CN111849830A - 一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌和其在促进蛋白分解方面的应用。所述枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性强，可强力促进蛋白物质分解。所述枯草芽孢杆菌可有效处理空气中的甲醛、氨和总挥发性有机物，以及抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长繁殖。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其制剂与应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
当今，全球面对的最大问题就是化学产品严重影响了大自然微生物的生态平衡，而造成日趋恶化的环境污染，更危害到人类的健康。人类、动、植物生活环境因长期使用化学消毒剂受到的污染日趋严重。证实传统的化学消毒剂不能真正清除有害细菌，相反更容易滋生，对抗生素产生耐药性后，形成更可怕的超级细菌及病原体。而自然界中的微生物是“无处不在，无时不有”的，无论是空气、河流、地面、几千米深的深海、动植物机体都有大量微生物存在。微生物活性菌剂是有益的有效的微生物群，能合成抗氧化物质，能抑制和杀死病原微生物和腐败菌。通过有益菌来抑制有害菌，通过有益菌于致病菌相互制约的关系，达到以菌制菌的效果。从而恢复自然环境的自愈力，增强和提高动植物的免疫功能，长期使用会令人体、动植物各种疾病奇迹般地好转或康复。
目前，世界各地的微生物科学家正不断努力研发以有益的细菌(亦称益生菌)去清除有害细菌及病毒的产品。倡导运用微生物竞争排斥的原理——以菌制菌。推广新一代高科技益生菌产品，减少和停止使用化学消毒剂，减少给人类和环境造成的危害。
从目前发展形势看，毋庸置疑，中国正在酝酿一场新的农业、养殖业革命。在未来的几年里我国畜牧养殖业绩将有重大转变：传统向现代转变；从贡献型向国家补贴型转变；家庭化经营向产业化经营转变；资源粗放经营向资源密集的集约经营转变。到2020年，我国畜牧业及农业以高产、优质、安全、生态为目标，现代化、科技化、产业化的设施管理模式将成为主导。
而枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物，根据研究表明某些枯草芽孢杆菌在饲料生产、抑制病原菌生长繁殖或在环境净化方面都有一定效果。但不是所有的枯草芽孢杆菌都具有以上的效果。
发明内容
本发明人通过对枯草芽孢杆菌的研究、筛选和验证，提供了一种可促进蛋白分解的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌株和含有其成分的制剂，可有效运用于空气净化和病原微生物的抑制。
为达到本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌KCYBGJ-B2。保藏日期为：2020年04月23日，分类命名的拉丁名称：Bacillus Subtilis，本发明的枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性强，可强力促进蛋白物质分解。
为达到本明的第二个发明目的，保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。
为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供一种促进蛋白分解的制剂，所述制剂中含保藏于CGMCC，有保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19705的枯草芽孢杆菌在抑制沙门氏菌生长方面的作用。
为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供一种沙门氏菌生长抑制剂，所述抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19705的枯草芽孢杆菌在抑制大肠杆菌生长方面的作用。
为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供一种大肠杆菌生长抑制剂，，所述抑制剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
为达到本发明的第八个发明目的，本发明提供保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.19705的枯草芽孢杆菌在清除空气中甲醛、氨和总挥发性有机物的作用。
为达到本发明的第九个发明目的，本发明提供一种空气净化剂，所述空气净化剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌作为有效成分。
本发明的有益效果至少包括：提供了一种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌和其在促进蛋白分解方面的应用。所述枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶活性强，可强力促进蛋白物质分解。所述枯草芽孢杆菌可有效处理空气中的甲醛、氨和总挥发性有机物，以及抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长繁殖，对沙门氏菌抑制率达到98.25％，对大肠杆菌的抑制率为94.43％。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌为发明人在畜禽养殖舍环境中分离筛选出，其能耐高温(在90℃可存活10分钟以上)、耐酸(可在pH值为2.5的环境中存活)、耐胆盐(在胆盐中存活率在90％以上)。该菌株可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氢；产酶有淀粉酶、蛋白酶；在培养基形成的菌落表面干燥，有微突起，无光泽；不透明，成灰白色，边缘扩张，有凸起，边缘不规则呈锯齿状，菌落较小；细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或偏端生，芽孢囊不明显膨大，在7％氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸，不利用丙酸盐。该枯草芽孢杆菌产生蛋白酶能力强，可快速、强力促进蛋白物质分解。
在分离筛选中，所用的样品为粪便发酵物，所用培养基按1L蒸馏水、0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、1.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖的配方配置，并在121℃灭菌20分钟，pH控制在7.2-7.4。用灭菌后的NaCl溶液，稀释样品，得到样品液。将样品液涂布在以上培养基后，在37℃、培养48小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌。
将分离出的单菌进行蛋白酶检测试验，蛋白酶活性达到78.96U/ml。该枯草芽孢杆菌菌种保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705。该菌种在牛奶培养基上37℃培养24小时后，水解圈直径为10mm，菌落直径在5mm，水解圈直径与菌落直径比为1.9。
筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时需要进行活化、培养，获得一定数量的纯种菌。
枯草芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：
a、菌种活化：将处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化
b、菌种扩大培养：将菌种依次经过一级种子摇床培养、二级种子罐培养、三级种子罐培养、发酵罐进行扩大培养。
所述菌种扩大培养用培养基包括如下组分：玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆、酵母浸粉、K2HPO4、蛋白胨、MgSO4.7H20；所述培养基的ph值为7.5。
实施例1一种含枯草芽孢杆菌的制剂(枯草芽孢杆菌芽孢数为7.0×107CFU/ml)
活化：使用实施例1中的培养基对保存的枯草芽孢杆菌进行划线活化，温度为37℃，培养时间24h；
种子液制备：将活化的单菌落接种于种子液培养基，不过此时的培养基中不添加琼脂，以500ml三角瓶37℃条件下振荡培养24-48h，取样进行染色等鉴定，防止污染；
发酵：使用不锈钢发酵罐及其菌种扩大培养基，接种量为5％，常温下发酵48h，在显微镜下观察芽孢率，当芽孢率达到95％以上时，停止搅拌；(烘干：将枯草芽孢杆菌发酵液利用离心沉淀技术将芽孢进行分离纯化最后进行烘干；)检测：按照GB/T 26428-2010方法对获得的枯草芽孢杆菌进行计数和蛋白酶检测；在蛋白酶检测中，烘干步骤得到的发酵液烘干物中，蛋白酶含量≥500U/g)
混合：根据检测得到的计数结果，向纯净水中添加枯草芽孢杆菌发酵液得到含枯草芽孢杆菌的制剂，制剂中枯草芽孢杆菌芽孢数为7.0×107CFU/ml。
实施例2对空气中甲醛、氨、TVOC去除试验
1、规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2761-2006室内空气净化产品净化效果测定方法》；
2、仪器和设备：气泡吸收管、空气采样器、10ml具塞比色管、活性碳采样管、分光光度计、气相色谱仪、便携式甲醛检测仪、1.5m2空气试验舱
3、实验步骤：将未经处理的基纸悬挂于空白试验舱A中，再将经过喷涂实施例1制备的制剂喷涂(喷涂量为50ml/m3)后的基纸悬挂于样品组试验舱B中。
将装有配好的污染物释放源A1和B1的容器分别放置于空白试验舱A和样品试验舱B中，立即关闭舱门。
开启空白试验舱A和样品试验舱中的风扇，搅拌1min，使舱内空气于释放源的污染物混匀后，同时关闭风扇，对空白舱内空气进行采样，测定空白舱内污染物浓度值物初始浓度，记作C0。
24h后对两舱内空气污染物进行采样，分析测试，即为某一时间段内A、B舱的浓度值，记作CA和CB。
4、采样结果分析
污染物甲醛的检测方法按GB/T 18204.26-2000；污染物氨检测方法按GB/T18204.26-2000；污染物总挥发性有机物(TVOC)的检测方法按GB/T 18883-2002。
5、被动式净化材料对污染物去除率的计算
Y＝(CA-CB)/CA*100％
式中：
Y------去除率，％；
CA------空白试验舱污染物浓度值，mg/m3；
CB------样品试验舱污染物浓度值，mg/m3。
6、实验结果
Figure BDA0002618772460000061
试验结果显示，样品组甲醛、氨以及TVOC的浓度相较于空白对照组有明显的降低，对甲醛的去除率为90.43％；对氨的去除率为90.25％；对TVOC的去除率为81.77％。
实施例3：养鸡场清洁试验
在肉鸡场选取2栋鸡舍为测试对象，鸡舍1为对照组，鸡舍2为试验组，2栋鸡舍面积和空间均相同，鸡舍内各有30000只鸡。
对照组1用清水喷雾；
对照组2使用实施例1制备的制剂用清水按1:100稀释，稀释后按每100L稀释液喷洒500m2的鸡舍，每三天喷洒一次；
用喷雾器均匀喷洒溶剂在鸡舍的地面、墙壁上，5天后进行臭气、氨气气体的浓度检测，结果如下：
臭味去除率 氨气去除率
对照组 0 0
试验组 80％ 50％
其中，臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T 14675),氨气采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法(GB/T 14679)。
饲养到肉鸡出栏后统计鸡的出栏数，计算成活率。结果如下表：
检测区域 进雏数(只) 出栏数(只) 成活率(％)
对照组 30000 28134 93.78
试验组 30000 28973 96.58
试验结果表明，保藏于CGMCC保藏号为CGMCC NO.19705枯草芽孢杆菌可以有效降低鸡场鸡舍空气中的氨气和臭气，可明显提升肉鸡的成活率。
实施例4：抑制沙门氏菌和大肠杆菌生长繁殖上的效果
(1)规范性引用文件：《中华人民共和国标准QB/T 2738-2012日化产品的抗菌抑菌效果的评价方法》；
(2)主要仪器与试剂：电子天平、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、pH计、菌落计数器、超净工作台、超声波清洗器、显微镜等微生物实验必备仪器；
(3)营养琼脂培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、琼脂粉15.0g、氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(4)营养肉汤培养基制备：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃高压灭菌20min，冷藏备用；
(5)SS琼脂：用于沙门氏菌的平板菌落计数，产商为广东环凯微生物科技有限公司。
(6)结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：用于大肠菌群的平板菌落计数，产商为广东环凯微生物科技有限公司。
(7)沙门氏菌和大肠杆菌细菌繁殖体悬液的制备：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基于管中将冻干菌粉全部溶解。取营养肉汤培养基5.0ml-10ml试管，滴入少许菌种悬液，置于37℃培养箱中培养24h，用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于斜面上，与37℃培养箱中培养24h即为第3代培养物；取菌种新鲜培养物，吸取5ml稀释液加入斜面试管中，反复吹吸，洗下菌苔，随后将洗液移至另一根无菌试管中，用电动混合器混匀。细菌繁殖体悬液保存在4℃冰箱中备用，应当天使用，不应过夜。
(8)操作步骤：在无菌操作下，吸取试验菌菌悬液1ml接种于100ml营养肉汤培养基中，混合均匀，同时加入1ml实施例1所制备制剂，另取100ml营养肉汤培养基加入同样的试验菌悬液1ml作为空白对照组，混合均匀，用平板计数法测定肉汤中试验菌的菌数，吸取样液(或作适当的稀释后，取其中2-3个稀释度的稀释液)1ml，置于灭菌平板内，每个样液接种两个灭菌平板。用凉至40-45℃的培养基作倾注，绕8字混合均匀，待培养基凝固后倒扣平板于37℃培养箱内培养48h，用做活菌菌落计数；将上述混合培养物放置于37℃、200r/min的恒温培养振荡中振荡培养(200r/min)48小时，共培养后按照上述方法对试验菌的菌数进行测定并计数。
(9)计算公式
X＝A/B*100％
式中：X——抑菌率，％
A——对照组平均菌落数
B——实验组平均菌落数
(10)抑菌效果
Figure BDA0002618772460000091
从实验结果表明，保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC NO.19705枯草芽孢杆菌，对沙门氏菌抑制率达到98.25％，对大肠杆菌的抑制率为94.43％，即保藏号为CGMCC NO.19705枯草芽孢杆菌对沙门氏菌和大肠杆菌的生长繁殖有着明显的抑制作用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌。
2.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌在促进蛋白分解方面的应用。
3.一种促进蛋白分解的制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌作为有效成分。
4.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌在抑制沙门氏菌生长方面的作用。
5.一种沙门氏菌生长抑制剂，其特征在于，所述抑制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌作为有效成分。
6.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌在抑制大肠杆菌生长方面的作用。
7.一种大肠杆菌生长抑制剂，其特征在于，所述抑制剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌作为有效成分。
8.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.19705的枯草芽孢杆菌在清除空气中甲醛、氨和总挥发性有机物的作用。
9.一种空气净化剂，其特征在于，所述空气净化剂中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌作为有效成分。
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