在RSII和Roche纳米孔平台上测序。来自RSII仪器的结果显示于表3中，并且来自Roche纳米孔平台的结果显示于表4中。
测序串联的模板
表 3：RSII结果
模板 <i>聚合酶读取长度(碱基数)</i> <i>目标读取长度(碱基数)</i> <i>#高质量读取</i>
一个扩增子串联体(NRAS；180bp)- 线性衔接子 <i>2047</i> <i>2048</i> <i>49780</i>
一个扩增子串联体(NRAS；180bp)- 线性衔接子 <i>2013</i> <i>2013</i> <i>47670</i>
11扩增子串联体 –SMRTBell衔接子(对照)–重复1 <i>18015</i> <i>993</i> <i>98261</i>
11扩增子串联体 –SMRTBell衔接子(对照)–重复2 <i>17397</i> <i>1029</i> <i>92616</i>
11扩增子串联体 –线性衔接子–重复1 <i>1431</i> <i>1432</i> <i>36201</i>
11扩增子串联体 –线性衔接子–重复2 <i>1109</i> <i>1109</i> <i>23293</i>
表 4：纳米孔结果
模板(测序运行次数#) 形成的单孔 具有文库(DNA)的所有单孔 #高质量单次读取
对照{具有SMRTBell<sup>TM</sup>衔接子的质粒pUC2.7kb DNA，即环状文库(n=4)} 6233 1726 1152
对照{具有SMRTBell<sup>TM</sup>衔接子的质粒pUC2.7kb DNA，即环状文库(n=3)} 7979 2447 1582
一个扩增子串联体 –线性衔接子(运行#1) 5886 1175 816
一个扩增子串联体 –线性衔接子(运行#2) 7500 1606 909
一个扩增子串联体 –线性衔接子(运行#3) 6207 1927 1215
11扩增子串联体 –线性衔接子(运行#1) 6369 1476 1045
11扩增子串联体 –线性衔接子(运行#2) 7086 1108 754
11扩增子串联体 –线性衔接子(运行#3) 4777 1835 1378
实施例4. 构建HEG衔接子文库并进行测序
在该实施例中，使用线性化的质粒pUC19 (2.7 kb)。使用六乙二醇(HEG) 18-碳接头的新型哑铃形衔接子(图4)用于制备文库。SMRTBell衔接子用作对照。在文库制备期间使用50uM的线性或HEG衔接子。将HEG/线性衔接子连接的文库与生物素化的测序引物孵育，以便在45℃下退火30秒，并且以0.1℃/s的斜变速率冷却至20℃。这随后是(聚合酶-和-孔)复合物结合。通过使用链霉抗生物素蛋白偶联的珠粒结合生物素化的引物-复合物并富集准备测序的复合物来实现富集。在Roche纳米孔平台上进行测序。结果显示于表5中。
表5. 在纳米孔***上对HEG衔接子文库进行测序
模板(测序运行次数#) 来自单孔的高质量区域的比对读取% 中值行进长度(bp)
HEG衔接子文库#1 42.04% 2555
HEG衔接子文库#2 33.61% 2264
HEG衔接子文库#3 42.34% 2476
HEG衔接子文库#4 40.78% 2478
HEG衔接子文库#5 43.07% 2413
HEG衔接子文库#6 41.66% 2367
平均值– HEG衔接子(n=6) 40.58% 2425.5
哑铃衔接子文库#1 27.28% 2219
哑铃衔接子文库#2 21.77% 2508
哑铃衔接子文库#3 16.65% 2167
哑铃衔接子文库#4 29.07% 2494
哑铃衔接子文库#5 27.35% 2569
平均值– 哑铃衔接子(n=5) 24.43% 2391.40
序列表
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Roche Diagnostics GmbH
Roche Sequencing Solutions, Inc.
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工的单链
<400> 1
atctctctct actgactgtc ctcctcctcc gttttt 36
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工的单链
<400> 2
gagagagatt 10

Claims (15)

1.对双链靶标核酸的每条链分开测序的方法，其包括以下步骤：
a) 在反应混合物中，将双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，所述单链区域仅包含一条未配对的链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；
b) 使引物退火至每个衔接子中的所述引物结合位点；
c) 延伸所述引物，由此对所述衔接的靶标核酸的每条链进行测序。
2.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含至少一个条形码。
3.权利要求1的方法，其中所述衔接子在所述双链区域中包含至少一个修饰的核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸是5'-磷酸化的末端核苷酸。
5.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸修改所述衔接子的双链区域的解链温度。
6.权利要求1的方法，其进一步包括靶标富集步骤。
7.权利要求6的方法，其中所述富集是通过用靶标特异性引物扩增。
8.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤b)之前，使所述反应混合物与选自糖基化酶和内切核酸酶的DNA损伤特异性切割剂接触，由此切割损伤的DNA。
9.权利要求1的方法，其中所述靶标核酸包含两个或更多个拷贝的所述靶标序列的串联体。
10.权利要求9的方法，其进一步包括从所述串联体的序列构建靶标核酸的共有序列的步骤。
11.从样品中的双链靶标核酸制备核酸文库的方法，所述方法包括：在反应混合物中，将所述双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点。
12.测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 通过权利要求11的方法形成单链环状靶标核酸的文库；
b) 使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；
c) 延伸所述引物，由此对所述文库中的所述靶标核酸的每条链进行测序。
13.对双链靶标核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：
a) 在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；
b) 将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；
c) 使测序引物退火至所述引物结合位点；
d) 延伸所述引物，由此对所述靶标核酸进行测序。
14.制备靶标核酸的文库的方法，其包括以下步骤：
a) 在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；
b) 将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含退火的较短的链和较长的链，其中所述单链区域仅包含一条单链且进一步包含引物结合位点。
15.测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 通过权利要求14的方法形成衔接的靶标核酸的文库；
b) 使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；
c) 延伸所述引物，由此对所述文库中的每个靶标核酸进行测序。
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