CN111849924B - 类nadc30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用 - Google Patents

类nadc30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了类NADC30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用。本发明的一种类NADC30猪蓝耳病强毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19691。通过对该SD株进行致弱培养，本发明还获得了一株类NADC30猪蓝耳病弱毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD‑R株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19692。实验证明，本发明的SD株具有毒力强、对仔猪致病力稳定的特征，可用于检验预防或治疗类NADC30猪繁殖与呼吸综合征；本发明的弱毒疫苗株SD‑R株具有安全性高、保护效果好的特征，可用于预防类NADC30猪繁殖与呼吸综合征。因此，本发明的SD株及其弱毒疫苗SD‑R株可用于制备成防治类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的单苗或联苗(活或灭活疫苗)等，也可以制备成诊断类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的诊断试剂。

Description

类NADC30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用
技术领域
本发明涉及类NADC30猪蓝耳病强毒株、弱毒株，还涉及该弱毒株在预防类NADC30猪繁殖与呼吸综合征中的应用，本发明属于生物医药领域。
背景技术
猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪流产和仔猪呼吸道症状为主要特征的急性传染病。1996年，我国首次报道PRRSV，后来被划分为我国的经典毒株，随后经典猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒在我国广泛应用，很好的控制了我国PRRSV的流行。2006年，我国南方地区暴发了猪的“高热病”，很快传遍全国各地，后经证实为高致病性猪繁殖与呼吸综合征，该类毒株很快成为了我国的主要流行毒株，经典疫苗无法对其提供完全保护，随后我国研制并应用了高致病性弱毒活疫苗，如JXA1-R、HuN4-F112、TJM和GDr180等。该类疫苗的广泛应用很快控制了高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行。目前经典猪繁殖与呼吸综合征疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗在我国普遍应用，对我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的防控发挥了至关重要的作用。
2012年，部分疫苗免疫的猪场出现大面积母猪流产和仔猪体重增长缓慢的现象。后经证实，该现象由猪繁殖与呼吸综合征变异株引起，这类毒株由于与NADC30毒株同源性较高，故被划分为类NADC30 PRRSV分支。2016年，类NADC30 PRRSV已经成为我国的主要流行毒株，直至今日，疫病形势非常严峻，生猪饲养是我国广大农民赖以增收的主要产业，如何防控该病已经成为当前急需解决的问题。
类NADC30猪繁殖与呼吸综合征有以下特点：流产率高，高达10％～50％。仔猪厌食、嗜睡、被毛粗乱。生长缓慢，耐过猪多数成为僵猪。该类毒株感染的猪只多数存在细菌和病毒的继发感染。其中，感染猪、康复猪及其污染物是本病的主要传染源。不同日龄、不同品种的猪均可发生。本病主要通过呼吸道或通过公猪的***经生殖道在同一猪群间进行水平传播，也可以进行母子间的垂直传播。病毒可通过鼻、眼分泌物、胎儿及子宫甚至公猪的***排出，感染健康猪只。
剖检病理变化：病猪的***一般均有肿大、出血，其中以腹股沟***、颌下***出血严重，有的腹股沟***只是肿大，无出血现象；肺有不同程度的实变或水肿。
类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株。通过对全国各地分离的PRRSV变异株进行完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现，来自不同猪场的PRRSV均属于同一分支，而且在Nsp2基因上均存在131个氨基酸的不连续缺失，它们位于Nsp2基因的第322-432位(111个氨基酸)、483(1个氨基酸)和504-522(19个氨基酸)位。
同其它病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于PRRS的治疗，免疫接种是防治该病的最有效方法。目前商品化的PRRS疫苗主要是由经典株和高致病性毒株制备的弱毒苗和由经典株制备的灭活苗。多项研究报道，我国的类NADC30 PRRSV多为中等致病力，部分为高致病力。经由当前商品化疫苗免疫后，在类NADC30 PRRSV的攻击下多数猪只发病、增重缓慢。由此可见，虽然目前的PRRS疫苗种类繁多，但没有任何一种疫苗可对猪体产生足够的保护作用。面对依然十分严峻的疫情，开发新型高效的PRRS疫苗已是迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的类NADC30猪蓝耳病强毒株；
本发明的目的之二是提供一种新的类NADC30猪蓝耳病弱毒株以及由该疫苗株制备得到的疫苗组合物。
本发明的上述目的分别通过以下技术方案实现：
本发明的一种类NADC30猪蓝耳病强毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD株，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19691，保藏时间为2020年4月13日。
其中，优选的，所述的强毒株具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步的，本发明还提出了一种在体外连续传代致弱的、可用于防治类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的类NADC30猪蓝耳病弱毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD-R株，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19692，保藏时间为2020年4月13日。
其中，优选的，所述的弱毒株具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
更进一步的，本发明还提出了所述的类NADC30猪蓝耳病强毒株、权利要求3或4所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株在制备诊断、预防或治疗类NADC30猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途。
其中，优选的，所述的药物为疫苗。
更进一步的，本发明还提出了一种预防类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其由所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株和药学上可接受的佐剂组成。
其中，优选的，所述的疫苗组合物通过以下方法制备得到：
选用生长良好的Marc-145细胞，倒掉培养液后，换以含1％v/v所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株种子液的新鲜培养液，置于37℃继续培养，每日观察；培养2～3天后，有75-85％的细胞出现病变，并于对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存；将收获的病毒取样进行无菌检验，应无细菌生长，效价均应≥106.5TCID50/ml；将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂充分摇匀后分装，边分装边摇动，每只疫苗瓶分装量为2ml，迅速进行冷冻真空干燥，即得。
其中，优选的，所述的蔗糖明胶保护剂通过以下方法制备得到：蔗糖280g，明胶49g加去离子水700ml加热溶解后，分装，110～116℃灭菌30～60分钟，即得。
其中，优选的，将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂按照体积比7:1混合，病毒液保持在10～20℃，蔗糖明胶保护剂保持在40-50℃。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种类NADC30猪蓝耳病强毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD株，还提供了一种通过将所述SD株在体外连续传代致弱的、可用于防治类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的类NADC30猪蓝耳病弱毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD-R株。该弱毒株具有安全性高、保护效果好的特征，可用于预防类NADC30猪繁殖与呼吸综合征。本发明的SD株及其弱毒疫苗SD-R株可用于制备成防治类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的单苗或联苗(活或灭活疫苗)等，也可以制备成诊断类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的诊断试剂。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1类NADC30猪蓝耳病强毒株SD株的分离与鉴定
从我国山东省出现“大面积流产和仔猪消瘦”猪场的病猪中采集脏器。将采集的病料研磨，离心、过滤取滤液冻存待用，Marc-145细胞在37℃下培养48～72h形成单层后，每瓶接种1ml滤过的病料悬液上清，吸附2～4h后，换含有2％胎牛血清的DMEM培养液继续在37℃下培养，观察4～5天有无细胞病变(CPE)产生。当60～70％细胞出现CPE变化时收毒，将有病变的毒株传2～3代后用PRRSV的Nsp2和ORF5引物进行PCR扩增；用PRRSV HuN4-F112株的N、M特异单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定。试验证明，该分离毒株为PRRS病毒，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD株(也称类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒SD株，PRRSV SD)，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒。PRRSV的M和N蛋白特异性单克隆抗体与PRRSV SD株呈阳性反应，而与HCV、PRV、PPV、TGEV、PEDV和HEV无交叉反应。采用RT-PCR技术对本发明分离的PRRSV SD株的Nsp2和ORF5基因进行扩增，分别扩增出2个目的基因片段，在此基础上对分离到的PRRSV SD株做了Nsp2和ORF5基因的序列分析，证明PRRSV SD株属于类NADC30 PRRSV分支，与已分离鉴定的JL580和CHsx1401属于同一分支。通过对SD株毒力的测定发现，该病毒株对仔猪具有中等致病力。
对PRRSV SD株进行全序列测定，其序列如SEQ ID NO.1所示。将该病毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19691，保藏时间为2020年4月13日。
实施例2类NADC30猪蓝耳病弱毒株SD-R株的培育
1.材料方法
1.1病毒细胞培养及克隆化
进行病毒培育的Marc-145细胞用DMEM细胞培养液培养，其中含10％胎牛血清和1％青/链霉素。用此细胞培养液复苏Marc-145细胞或使之传代至容量为100ml的无菌的细胞培养瓶里，待长成良好细胞单层后用于病毒接种。
1.2种毒的克隆化
将本发明实施例1分离的类NADC30猪蓝耳病病毒SD株在Marc-145细胞上传代，分别在传至10、15、20代时进行病毒噬斑克隆，并选取直径1mm的噬斑继续传代培养。
1.3种毒的毒价测定
选取不同代次的种毒按Reed-Muench方法测定TCID50。
2.试验结果
2.1传代病毒的克隆纯化
在致弱毒种的过程中进行了3次克隆纯化，每次克隆均选择1mm噬斑。类NADC30猪蓝耳病病毒SD株低代次病毒噬斑大小不一，而高代次病毒噬斑大小均一。高、低代次病毒的病变形态也不同：低代次点状、聚丛，高代次均匀、整体病变。对传代过程中不同代次病毒的培养特性、纯净性和生物学特性进行了检测，结果表明各代次病毒无外源病毒、细菌和霉菌污染，且能被类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性的阳性血清中和。
2.2种毒的培育及其滴度测定
当PRRSV SD株在Marc-145细胞系传代时，其病毒滴度在低代次时病变速度较快，48小时即可收毒，毒价在105.0-6.0TCID50/ml左右，然后病毒毒价下降、病变速度变慢，30代以后病变速度加快，毒价也升高，60代以后病变速度和毒价保持稳定，毒价达到106.5- 7.5TCID50/ml。
根据以上结果并结合不同代次病毒的序列分析结果，我们选择类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSVSD株第125代细胞毒作为类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的基础种子代次，并以此为基础研究其安全性和免疫原性。
PRRSV SD株第125代细胞毒，病毒滴度107.5TCID50/ml，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD-R株(也称类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒SD-R株，PRRSV SD-R)，分类命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒。将该弱毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19692，保藏时间为2020年4月13日。
实施例3类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗的制备
选用生长良好的Marc-145细胞，倒掉培养液后，换以含1％v/v病毒种子液(实施例2得到的弱毒株PRRSV SD-R)的新鲜培养液(DMEM培养液)，置于37℃继续培养。每日观察。发现生长异常、污染的细胞应废弃。培养2～3天后，约有80％的细胞出现病变，并于对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存。将收获的病毒取样进行无菌检验，应无细菌生长。效价均应≥106.5TCID50/ml。将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂(蔗糖280g，明胶49g加去离子水700ml加热溶解后，分装，110～116℃灭菌30～60分钟)按照7:1混合(病毒液保持在10～20℃，保护剂40-50℃)，充分摇匀后分装，边分装边摇动，每只疫苗瓶分装量为2ml，迅速进行冷冻真空干燥，得本发明疫苗。
本发明疫苗的使用方法：
接种途径：颈部肌肉注射。
接种剂量：哺乳仔猪0.5头份，断奶仔猪及架子猪1头份。
实施例4类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)与高致病性商品化疫苗HuN4-F112保护效力比较
1材料和方法：
1.1类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)，SD-R株为SD株第125代细胞毒，病毒滴度107.5TCID50/ml。商品化疫苗HuN4-F112，病毒滴度107.5TCID50/ml。SD的病毒滴度为104.23TCID50/ml。
1.2动物试验：17头28日龄PRRS抗原和抗体均为阴性，PRV、PCV2和CSFV阴性的健康仔猪，随机分成4组(A、B、C和D),A-C组各5头，D组2头。空白对照D组单独饲养。A-B组，分别接种类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)和商品化疫苗HuN4-F112，接种剂量均为2ml(1×105.0TCID50/ml)，接种途径为肌肉注射。免疫后每周采血、采口腔拭子、称重。免疫后21天，A-C组所有试验猪每头攻击SD F5强毒4ml(1×104.0TCID50/ml，2ml滴鼻，2ml肌肉注射)，攻毒后每天测温，0、3、5、7、10、14天采血和口腔拭子，分离病毒和检测抗体，每周称重。
2结果
2.1临床症状：免疫后，免疫组A-B和对照组C-D各仔猪均正常，无发烧、厌食等临床症状，攻毒后，A组和D组各仔猪均正常，无发烧、厌食等临床症状，病理剖检结果全部保护。B组多数仔猪体温升高，部分猪只在40.5℃以上，厌食、体重增长缓慢，试验结束时部分仔猪病理剖检符合临床发病标准。C组所有仔猪体温升高(>40.5℃)，持续9-12天，厌食、消瘦，部分仔猪体重表现为负增长，试验结束时病理剖检符合临床发病标准。
2.2抗体变化：免疫后14天，A-B组仔猪ELISA抗体全部阳转。攻毒后7天，C组仔猪ELISA抗体部分阳转，10天后全部阳转。D组仔猪ELISA抗体一直为阴性。
2.3病毒分离及载量：免疫后21天，A-B组各有4头可以检测到疫苗毒，C-D组均为阴性。攻毒后14天，A-B组全部产生中和抗体，均检测不到疫苗毒，A组有4头检测到攻击的强毒，B组所有仔猪均检测到攻击的强毒，A-B组所有仔猪的病毒载量均低于C组。D组均为阴性。
类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗HuN4-F112免疫保护效力比较如表1所示。
表1类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗HuN4-F112免疫保护效力比较
Figure GDA0002650175230000071
试验结果表明，商品化疫苗HuN4-F112对类NADC30 PRRSV提供部分临床保护，类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)对类NADC30 PRRSV提供完全临床保护。
实施例5类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)对异源毒株的交叉保护效果
1材料和方法：
1.1类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)，SD-R株为SD株第125代细胞毒，病毒滴度107.5TCID50/ml。WK108株的病毒滴度为104.0TCID50/ml。SD-R与WK108的全基因组同源性差异为10.3％。
1.2动物试验：12头28日龄PRRS抗原和抗体均为阴性，PRV、PCV2和CSFV阴性的健康仔猪，随机分成3组(A、B和C),A-B组各5头，C组2头。空白对照C组单独饲养。A组接种类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R)，接种剂量为2ml(1×105.0TCID50/ml)，接种途径为肌肉注射。免疫后每周采血、采口腔拭子、称重。免疫后21天，A-B组所有试验猪每头攻击WK108 F5强毒4ml(1×104.0TCID50/ml，2ml滴鼻，2ml肌肉注射)，攻毒后每天测温，0、3、5、7、10、14天采血和口腔拭子，分离病毒和检测抗体，每周称重。
2结果
2.1临床症状：免疫后，免疫组A和对照组B-C各仔猪均正常，无发烧、厌食等临床症状，攻毒后，A组和C组各仔猪均正常，无发烧、厌食等临床症状，病理剖检结果全部保护。B组所有仔猪体温升高(>40.5℃)，持续5-9天，厌食、体重增长缓慢，试验结束时部分仔猪病理剖检符合临床发病标准。
2.2抗体变化：免疫后14天，A组仔猪ELISA抗体全部阳转。攻毒后5天，B组仔猪ELISA抗体部分阳转，7天后全部阳转。C组仔猪ELISA抗体一直为阴性。
2.3病毒分离及载量：免疫后21天，A组有4头可以检测到疫苗毒，B-C组均为阴性。攻毒后14天，A组全部产生中和抗体，均检测不到疫苗毒，A组有4头检测到攻击的强毒，B组所有仔猪均检测到攻击的强毒，A组所有仔猪的病毒载量均低于B组。C组均为阴性。
试验结果表明，类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)对异源类NADC30PRRSV WK108株提供完全临床保护。
实施例6类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)对仔猪的安全性试验
1.材料与方法
1.1试验用疫苗：类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)，SD-R株为SD株第125代细胞毒，病毒滴度107.5TCID50/ml。
1.2实验动物：选取14头28日龄左右PRRS抗原和抗体均为阴性的健康仔猪。PRRS病毒检测方式为RT-PCR，分别使用针对Nsp2和ORF5基因的2对引物进行检测。抗体检测采用IDEXX公司生产的PRRSV ELISA试剂盒。14头仔猪随机分成3组，第一组6头为安全性试验组，第二组4头为空白对照。空白对照组与安全性试验组分圈饲养，自由采食。第三组4头不接种，与安全试验组饲养于同一圈中，作为同居感染组。
1.3动物试验：安全性试验组免疫剂量为2×107.0TCID50/头，接种方式为颈部肌肉注射。临床监测方式与指标：接种疫苗后观察疫苗注射部位有无红肿、溃烂等炎症反应，并每日观察猪只的临床表现，如采食量、精神状态、生长状况、耳部眼睑以及体表有无异常。于每日清晨饲喂后进行一次直肠测温，直至剖杀。
1.4组织病理变化：于接种后第7、14和21天各剖杀疫苗组2头和对照组1头，取剖杀动物的心、肝、肺、肾、脑、胃、肠、脾、扁桃体、腹股沟***、颌下***、肠系膜***做病理组织学检查。
2.结果
2.1试验猪的临床表现
试验猪接种类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)后采食量以及精神状态正常，与空白对照组无明显差别。接种部位无炎症反应。耳部及体表无淤血或溃疡斑、眼睑无肿胀，眼分泌物无明显增多。空白对照组无临床症状、无体温升高。
2.2组织病理变化
试验猪分别于接种后第7、14、21天各剖杀2头，解剖学检查结果显示高剂量类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)接种后仔猪的各实质脏器与***均没有肉眼可见的病变。
进一步的组织病理学检查显示各种实质脏器(心、肝、脾、肺、肾、小肠、大脑、胃)均没有明显的病理损伤，对淋巴***(腹股沟***、颌下***以及肠系膜***)也没有发现明显的病理损伤，仅在腹股沟***有少量的嗜酸性粒细胞浸润，而肠系膜、颌下***无病理损伤。
2.4同居感染组病毒含量与抗体的检测
4头健康仔猪与肌注类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)2×107.0TCID50组混养，采集0、3、5、7、10、14、21天的血清，经Real-Time PCR方法检测血清中的病毒，结果未发现有病毒。同时利用IDEXX ELISA试剂盒也未检测到抗体。
另外，我们在其它试验中，累计以105.0TCID50接种7日龄仔猪10头，断奶仔猪75头，所有被接种动物在一个月内的观察期内无体温升高、无咳嗽和厌食等临床症状，接种部位无炎症反应，以上结果表明类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)对各年龄段的猪都是安全的。
试验结果表明，高剂量接种类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)后对仔猪的各种脏器均没有明显的损伤；同居感染结果显示类NADC30猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(SD-R株)水平传播能力极低。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 类NADC30猪蓝耳病强毒株、弱毒株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15015
<212> DNA
<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
<400> 1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg acatttgtat tgtcaggagc tgtgactact 60
tgcacagccc aaaacttgcc gctcagaaac acccttctgt gacggcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtt tgtccctgac accttgtttc tggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga ttcttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
tgtggcagag ggccaagtct attgcacacg atgtctcagt gcacggtccc tccttccctt 300
gaatctccaa gtttctgacc ttggagtgct gggcttgttc tacaggcccg aagagccact 360
ccagtggacg ttgccacgcg cattccccac tgtcgagtgt tcccctgctg gggcttgctg 420
gctttcagca atttttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacttgaact tccagcaaag 480
gatgacacgg gttgcagccg agatctatag agccggccga ctcacccctg cagtcctgaa 540
gaacctacaa gtttacgaac ggggctgccg ttggtacccc atagtagggc ctgttccagg 600
agtggccgtt tttgcaaact ccttacatgt gagcgacaaa catttcccgg gagcaactca 660
cgtgctgacc aacctaccac tcccgcagag acccaaacct gaagactttt gcccctttga 720
gtgtgctatg gctgccgtct atgacattgg tcatgacagc gtcatgtacg tggccgagga 780
aagggtctct tggtctccgc gtggtgggga aaaaggaaag tttgaaactg tccccgagga 840
gttgaagttg gttgcagagc gactttatac ctccttcccg ccccaccacg cggttgacat 900
gtcgaaattt accttcacag cctctgagtg tggcgcttcc atgcgggtcg aacgccagta 960
tggctgcctt ccggctggca ctgcccctga cggcaactgc tggtggagct tgttcagttc 1020
gctcccattt gaagtccagc ataaagaaat tcgccacgcc attcaatttg gttatcaaac 1080
caagcatggt gttgccggca agtacctaca gcggagactg caaattcacg gtctccgagc 1140
agtagttgac ccaactggac ctatcgttgt gcagtatttt gctgttaagg ggagctggat 1200
tcgccacatc aagttggagg gagaacacaa ctatcctggg tttgaggacc tcctcagaat 1260
aaggattgaa cccaacacgt caccattggc ctgtaaggat gagaaaatct tccgttttgg 1320
cgcccacaag tggtatggcg ctgggaagag agcaagaaga gcacgtgcag gtgcgaccac 1380
cgcagtcgcc ggtcgtgcct cgtccgctcg tgaaactcgg cagactgagg cacacaaggg 1440
tgttagtgcc ggcaaggatg aacccctcaa gtgctactcc ccacccgccg agggcaattg 1500
tggttggcac tgcctctctg caatcgcaaa ccggatggta cattctaaat tcgaaaccac 1560
ccttcccgaa agagtgaggt ctccagatga ctgggcgact gatgaagatc ttgctaacgc 1620
tatccaaacc ctcaggctcc ctgcggcctt ggacaggaat ggtgcttgtg caggcgccaa 1680
gtacgttctc aagctggaag gcgagcattg gactgtctca gttacccctg ggatgtctcc 1740
ctctttgctt cctcttgaat gtgttcaggg ttgctgtgag cacaagggtg gctctagctc 1800
cccaagcgcg gttgaaattt ctgggtttga ccctgcctgc cttgattggt tggccaaagt 1860
gatgcacctg cctagcagtg ttatcccggc cgccctggcc gagatgtccg gtaacatcgg 1920
tcgtttgacc cctccggttt ctggtgtgtg gactgtttca caactcttcg ctcgtcacag 1980
cggaggggag cactctgatc aagtgtactt ggagaaaatt gtcagccttt gtcaactgct 2040
tgagagttgc tgctgttctc agaacaaggc caacccggtc accccggagg aggtgaggga 2100
aaaaattaac cagtacctcc gcggtgcggt aaatcttgaa gaatgcttgg ctaggcttga 2160
gaaagctcgc ccgcctagcg tgttggacac ctcctttgat tgggatgttg tgtttcctgg 2220
agttggagtg gctgctcaag cagcggaact gcccctcatc aaccagtgtc acgctccagt 2280
cactgtcgtg gctcgaaggt cttcgccgga actccagtct cgaaaagcgg agtctgtcaa 2340
gagcctccca gagaacaggc ccctccctgc cccacgcagg aagatcaggt ccatgtgtgg 2400
tagtttggtt tcatcaggtg acaacttccc tgacagccgg gaagactcgg ccggtgcccc 2460
ctttcatccc ccagtcccgt ctaagtcagt ggcacgttcg aatgaacctg tgcctgtccc 2520
cgcaccgcgc aggactgtgc cccgactgaa gctatcaccg acaatgacaa cccctgcgcc 2580
cgcgccacga tgtgggcttc agcgggtgga aggggtgaac tcagcagtag ggactctggc 2640
gtaccaggac gagcttctcg atttgtctgc atcttcgctg actgaatacg aggcttcccc 2700
tttggcattg ccgcagagtg aggacgccct ggcggtgagg agacgtgaag ctgaggaagt 2760
ccttagcgaa gccacggata tgccggacga catcaggttg acacccgtgt cgtcaagcag 2820
ttccctgtca agtgtagaga tcacgcgccc aaaatactca gctcaagcca tcattgacgc 2880
aggtggaccc tgttgtgggc acctccaaga ggtaaaggag aaatacctca atgtgatgcg 2940
tgaggcatgt gatgcgacca agcttgatga ccctgccacg caagaatggc tttcccgtat 3000
gtgggatagg gtggacatgc taacctggcg caacacgtcc atctttcaag cgcctttcac 3060
cttggccaac aagttcgagt ctctaccgaa gatgatactt gaaacaccac cgccctaccc 3120
ttgcgggttt gtgatgatgc cccgcacacc agtgccttcc gtaggtgcgg agagcgacct 3180
caccgttggt tcagtcgcca ctgaagacgt tccgcgcatc ctcggaaagg tacacgatgt 3240
tagcaaaacg gccgaccagg cacccttagc accctccaca gatggatcaa cagatggccg 3300
acttgctggg gaaccccgga cacaagctcc tcccgcaggc acaggtggcg ttgacttagg 3360
ctcggattct ggaggatcgc cggggctcgc tggcttgtcg cctaaaaacg gtacagatgc 3420
aggtggaggg ggactgttac acacggtcaa ggataaggct gagaaatgct ttgaccagct 3480
gagtcggcgg gtttttggca tcgtctccca tctccctgtt ttcttctcac gcttgttcag 3540
gtccgacggt tattattctc cgggtgattg gggctttgca acttttactt tattgtgtct 3600
ctttctatgt tacagttacc ctgcgtttgg tgtcgctccc ctcgtgggtg tattttctgg 3660
gactcctcgg cgcgtccgca tgggggtttt tggctgctgg ctggcttttg ctgttggttt 3720
gttcaagcct gtacccgacc cagtcggcac tgcttgtgag tttgactcgc cagaatgtag 3780
agacatcctt cattcttttg agcttctgca accttgggaa cctgttcgca gccttgtggt 3840
ggggcccgtc gggctctgcc tcgcagttct tggtaggtta ctgggtgggg cacgccacgt 3900
ctggttgctt ctgcttaggc ttggcatcct atcagactgt gttctggctg gagcctatgt 3960
gctttcgcaa ggcaggtgca aaaagtgctg gggatcttgt ataagaactg cccccagcga 4020
ggtcgctttt aacgtgtttc ccttcacacg tgcgaccagg tcatcactca tcgatttgtg 4080
caatcgattt tgtgtaccaa agggcatgga ccccattctc ctcgccactg gatggcgcgg 4140
gtgctggacc ggccaaagcc ccattgagca gccatctgag aaacccatcg cgtatgccca 4200
attggatgaa aagaaaatta cggccaggac tgtggtcgcc caaccttatg atcccaatca 4260
ggctgtaaag tgcttacggg ttttgcaggc tggtggggtg atggtggcgg aggctgtccc 4320
aaaagtaact aaggtttctg ctattccatt tcgagcccct ttttttccca ctggggtgag 4380
agttgaccct gattgcagga ttgtggtcga tcctgacact tttacagcgg ctctccggtc 4440
cggctattct acctcaaacc tcatccttgg tgttggggat tttgcccagc tgaatggatt 4500
gaaaatcagg cagatctcca agtcctcagg aggaggcccg cacttcgcag ctgccctgca 4560
tgttgcttgc tcgatggcca tgcacctgct tgccgggatt tatgtaacct cggtaggcac 4620
ctgcggcact ggcaccgatg acccgtggtg caccaacccg tttgccgtcc ctggttacgg 4680
acccggctct ctctgcacgt ctaggttgtg catctctcag catggcctta cactaccctt 4740
gacggcgtta gtggccgggt tcggcattca ggaaattgcc ttggttgttc tggtctttgt 4800
ttctattggc ggcttggctc accgattgag ttgcaaggct gatgtgatgt ttgttttgct 4860
tgcaattgcc agctatgttt gggaacctct tacctggttg ctctgtgtat ttccttgctg 4920
gctgaagtgt ttttctttgc accctttcac tattctgtgg ttggtgtttt tcttgatctc 4980
tgtaaatgcg ccttcgggaa tcttggccct ggtgttgttg gtctttctgt ggctcctcgg 5040
tcgttatacc aatgttgccg gtcttgtcac cccctatgat atccaccact acaccaatgg 5100
cccccgcggt gttgctgcct tagctaccgc accggacgga acctacctgg ccgctgtccg 5160
ccgcgccgcg ttgactggtc gcaccatgtt gtttaccccg tctcagcttg gatcccttct 5220
ggagggcgct tttaggaccc aaaaaccttc gctgaacacc gtcaacgtag tcgggtcttc 5280
catgggctcc ggtggagtgt tcactattga cgggaaaatt aagtgcgtga ccgcttcaca 5340
tgttcttaca ggcaattctg ccagggtttc cggagtcggc ttcaatcaaa tgcttgactt 5400
tgatgtgaag ggggacttcg ccatagccga ttgcccgaat tggcaagggg ttgcccccag 5460
gacccaattc tgcaaggacg gatggacagg tcgcgcctat tggctcacat cctccggcgt 5520
cgagcctggc gtcgttggca aggggttcgc cttttgcttt accgcctgcg gcgactccgg 5580
gtccccagtg gtcaccgagg ctggggagct tgttggcgtt cacacagggt caaacaagca 5640
gggggggggc attgtcacgc gcccttcagg ccagttttgt aacgtggcac ccaccaaact 5700
aagtgaatta agtgaatttt ttgctgggcc aaaggtcccg cttggcgacg tgaaggttgg 5760
cagtcatata attagagacg tgagcgaggt accttcagat ctttgcgcct tgctcgctgc 5820
caaacccgaa ctggaaggag gcctctccac cgtccaactt ctgtgtgtgt tttttctcct 5880
gtggaggatg atgggacatg cctggacgcc cctggtcgct gttggtttct ttgtcttgaa 5940
tgaggttctc ccagctgtgt tagttcggag tgttttctcc ttcggaatgt ttgtgctgtc 6000
atggctcaca ccatggtctg cgcaagttct gatgattagg ctcctaactg cagctcttaa 6060
caggaacaga tggtcactcg ccttttacag ccttggagca gcgactggtt ttgtcgcaga 6120
tcttgcggta actcaagggc atccgttgca gacagtgatg aatttaagta cttatgcctt 6180
cctgcctcgg atgatggtcg tgacctcacc agtcccagtg attgcgtgtg gtgttgtgca 6240
cctcctcgcc ataattttgt acttgtttaa acatcgctgc ctgcattttg tccttgttgg 6300
cgatggtgcg ttctctgcgg ctttcttctt gcgatatttt gccgagggga aattgaggga 6360
aggggtatcg caatcctgcg ggatgaatca tgagtcatta actggtgccc tcgctttgaa 6420
acttagtgat gaggacttgg attttcttac aaaattgact gatttcaagt gctttgtttc 6480
cgcatccaac atgaggaatg cggcgggtca attcatagag gccgcctatg ctaaagcact 6540
cagggtggaa cttgcccagt tggtgcaagt tgacaaagtt cgaggcatcc tagccaaact 6600
tgaagctttt gctgacaccg tggcacctca actctcgccc ggtgatattg ttgttgccct 6660
tggccacacg cctgtcggca gcattttcga cttgaaggtc ggcaatgtca agcacaccct 6720
ccagtccatt gagaccagag tccttgccgg atctaggatg accgtggcgc gcgtcgtaga 6780
cccgaccccc acgcccccac ccgcacctgt acccattccc cttccaccaa aggttttaga 6840
gaatggcccc agcgccgggt gggatgagac cggtttgaat aaaaagaagc ggcgcaggat 6900
ggaagccgtt ggcatttacg tcatgggcgg gaagaagtac cagaagtttt gggataagaa 6960
ttctggggac gtgttctatg aggaagttca cgataacaca gatgcttggg agtgtctcag 7020
agctggcgac cccgccgatc tggaccctga cagaggaacc ctgtgtggac acatcaccat 7080
agataacaaa ccttaccatg tttacgcctc ctcgtctggt aagaagttct tggtacctgc 7140
caacccagag aacgtgaaag cccagtggga agctgcaaag ctttccatgg aacaggccct 7200
cggcatgatg aatgttgacg gcgagttgac agccaaagaa gtggagaaat tgaagaggat 7260
aatcgagaaa ctccagggcc tgactaagga gcagtgttta aactgctagc cgctagcggc 7320
ttgacccgct gtggccgcgg cggcttagtt gttactgaga cagcggtaaa aatagtcaaa 7380
tttcacaacc ggactttcac cctgggacct gtgaatttaa aagtggctag tgaggtcgag 7440
ctaaaagacg cggttgagca caaccaacac ccggttgcga gaccgctcga tggtggagtt 7500
gtgctcctgc gttccgcggt tccttcgctc atagacgtct tgatctccgg tgctgatgca 7560
tctcccaagt tacttgccca tcacgggccg ggaaacactg ggatcgatgg cacactctgg 7620
gattttgagt ccgaagccac caaagaggaa gtcgcactca gcgcgcaaat aatacaggcc 7680
tgtgacatta gacgcggcga tgcgcccaat atcggcctcc cttacaaact gcaccctgtt 7740
agaggcaacc ccgaacgggt aaaaggggtc ctgaagaaca caaggtttgg agacatacct 7800
tacaagaccc ctagcgatac tgggagccca gtgcatgcgg ccgcctgcct tacacctaat 7860
gccaccccag tgactgatgg gcgctccata ttggccacga ctatgccctc cgggtttgag 7920
ttgtatgtgc cgactatccc agtgtctgtc cttgattacc ttgattctag gccagactgc 7980
cccaaacagt tgacggagca tggatgtgaa gatgctgcac ttagagacct ctccaaatat 8040
gacttgtcca cccaagggtt tgttttgcct ggagttctcc gtcttgtacg gaaatacctg 8100
tttgcccacg ttggcaagtg cccacctgtc catcggccct ccacctatcc agccaagaat 8160
tccatggctg gaataaacgg gaacaggttc ccaaccaaag atattcagag cgtccctgag 8220
atcgatgttc tgtgtgcaca ggctgtgcga gagaactggc agactgtcac cccttgcact 8280
ctcaagaagc agtattgcgg gaaaaagaaa actaggacca tacttggtac caataatttc 8340
attgcgctag cacaccgggc agcactgagc ggtatcaccc agggtttcat gaaaaaggcg 8400
ttcaactcgc ccatcgccct cgggaaaaac aaatttaagg agctacaaac tccggtcctg 8460
ggcaggtgcc ttgaggccga tcttgcatct tgcgatcggt ccacccccgc aattgttcgc 8520
tggttcgccg ctcacctcct ttatgagctt gcttgtgctg aggattacct tccgtcgtat 8580
gtgctgaact gctgccatga tttgttggtc acgcagtccg gcgcagtgac taaaaggggt 8640
ggcctatcat ctggtgatcc gattacatct gtgtccaaca ccatttacag tttggtgatt 8700
tatgcgcaac atatggtact cagttacttc aaaagcggtc acccacacgg actcctgttc 8760
ctccaagatc agctaaagtt tgaggacatg cttaaggtcc agcccctgat tgtctactcg 8820
gatgatcttg tgctgtatgc cgaatccccc tccatgccaa actatcactg gtgggttgag 8880
catcttaatt tgatgctagg gtttcagacg gacccaaaga aaacagctat cactgactcg 8940
ccgtcttttc tgggctgcag gataattaac gggcgtcagc tagtcccaaa ccgtgacagg 9000
attctcgcag ctcttgccta ccacatgaag gcgagcaatg tttctgagta ctacgcctcc 9060
gcggccgcaa tactcatgga cagttgtgca tgcctggagc acgaccctga atggtttgaa 9120
gaacttgtgg ttgggatggc gcagtgcgcc cgcaaggacg gttacagttt ccccggcccg 9180
ccgttcttct tatctatgtg ggaaaaactc aggtctaatt atgaggggaa gaagtcaagg 9240
gtgtgtgggt actgtggagc ttcagccccg tatgctactg cctgtggact tgacgtctgt 9300
gtttaccata cccactttca ccagcattgt cccgtcataa tctggtgtgg ccatccagcg 9360
ggttccgggt cctgtgatga gtgtaaatct cccacaggga aaggtgtgag ccctctggac 9420
gaggtcttga gacaagtccc gtataagcct ccacggactg tccttatgca tgtggagcag 9480
ggccttaccc cccttgaccc aggccgatat cagacccgcc gtgggttagt tgccgttagg 9540
cgtgggatca ggggaaatga agtcgacctg ccagatggtg attatgccag caccgcctta 9600
cttcctactt gtaaagagat caacatggtt gccgttgctt ctaatgtgtt gcgcagcaga 9660
tttatcattg gtccacccgg tgctgggaag acctactggc tccttcaaca ggtccaggat 9720
ggtgatgtca tctacacacc gacccaccag accatgctag acatgattaa agctttggga 9780
acgtgtcggt ttaacgtccc ggcaggcaca acgctgcaat ttcccgcccc ttcccgcacc 9840
ggcccgtggg ttcgcatcct ggccggcggg tggtgccctg gtaaaaactc ctttctggat 9900
gaagcggcgt attgcaatca tcttgatgtc ttgaggcttc ttagcaaaac cacgcttacc 9960
tgcttgggag acttcaaaca actccaccca gtaggcttcg attctcactg ctatgtcttt 10020
gatatcatgc ctcagactca actgaaaacc atctggagat ttgggcagaa catttgtgac 10080
gccattcaac cagattacag agacaagctc atgtctatgg tcaacacaac gcgtgtgacg 10140
tatgtggaga aacctgtcaa atatgggcaa gtcctcaccc cttaccatag ggaccgagag 10200
gatggtgcca tcaccattga ctccagtcaa ggtgccacat ttgatgtggt tacactgcat 10260
ttgcccacag aagattcact caacaaacaa agggcccttg ttgctattac cagggcaaga 10320
catgccatct ttgtgtatga cccgcatagg caactgcaga gcttatttga tcttcctgct 10380
acgagcacgc ctgtcaacct ggccgtgcac cgtgatgggc aactgattgt gctagacaga 10440
aataataaag agtgcacggt tgcccaagct ttgggtaatg gtgacaagtt tagggctaca 10500
gacaagcgcg ttgtagattc tcttcgcgcc atttgtgcag atctggaagg gtcgagttct 10560
ccactcccca aggtcgcaca taacttggga ttttattttt cgcctgactt gacacagttt 10620
gccaaactcc cggcagaact tgcaccccac tggcccgtgg tgacaaccca gaacaatgaa 10680
aagtggccag accggttggt tgctagcctc cgccccatcc ataagtacag ccgcgcgtgc 10740
attggtgccg gctacatggt gggcccctcc gtgtttctgg gtacccctgg ggttgtgtca 10800
tattatctca caaaatttgt cagaggcgag gctcaaatac ttccggagac gatcttcagc 10860
accggccgaa ttgaggtgga ttgccgtgag tatcttgatg accaggaacg aaaaattgct 10920
gagtccctcc cccatgcttt cattggcgac gtcaaaggca ctaccgtagg aggatgtcac 10980
cacgtcacct ccaaatatct cccgcgcttc cttcccaagg aatcagtcgc ggtggtcggg 11040
gtgtcaagcc ctgggaaagc cgcaaaagca atttgcacat taacagatgt gtacctccca 11100
gatctcgaaa cttacctcca cccagagacc cagtccaagt gctggaagtt gatgttggac 11160
ttcaaggaag ttcgactgat ggtctggagg gacaagacag cctattttca acttgaaggc 11220
cgccatttca cctggtacca gcttgcaagt tatgcatcgt acatccgagt tcctgttaac 11280
tctacggtgt atttggaccc ttgcatgggc cccgcccttt gcaacaggag agttgtcgga 11340
tccactcatt ggggagctga ccttgcagtc accccttacg attacggtgc caaaaccatc 11400
ctgtctagtg catactacgg tgagatgccc cccgggtaca aaatcctggc gtgtgctgag 11460
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gtggtatttt gcatcagatt ggtttgctcc acgatactcc gtgcgcgctc tgccgttcac 11880
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gaaacaggtg gtgagcgagg ccacgctatc tcgcatcagt ggcttggatg tggtagccca 12120
tttccagcac cttgctgcca ttgaagccga gacttgtaaa tatttggcct cgcggcttcc 12180
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aagtcaggtg tttgctattt tcccaacccc aggctcccgg cctaaactcc atgactttca 12300
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cctctaagtc acctattcaa ttagggcgac cgtgtggggg tatttaattg gcgagaacca 15000
tgcggccgta attaa 15015
<210> 2
<211> 15009
<212> DNA
<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
<400> 2
atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acattcgtat tgtcaggagc tgtgactact 60
tgcacagccc aaaacttgcc gctcagaaac acccttctgt gacggcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtt tgtccctgac accttgtttc tggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
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ccagtggacg ttgccacgcg cattccccac tgtcgagtgt tcccctgctg gggcttgctg 420
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cactgtcgtg gctcgaaggt cttcgccgga actccagtct cgaaaagcgg agtctgtcaa 2340
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gctttcgcag ggcaggtgca aaaagtgctg gggatcttgt ataagaactg cccccagcga 4020
ggtcgctttt aacgtgtttc ccttcacacg tgcgaccagg tcatcactca tcgatttgtg 4080
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ggctgtaaag tgcttacggg ttttgcaggc tggtggggtg atggtggcgg aggctgtccc 4320
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agttgaccct gatagcagga ttgtggtcga tcctgacact tttacagcgg ctctccggtc 4440
cggctattct acttcaaacc tcatccttgg tgttggggat tttgcccagc tgaatggatt 4500
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ttctattggc ggcttggctc accgattgag ttgcaaggct gatgtgatgt ttgttttgct 4860
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cgtgggatca ggggaaatga agtcgacctg ccagatggtg attatgccag caccgcctta 9600
cttcctactt gtaaagagat caacatggtt gccgttgctt ctaatgtgtt gcgcagcaga 9660
tttatcattg gtccacccgg tgctgggaag acctactggc tccttcaaca ggtccaggat 9720
ggtgatgtca tctacacacc gacccaccag accatgctag acatgattaa agctttggga 9780
acgtgccggt ttaacgtccc gacgggcaca acgctgcaat ttcccgcccc ttcccgcacc 9840
ggcccgtggg ttcgcatcct ggccggcggg tggtgccctg gtaaaaactc ctttctggat 9900
gaagcggcgt attgcaatca tcttgatgtc ttgaggcttc ttagcaaaac cacgcttacc 9960
tgcttgggag acttcaaaca actccaccca gtaggcttcg attctcactg ctatgtcttt 10020
gatatcatgc ctcagactca actgaaaacc atctggagat ttgggcagaa catttgtgac 10080
gccattcaac cggattacag agacaagctc atgtctatgg tcaacacaac gcgtgtgacg 10140
tatgtggaga aacctgtcaa atatgggcaa gtcctcaccc cttaccatag ggaccgagag 10200
gatggtgcca tcaccattga ctccagtcaa ggtgccacat ttgatgtggt tacactgcat 10260
ttgcccacag aagattcact caacaaacaa agggcccttg ttgctattac cagggcaaga 10320
catgccatct ttgtgtatga cccgcatagg caactgcaga gcttatttga tcttcctgct 10380
acgagcacgc ctgtcaacct ggccgtgcac cgtgatgggc aactgattgt gctagacaga 10440
aataataaag agtgcacggt tgcccaagct ttgggtaatg gtgacaagtt tagggctaca 10500
gacaagcgcg ttgtagattc tcttcgcgcc atttgtgcag atctggaagg gtcgagttct 10560
ccactcccca aggtcgcaca taacttggga ttttattttt cgcctgactt gacacagttt 10620
gccaaactcc cggcagaact tgcaccccac tggcccgtgg tgacaaccca gaacaatgaa 10680
aagtggccag accggttggt tgctagcctc cgccccatcc ataagtgcag ccgcgcgtgc 10740
attggtgccg gctacatggt gggcccctcc gtgtttctgg gcacccctgg ggttgtgtca 10800
tattatctca caaaatttgt cagaggcgag gctcaaatac ttccggagac gatcttcagc 10860
accggccgaa ttgaggtgga ttgccgtgag tatcttgatg accaggaacg aaaaattgct 10920
gagtccctcc cccatgcttt cattggcgac gtcaaaggca ctaccgtagg aggatgtcac 10980
cacgtcacct ccaaatatct cccgcgcttc cttcccaagg aatcagtcgc ggtggtcggg 11040
gtgtcaagcc ctgggaaagc cgcaaaagca atttgcacat taacagatgt gtacctccca 11100
gatctcgaag cttacctcca cccagagacc cagtccaagt gctggaagtt gatgttggac 11160
ttcaaggaag ttcgactgat ggtctggagg gacaagacgg cctattttca acttgaaggc 11220
cgccatttca cctggtacca gcttgcaagt tatgcatcgt acatccgagt tcctgttaac 11280
tctacggtgt atctggaccc ttgcatgggc cccgcccttt gcaacaggag agttgtcgga 11340
tccactcatt ggggagctga ccttgcagtc accccttacg attacggtgc taaaaccatc 11400
ctgtctagtg catactacgg tgagatgccc cccgggtaca aaatcctggc gtgtgctgag 11460
ttctcgcttg acgatccagt gaggtataaa cacacctggg ggtttgaatc ggacacagcg 11520
tacctgtacg agttcaccgg gaatggtgag gactgggagg attacaatga agcgtttcgt 11580
gcgcgccagg aagggaaaat ttatagggcc actgctacca gcttaaggtt ccattttccc 11640
ccgggtcccg tcattgaacc aactttaggc tcgaactgaa atgaaatggg ggctttgcag 11700
agcatttttg acaagattgg gcaacttttt gtggacgctt tcacggagtt cttggtttcc 11760
attgttgata tcatcatatt tttggccatt ttgttcggct tcacaatcgc cggatggttg 11820
gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc acgatactcc gtgcgcgctc tgccgttcac 11880
cctgagcaac tacagaagat cttatgaggc ttacctttcc cagtgccggg tggacatccc 11940
ttcctggggg acaaaacatc ccttgggtgt gctttggcac cataaggtgt cgaccctgat 12000
tgatgaaatg gtgtcgcggc gcatatacca caccatggag agagccgggc aggctgcctg 12060
gaaacaggtg gtgagcgagg ccacgctatc tcgcatcagt ggcttggatg tggtagccca 12120
tttccagcac cttgctgcca ttgaagccga gacttgtaaa tatttggcct cgcggcttcc 12180
catgctgcat aacttgcgca tggcagggtc aaatgtaacc atagaatata acagtacctc 12240
aagtcaggtg tttgctattt tcccaacccc aggctcccgg cctaaactcc atgactttca 12300
gcaatggtta atagctgtac attcctccat attttcctct gttgcagctt cttgtactct 12360
ttttgttgtg ctgtggttgc gggtcccaat gatacgttct gtttttggtt tccgctggtt 12420
aggggcaatt tttctttcga actcacagtg aattacacgg tgtgtctacc ttgcctcacc 12480
cggcaagcag ccgaggagat ctacgaaccc ggtaggtctc tttggtgcag gatagggaat 12540
gaccgatgtg aggagaggga tcatgacgag ctagagttta tggtgccgtc tggcctctcc 12600
agcgagggcc atttgactag tgtttatgcc tggttggcgt tcttgtcctt cacctacacg 12660
gcccagttcc atcccgagat attcgggata gggaatgtga gtcaagttta tgttgacatc 12720
aacaaccaac tcatctgcgc caaacatgac gggcagaaca ccaccttgcc tcgttatgat 12780
aacattacgg ccgtgtatca gacttattat caacatcagg tcgatggagg taattggttt 12840
cacctggaat ggctgcgccc tttcttttcc tcttggttgg ttttgaacgt ttcatggttt 12900
ctcaggcgtt cgcctgtaag ccgtgtttca gttcgagtct ttcagacatt aagaccaaca 12960
ccaccagcgc accaagttcc gttgtcctcc aagacatcag ctgccttagg catagcaacc 13020
cgtcccctgc ggcgtttcgc aaggtccctc aatgtcgcac ggcgatagga acacccgtct 13080
atatcactgt cacagccaac gtaacagatc agaattattt gcattcctct gaccttctca 13140
tgctctcctc ttgccttttc tacgcttctg agatgagtga aaagggaatt aaggtgatat 13200
ttggcaatgt gtcaggcgtt gtggctgtgt gtgtcaactt taccagctat gtccaacatg 13260
tcaaggagtt tacccagcga tccttagtga ttgaccatgt gaggctactt cacttcatga 13320
cacctgcgac tatgcggtgg gcgaccgttt tagcctgtct ttttgccatc ctgttggcaa 13380
tttgaatgtt tggatatgtt ggggaaatgc ttgaccgcgg gttattgctc gcaattgcct 13440
tttttgtggt gtatcgtgcc attctgtttt gttgtgctcg tcaacgccaa caacagcagc 13500
tcccatttac agttgattta taacctgacg atatgtgagc tgaatggcac agattggctg 13560
gataaaaaat ttgactgggc agtggagact ttcgtcatct ttcctgtgtt gactcacatt 13620
gtctcttacg gtgcccttac cactagccat tttcttgacg cggtcagcct gaccgctgtg 13680
tccaccgccg gttattatca cgggcggtat gtattgagta gcatctatgc tgtctgtgct 13740
ctggctgcgt ttgcttgctt cgcctttagg ttggcaaaaa attgcatgtc ctggcgctac 13800
tcatgcacca gatataccaa ttttcttctg gacactaagg gcagactcta ccgctggcgg 13860
tcacctgtca tcatagagaa agggggtaaa gttgatgttg gaggtcattt aatcgacctc 13920
aagagagttg tgcttgatgg ttccgcggca acccctttaa ccaagatttc agcggaacaa 13980
tggggataga cgacttctgc aatgatagca cggctgtaca aaaggtgcta ttggcgtttt 14040
ctatcaccta cacgccaata atgatatatg ccttaaaagt aagtcgcggt cgactgctag 14100
ggcttctgca cctcttaatt ttcctgaatt gtgctttcac ttttgggtac atgacatttg 14160
ttcactttcg gagtacaaac aaggtcgcat ttaccatggg cgcagtagtc gctctcctct 14220
ggggggtgta ttcagccatg gaaacctgga gattcatcac ctccaggtgc cggttgtgct 14280
tgctaggccg caagtacatt ctggcccctg cccaccacgt tgaaagtgcc gcaggctttc 14340
atccgataac ggcaagtgat aaccacgcgt ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg 14400
ttaacggcac actggtgccc gggttgaaaa gcctcgtgtt gggtggcaga agagctgtta 14460
agcgaggagt ggtgaacctt gttaaatatg ccaaataaca acggcagaca gcaaaataaa 14520
aagaaggggg atggccagcc agtcaatcag ttgtgccaga tgctgggtga gattatcgcc 14580
caacagagac agtccagagg caagggaccg ggaaagaaga gtaagaatag aaacccggag 14640
aagccccatt ttcctctggc gaccgaagat gacgtcagac atcacttcac ccctagtgag 14700
cgacaattgt gtctgtcgtc aatccggact gcctttaacc aaggcgctgg aacttgcacc 14760
ctgtcagact cagggagaat aagttacact gtggagttta gtttgcctac tcatcatacc 14820
gtgcgcctga ttcgcgccac agcgtcacct tcagcatgat gagctggcat tcttgagaca 14880
ccccgatgtt tgaattggaa gaatgagtgg tgaatggcac tgattgacat tgtgcctcta 14940
agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg ggggtattta attggcgaga accatgcggc 15000
cgtaattaa 15009

Claims (10)

1. 类NADC30猪蓝耳病强毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19691，保藏时间为2020年4月13日。
2.如权利要求1所述的类NADC30猪蓝耳病强毒株，其特征在于，所述的强毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.类NADC30猪蓝耳病弱毒株，命名为类NADC30猪蓝耳病病毒SD-R株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.19692，保藏时间为2020年4月13日。
4.如权利要求3所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株，其特征在于，所述的弱毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1或2所述的类NADC30猪蓝耳病强毒株、权利要求3或4所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株在制备诊断、预防或治疗类NADC30猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物为疫苗。
7.一种预防类NADC30猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物，其特征在于，由权利要求3或4所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株和药学上可接受的佐剂组成。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，通过以下方法制备得到：
选用生长良好的Marc-145细胞，倒掉培养液后，换以含1%v/v权利要求3或4所述的类NADC30猪蓝耳病弱毒株种子液的新鲜培养液，置于37℃继续培养，每日观察；培养2~3天后，有75-85%的细胞出现病变，并于对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存；将收获的病毒取样进行无菌检验，应无细菌生长，效价均应≥106.5TCID50/ml；将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂充分摇匀后分装，边分装边摇动，每只疫苗瓶分装量为2ml，迅速进行冷冻真空干燥，即得。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的蔗糖明胶保护剂通过以下方法制备得到：蔗糖280g，明胶49g加去离子水700ml加热溶解后，分装，110~116℃灭菌30~60分钟，即得。
10.如权利要求8或9所述的疫苗组合物，其特征在于，将检验合格的病毒液与蔗糖明胶保护剂按照体积比7:1混合，病毒液保持在10~20℃，蔗糖明胶保护剂保持在40-50℃。
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