CN111848631B - 一种靶向EGFR突变的吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向EGFR突变的吡咯并[2,3‑d]嘧啶衍生物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。该衍生物是式I所示的化合物、或其盐、或其立体异构体。本发明化合物对正常细胞毒性低，对肺癌细胞系具有明显的抑制效果，特别是对于EGFR突变型细胞HCC827细胞具有良好的选择性，抑制效果显著；同时，本发明化合物可以有效抑制EGFR的磷酸化。此外，本发明化合物对突变型EGFR具有良好的抑制活性和选择性。本发明化合物能够用于治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌，其对于EGFR突变型肺癌具有较强的抑制作用，且毒性较小；本发明还能用于制备酪氨酸激酶抑制剂，特别是EGFR磷酸化抑制剂，具有良好的应用前景。

Description

一种靶向EGFR突变的吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物及其制备方 法和用途

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及一种靶向EGFR突变的吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年因肺癌造成的死亡人数达到160万，是导致男性(22％的癌症死亡)和女性(13.8％的癌症死亡)癌症相关死亡的主要原因。在美国，大约14％的新发癌症是肺癌。美国癌症协会(American Cancer Society)估计，2018美国的肺癌病例约为23.4万，死亡病例约为15.4万。我国的情况同样严重，根据2019年1月国家癌症中心发布的中国最新癌症数据显示，肺癌是我国发病率和死亡率第一的恶性肿瘤，对国民健康造成极大的威胁，给社会经济发展带来极大压力。非小细胞肺癌约占所有肺癌的85％，这些患者具有同一组织学亚型。非小细胞肺癌又包括肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)和大细胞癌。

在过去的20年中，肺癌的治疗取得了很多进展，包括针对肺腺癌特定分子亚型的方法以及治疗肺鳞癌的新方法的发展。目前肺癌的药物治疗手段主要包括化疗、免疫治疗以及分子靶向治疗。

EGFR是酪氨酸激酶I型受体家族成员，其基因位于人类7号染色体上。EGFR中有28个外显子，它们可以形成一种分布在各种上皮细胞细胞膜上的蛋白质，与表皮生长因子或EGF结合，调节细胞的生长。相比之下，在非小细胞肺癌EGFR突变中，20外显子***和18点外显子突变要比19外显子缺失和21L858R外显子替换少见。EGFR及其下游基因的激活和调控导致细胞增殖、凋亡和血管生成。一些针对EGFR突变的药物已经被开发出来，如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，BRAF抑制剂。

20世纪90年代末，随着口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼的问世，NSCLC患者的分子靶向治疗首次得到应用。埃罗替尼是另一种针对EGFR的TKI，对于晚期非小细胞肺癌患者，这种药物比维持疗法生存率更高。研究表明，绝大多数受益于EGFR TKIs的患者身上都观察到了EGFR突变的激活。包括ALK重排、ROS1融合和BRAF突变在内的额外基因改变有效地促进了靶向治疗的发展。

在过去的几十年里，酪氨酸激酶抑制剂一直被认为是治疗非小细胞肺癌的有效药物，也是很好的靶向药物。针对EGFR出现了多种药物，如吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗。一些研究表明，与一线化疗相比，两种第一代EGFR TKIs(吉非替尼和埃罗替尼)在PFS方面具有实质性的好处。但是，晚期NSCLC患者化疗后，EGFR-TKI对OS的影响不明显。一些研究表明，患者在接受第一代EGFR-TKI治疗10-14个月后出现耐药性。第一代EGFR-TKI在NSCLC中的耐药机制已被鉴定为TK结构域突变(T790M)、MET扩增、RAS突变等。TK区域突变(T790M)被认为是NSCLC患者最常见的获得性耐药突变。有T790M突变的NSCLC患者中有一部分从未接受过EGFR-TKI治疗。这些发现提示T790M突变是NSCLC患者的潜在靶点。因此，需要开发新的措施和疗法来克服耐药性。

近年来，奥西替尼作为第三代EGFR-TKIs出现，它能够靶向敏感和耐药的EGFR突变(T790M)。在FLAURA研究中，奥西替尼治疗的NSCLC患者的中位PFS(18.9个月)明显长于第一代EGFR-TKIs(吉非替尼和埃罗替尼)患者的中位PFS(10.2个月)。然而不幸的是，一项研究表明，奥西替尼的耐药性已经出现。在45例患者身上出现了EGFR C797S突变，PIK3CA、KRAS、BRAF突变以及MET扩增。在EGFR突变的NSCLC中，5-20％EGFR-TKI药物耐受患者出现MET扩增。MET扩增增加了NSCLC中HCC827细胞的增殖和迁移。所以，仍然需要不断研发更新的第三代EGFR-TKI靶向药物分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向EGFR突变的吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种式I所示的化合物、或其盐、或其立体异构体：

其中，

R₁选自卤素、C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；但R₁不为氟；

R₂选自氢、卤素、C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基或-(CH₂)_n-O-C(O)-R₃；

n选自1～8的整数；

R₃选自氢或C₁～C₈烷基。

进一步地，

R₁选自氯、溴、碘、C₁～C₄烷基、C₁～C₄烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；

R₂选自氢、卤素、C₁～C₄烷基、C₁～C₄烷氧基、羟基、硝基、氨基、羧基或-(CH₂)_n-O-C(O)-R₃；

n选自1～4的整数；

R₃选自氢或C₁～C₄烷基；

优选地，

R₃选自氢或叔丁基。

进一步地，所述化合物如式II所示：

其中，

R₁选自卤素、C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；但R₁不为氟；

优选地，R₁选自氯、溴、碘、C₁～C₄烷基、C₁～C₄烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；

更优选地，R₁选自氯、溴、碘、C₁～C₃烷基、C₁～C₃烷氧基、硝基或氨基。

进一步地，所述化合物如式III所示：

其中，

R₁选自卤素、C₁～C₈烷基、C₁～C₈烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；但R₁不为氟；

优选地，R₁选自氯、溴、碘、C₁～C₄烷基、C₁～C₄烷氧基、羟基、硝基、氨基或羧基；

更优选地，R₁选自氯、溴、碘、C₁～C₃烷基、C₁～C₃烷氧基、硝基或氨基。

进一步地，所述化合物为如下化合物之一：

本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备酪氨酸激酶抑制剂中的用途。

进一步地，所述酪氨酸激酶抑制剂是抑制EGFR磷酸化的药物。

进一步地，所述酪氨酸激酶抑制剂是治疗癌症的药物；

优选地，所述癌症为肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、白血病、骨癌、淋巴癌。

进一步地，所述癌症为肺癌；优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌；更优选地，所述肺癌为EGFR突变型非小细胞肺癌。

本发明还提供了一种药物，它是由前述的化合物、或其盐、或其立体异构体为活性成分，加上药物上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明中提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名***命名。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

本发明中，卤素为氟、氯、溴或碘。

“烷基”是烷烃分子中少掉一个氢原子而成的烃基，例如甲基-CH₃、乙基-CH₃CH₂等。C₁～C₈烷基是指含有一个至八个碳原子的直链或支链的烃链。

“C₁～C₈烷氧基”是指含有一至八个碳原子的烷氧基。

本发明中，室温是25±5℃；过夜为12±2h。

本发明化合物对正常细胞毒性低，对肺癌细胞系具有明显的抑制效果，特别是对于EGFR突变型细胞HCC827细胞具有良好的选择性，抑制效果显著；本发明化合物可以诱导EGFR突变型细胞H1975细胞和HCC827细胞的凋亡，同时将这两种细胞的周期阻滞在了G0/G1期。同时，本发明化合物可以有效抑制EGFR的磷酸化，以及H1975细胞中参与癌细胞增殖和存活的通路下游的两个重要激酶Akt和ERK1/2的磷酸化。此外，本发明化合物对突变型EGFR具有良好的抑制活性和选择性。本发明化合物能够用于制备治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌的药物，其对于EGFR突变型肺癌具有较强的抑制作用，且毒性较小；本发明还能用于制备酪氨酸激酶抑制剂，特别是EGFR磷酸化抑制剂，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为中间体化合物19的氢谱图。

图2为中间体化合物20的氢谱图。

图3为本发明化合物1的氢谱图。

图4为本发明化合物2的氢谱图。

图5为本发明化合物3的氢谱图。

图6为本发明化合物4的氢谱图。

图7为本发明化合物5的氢谱图。

图8为本发明化合物6的氢谱图。

图9为本发明化合物7的氢谱图。

图10为本发明化合物8的氢谱图。

图11为本发明化合物9的氢谱图。

图12为本发明不同化合物对正常细胞和不同肺癌细胞系的抑制活性(IC₅₀/μmol)。

图13为化合物5对不同细胞EGFR及相关蛋白磷酸化的抑制。

图14为化合物6对不同细胞EGFR及相关蛋白磷酸化的抑制。

图15为艾维替尼对不同细胞EGFR及相关蛋白磷酸化的抑制。

图16为化合物5、化合物6和艾维替尼对HCC827细胞的凋亡影响。

图17为化合物5、化合物6和艾维替尼对H1975细胞的凋亡影响。

图18为化合物5、化合物6和艾维替尼对HCC827细胞的周期影响。

图19为化合物5、化合物6和艾维替尼对H1975细胞的周期影响。

具体实施方式

除非另有说明，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。主要试剂如表1。

表1.本发明部分实验试剂

主要仪器：

(1)质谱分析仪：Q-TOF光谱仪，ESI电离源，德国Bruker；

(2)核磁共振仪：AV II-400MHz、AV II-600MHz或AV II-800MHz，TMS为内标，德国Bruker。

实施例1、关键中间体1的合成

关键中间体1的合成路线如下：

其中，

X＝Br时，中间体1为化合物10，关键中间体1为化合物14；

X＝I时，中间体1为化合物11，关键中间体1为化合物15；

X＝OH时，中间体1为化合物12，关键中间体1为化合物16；

X＝OCH₃时，中间体1为化合物13，关键中间体1为化合物17。

或者，关键中间体1的合成路线如下：

X＝NO₂时，关键中间体1为化合物18。

具体制备方法如下：

(1)1-(2-碘-4-硝基苯)-4-甲基哌嗪(11)的合成：将4-氟-3-碘硝基苯(1.34g，5.0mmol)，N-甲基哌嗪(约6ml，52mmol)的混合溶液加热到90℃，反应5h以上，放置到室温，加水稀释，析出沉淀，将得到的固体抽滤，用水洗涤，干燥得到产物1.67g(化合物11)，产率：96％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₁₁H₁₄IN₃O₂:348.0131[M+H]+；Found 348.0204[M+H]⁺.

(2)3-碘-4-(4-甲基哌嗪)-苯胺(15)的合成：将化合物11(1.39g，4mmol)与钯碳(0.3g)溶解在50ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(2ml，溶解在10ml异丙醇中)，反应1h；冷却后过滤，将滤液减压浓缩，得到产物1.23g(化合物15)，产率97％。HRMS-ESI(m/z):calcd for C₁₁H₁₆IN₃:318.0389[M+H]⁺；Found 318.0468[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.23–7.18(m,1H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),6.69–6.59(m,1H),3.48(d,J＝37.4Hz,2H),2.93(d,J＝5.0Hz,4H),2.73–2.57(m,4H),2.39(s,3H).

(3)1-(2-溴-4-硝基苯)-4-甲基哌嗪(10)的合成：将4-氟-3-溴硝基苯(1.09g,5.0mmol)，N-甲基哌嗪(约6ml，52mmol)的混合溶液加热到90℃，反应5h以上，放置到室温，加水稀释，析出沉淀，将得到的固体抽滤，用水洗涤，干燥得到产物1.42g(化合物10)，产率：95％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₁₁H₁₄BrN₃O₂:300.0269[M+H]⁺,322.0269[M+Na]⁺；Found300.0348[M+H]⁺322.0165[M+Na]⁺.

(4)3-溴-4-(4-甲基哌嗪)-苯胺(14)的合成：将化合物10(1.22g，4.08mmol)与钯碳(0.3g)溶解在50ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(2ml,溶解在10ml异丙醇中)，反应1h；冷却后过滤，将滤液减压浓缩，得到产物1.05g(化合物14)，产率：96％。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₁H₁₆BrN₃:270.0528[M+H]⁺；Found 270.0600[M+H]⁺.

(5)1-(2-甲氧基-4-硝基苯)-4-甲基哌嗪(13)的合成：将1-氟-2-甲氧基-4-硝基苯(0.85g,5.0mmol)，N-甲基哌嗪(约6ml，52mmol)的混合溶液加热到90℃，反应5h以上，放置到室温，加水稀释，析出沉淀，将得到的固体抽滤，用水洗涤，干燥得到产物1.17g(化合物13)，产率：93％。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₂H₁₇N₃O₃:252.1270[M+H]⁺；Found 252.1341[M+H]⁺。

(6)3-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪)-苯胺(17)的合成：将化合物13(1.22g，4.86mmol)与钯碳(0.3g)溶解在50ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(2ml,溶解在10ml异丙醇中)，反应1h；冷却后过滤，将滤液减压浓缩，干燥得到产物1.03g(化合物17)，产率：96％。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₂H₁₉N₃O:222.1528[M+H]⁺；Found 222.1603[M+H]⁺.¹HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.25(d,J＝8.5Hz,2H),3.80(s,3H),3.49(s,2H),3.01(s,4H),2.63(s,4H),2.36(s,3H).

(7)2-(4-甲基哌嗪)-5-硝基苯酚(12)的合成：将2-氟-5-硝基苯酚(0.79g,5mmol)，N-甲基哌嗪(约6ml，52mmol)的混合溶液加热到90℃，反应5h以上，放置到室温，加水稀释，析出沉淀，将得到的固体抽滤，用水洗涤，干燥得到产物1.13g(化合物12)，产率：95％。HRMS(ESI⁺)m/z:Calcd for C₁₁H₁₅N₃O₃:238.1113[M+H]⁺；Found 238.1192[M+H]⁺。

(8)5-氨基-2-(4-甲基哌嗪)-苯酚(16)的合成：将化合物12(0.95g,4m mol)溶解在50ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(2ml,溶解在10ml异丙醇中)，反应1h；冷却后过滤，将滤液减压浓缩，得到产物0.81g(化合物16)，产率：98％。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₁H₁₇N₃O:208.1372[M+H]⁺；Found 208.1446[M+H]⁺。

(9)4-(4-甲基哌嗪)-3-硝基苯胺(18)的合成：将4-氟-3-硝基苯胺(7.8g,0.05mol)，N-甲基哌嗪(28ml,0.25mol)，30ml乙腈的混合溶液在90℃条件下反应3h以上。反应结束，放置到室温，旋干。硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂)得到棕色固体产物11g(化合物18)，产率：93％。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₁H₁₆N₄O₂:237.1273[M+H]⁺；Found 237.1351[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.16–7.11(m,1H),6.82(d,J＝8.4Hz,1H),6.61–6.55(m,1H),3.42(d,J＝32.3Hz,2H),2.86(d,J＝5.0Hz,4H),2.65–2.50(m,4H),2.32(s,3H).

实施例2、关键中间体2的合成

关键中间体2的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物19的合成：在圆底烧瓶中加入2,4-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(4.68g,0.025mol)，用THF溶解，再加入特戊酸氯甲酯(7.5g，0.05mol)和碳酸钾(0.1mol，13.8g)，在室温下搅拌5分钟，然后将温度升至80℃回流。继续反应约12h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂)。待反应液冷却后，将反应液旋干，加入150ml水和CH₂Cl₂(300ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂)得到白色固体产物5.43g(化合物19)，产率：72％。化合物19的氢谱图如图1所示。HRMS-ESI(m/z)calcd for C₁₂H₁₃Cl₂N₃O₂:302.0385[M+H]⁺；324.0385[M+Na]⁺；Found302.0463[M+H]⁺；324.0278[M+Na]⁺。¹H NMR(600MHz,Chloroform-d)：δ7.47(d,J＝3.8Hz,1H),6.62(d,J＝3.7Hz,1H),6.16(s,2H),1.16(s,9H).

化合物20的合成：在圆底烧瓶中加入化合物19 15g(0.05mol)，用乙腈溶解，再加入3-硝基酚10g(0.072mol)和K₂CO₃ 13.8g(1mol)，在室温下搅拌5分钟，然后将温度升至80℃，继续反应约10h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂)。待反应液冷却后，将反应液旋干，用pH＝10的NaOH水溶液和CH₂Cl₂(300ml×3)萃取，以除去过量的3-硝基酚，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂)得到白色固体产物14.91g(化合物20)，产率：74％。化合物20的氢谱图如图2所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₁₈H₁₇ClN₄O₅:427.0887[M+Na]⁺；Found 427.0779[M+Na]⁺。¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)：δ8.28(t,J＝2.1Hz,1H),8.21(ddd,J＝8.2,2.2,1.0Hz,1H),7.88(ddd,J＝8.2,2.3,1.0Hz,1H),7.81(t,J＝8.3Hz,1H),6.74(d,J＝3.7Hz,1H),6.19(s,2H),1.11(s,9H)。

实施例3、本发明化合物1的合成

化合物1的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物21的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(50ml)，关键中间体2(化合物20)(1.21g,3mmol)，3-氟-4-(4-甲基哌嗪)-苯胺(522mg，2.5mmol)。将上述反应溶液在室温下搅拌5-10min。在上述反应溶液中依次加入碳酸钾(690mg，5mmol)，Pd₂(dba)₃(230mg,0.25mmol，一种催化剂，催化碳氮键的形成)，XPhos(即2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯，120mg，0.25mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。待反应液冷却至室温，旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:5，v/v)得到红棕色固体产物1.13g(21)，产率为78％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₉H₃₂FN₇O₅:578.2449[M+H]⁺；Found 578.2526[M+H]⁺。

化合物22的合成：在50ml圆底烧瓶中加入化合物21(0.58g，1mmol)，用20ml甲醇溶解，在室温下搅拌5分钟。将NaOH溶液(0.4g氢氧化钠溶解在10ml纯化水中，取4ml)滴加到上述反应液中，继续搅拌反应5h。TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。调节溶液pH至中性，将反应液旋干，萃取，干燥，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:3，v/v)，分两批进行，共得到得到红棕色固体产物0.80g(22)，产率：86％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₂FN₇O₃:464.1768[M+H]⁺；Found 464.1846[M+H]⁺。

化合物23的合成：将化合物22(0.463g,1mmol)与钯碳(0.08g)溶解在20ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(0.5ml,溶解在10ml异丙醇中)，反应1h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。冷却后过滤反应混合物，将滤液减压浓缩，得到产物0.42g(23)，产率为97.0％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₄FN₇O:434.2026[M+H]⁺；Found434.2096[M+H]⁺。

化合物1的合成：将化合物23(0.42g，0.943mmol)，溶解在30mlTHF中，滴加DIEA(312μl，1.89mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当反应器内部温度到达-3℃的时候，继续滴加丙烯酰氯的THF溶液(153μl，1.89mmol)。过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱。旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:5，v/v)得到固体产物0.38g(化合物1)，产率为83％。化合物1的氢谱图如图3所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₆H₂₆FN₇O₂:488.2132[M+H]⁺；Found488.2206[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.62(s,1H),10.32(s,1H),9.16(s,1H),7.78(d,J＝2.5Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.62–7.55(m,1H),7.51–7.33(m,2H),7.10(t,J＝2.9Hz,1H),6.99(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.43(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.33–6.19(m,2H),5.76(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),2.84(d,J＝5.1Hz,4H),2.44(s,4H),2.21(s,3H).

实施例4、本发明化合物2的合成

化合物2的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物24的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(50ml)，关键中间体2(化合物20)(1.28g,3.17mmol)，3-氯-4-(4-甲基哌嗪)-苯胺(560mg，2.5mmol)。将上述反应溶液在室温下搅拌5-10min。在上述反应溶液中依次加入碳酸钾(690mg，5mmol)，Pd₂(dba)₃(230mg,0.25mmol)，XPhos(120mg，0.25mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。待反应液冷却至室温，旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)得到红棕色固体产物0.79g(24)，产率：54％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₉H₃₂ClN₇O₅:594.2153[M+H]⁺；Found 594.2228[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.35–8.12(m,2H),7.91–7.71(m,2H),7.69(s,1H),7.32(d,J＝3.7Hz,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),6.56(d,J＝3.7Hz,1H),6.11(s,2H),2.83(t,J＝4.8Hz,4H),2.43(s,4H),2.21(s,3H),1.11(s,9H).

化合物25的合成：在50ml圆底烧瓶中加入化合物24(0.59g，1mmol)，用20ml甲醇溶解，在室温下搅拌5min。将NaOH溶液(0.4g氢氧化钠溶解在10ml纯化水中，取4ml)滴加到上述反应液中，继续搅拌反应5h。TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。调节溶液pH至中性，将反应液旋干，萃取，干燥，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100:3，v/v)得到红棕色固体产物(两批)0.91g(25)，产率：95％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₂ClN₇O₃:480.1473[M+H]⁺；Found 480.1551[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.69(s,1H),9.21(s,1H),8.20(dd,J＝7.0,1.9Hz,2H),7.93–7.59(m,3H),7.32(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),7.16(dd,J＝3.6,1.7Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.43(d,J＝3.4Hz,1H),2.83(t,J＝4.8Hz,4H),2.43(s,4H),2.21(s,3H).

化合物26的合成：将化合物25(0.479g，1mmol)与钯碳(0.08g)溶解在20ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(0.05ml水合肼溶解在10ml异丙醇中)，反应1h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。冷却后过滤反应混合物，将滤液减压浓缩，得到产物0.43g(26)，产率为96.0％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₄ClN₇O:450.1731[M+H]⁺；Found 450.1806[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.54(d,J＝35.6Hz,1H),9.18(d,J＝13.6Hz,1H),7.86(dd,J＝16.5,2.5Hz,1H),7.73–7.47(m,1H),7.30–6.83(m,3H),6.69–6.26(m,3H),6.14(ddd,J＝27.8,3.5,1.9Hz,1H),5.28(s,2H),2.88(t,J＝4.8Hz,4H),2.46(s,4H),2.22(s,3H).

化合物2的制备：将化合物26(0.45g，1mmol)溶解在30ml THF中，滴加DIEA(312μl，1.89mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当反应器内部温度到达-3℃的时候，滴加丙烯酰氯的THF溶液(153μl，1.89mmol)；滴加过程中，温度保持在-5～0℃之间；过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱。旋干，加入100ml水和CH₂Cl₂(150ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)得到固体产物0.41g(化合物2)，产率为82％。化合物2的氢谱图如图4所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₆H₂₆ClN₇O₂:504.1837[M+H]⁺；Found 504.1913[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.62(s,1H),10.32(s,1H),9.16(s,1H),7.78(d,J＝2.5Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.62–7.55(m,1H),7.51–7.33(m,2H),7.10(t,J＝2.9Hz,1H),6.99(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.43(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.33–6.19(m,2H),5.76(dd,J＝10.0,2.0Hz,1H),2.84(d,J＝5.1Hz,4H),2.44(s,4H),2.21(s,3H).

实施例5、本发明化合物3的合成

化合物3的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物27的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(50ml)，关键中间体2(化合物20)(0.404g,1mmol)，中间体4-(4-甲基哌嗪)苯胺(191mg，1mmol)。将上述反应溶液在室温下搅拌5-10分钟。在上述反应溶液中依次加入碳酸钾(276mg，2mmol)，Pd₂(dba)₃(18mg,0.02mmol)，XPhos(19mg，0.04mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。待反应液冷却至室温，旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)得到红棕色固体产物0.397g(27)，产率：71％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₉H₃₃N₇O₅:560.2543[M+H]⁺；Found 560.2620[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.12(dt,J＝8.7,2.4Hz,2H),7.62–7.52(m,2H),7.35(s,1H),7.03(d,J＝3.7Hz,1H),6.91(s,1H),6.82–6.74(m,2H),6.46(d,J＝3.7Hz,1H),6.09(s,2H),3.44(s,2H),3.13(t,J＝4.9Hz,4H),2.60(t,J＝5.0Hz,4H),2.36(s,3H),1.18(s,9H).

化合物28的合成：在50ml圆底烧瓶中加入化合物27(0.28g,0.5mmol)，用10ml甲醇溶解，在室温下搅拌5分钟。将NaOH溶液(0.4g氢氧化钠溶解在10ml纯化水中，取2ml)滴加到上述反应液中，继续搅拌反应5h。TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。调节溶液pH至中性，将反应液旋干，萃取，干燥，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/3，v/v)得到红棕色固体产物0.14g(28)，产率：63％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₃N₇O₃:446.1862[M+H]⁺；Found446.1940[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.71–11.08(m,1H),8.83(s,1H),7.69–7.33(m,2H),7.07(t,J＝8.0Hz,1H),6.98(dd,J＝3.5,2.2Hz,1H),6.81–6.67(m,2H),6.47(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),6.40(t,J＝2.2Hz,1H),6.35(dd,J＝7.9,2.2Hz,1H),6.06(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),5.27(s,2H),3.01(t,J＝5.0Hz,4H),2.44(d,J＝5.2Hz,4H),2.22(s,3H).

化合物29的合成：将化合物28(0.15g，0.33mmol)与钯碳(0.02g)溶解在10ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(0.02ml水合肼溶解在3ml异丙醇中)，反应1h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。冷却后过滤反应混合物，将滤液减压浓缩，得到产物94mg(29)，产率为69％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₅N₇O:416.2121[M+H]⁺；Found 416.2195[M+H]⁺。

化合物3的合成：将化合物29(0.05g，0.12mmol)溶解在30ml THF中，滴加DIEA(40μl，0.24mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当反应器内部温度到达-3℃的时候，滴加丙烯酰氯的THF溶液(20μl，0.24mmol)。过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱。旋干，加入100ml水和CH₂Cl₂(150ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)，得到红棕色产物32.2mg(化合物3)，产率为57％。化合物3的氢谱图如图5所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₆H₂₇N₇O₂:470.2226[M+H]⁺；Found470.2295[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.51(d,J＝2.3Hz,1H),10.46(s,1H),8.87(s,1H),7.75–7.56(m,2H),7.55–7.32(m,3H),7.10–6.89(m,2H),6.78–6.61(m,2H),6.48(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.35–6.13(m,2H),5.76(dd,J＝10.1,2.1Hz,1H),3.03(t,J＝5.0Hz,4H),2.56(t,J＝5.1Hz,4H),2.30(s,3H).

实施例6、本发明化合物4的合成

化合物4的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物30的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(50ml)，关键中间体2(化合物20)(0.404g,1mmol)，甲氧基中间体17(221mg，1mmol)。将上述反应溶液在室温下搅拌5-10分钟。在上述反应溶液中依次加入碳酸钾(276mg，2mmol)，Pd₂(dba)₃(18mg,0.02mmol)，XPhos(19mg，0.04mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/10，v/v)。待反应液冷却至室温，旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)得到红棕色固体产物0.44g(30)，产率：75％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₃₀H₃₅N₇O₆:590.2649[M+H]⁺；Found 590.2729[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.17–8.00(m,2H),7.68–7.53(m,2H),7.52–7.44(m,1H),7.07(d,J＝3.7Hz,1H),6.92–6.84(m,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,1H),6.46(d,J＝3.6Hz,1H),6.11(s,2H),3.81(s,3H),3.07(s,4H),2.68(s,4H),2.39(s,3H),1.17(s,9H).

化合物31的合成：在50ml圆底烧瓶中加入化合物30(0.48g，1mmol)，用10ml甲醇溶解，在室温下搅拌5分钟。将NaOH溶液(0.4g氢氧化钠溶解在10ml纯化水中，取4ml)滴加到上述反应液中，继续搅拌反应5h。TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。调节溶液pH至中性，将反应液旋干，萃取，干燥，浓缩。粗产物使用硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/3，v/v)得到红棕色固体产物0.27g(31)，产率：57％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₄H₂₅N₇O₄:476.1968[M+H]⁺；Found476.2046[M+H]⁺.¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.70–11.55(m,1H),8.92(s,1H),8.23–8.08(m,2H),7.87–7.68(m,2H),7.39–7.25(m,1H),7.18–7.00(m,2H),6.62(d,J＝8.6Hz,1H),6.38(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),3.64(s,3H),2.91(s,4H),2.61(s,4H),2.33(s,3H).

化合物32的合成：将化合物31(0.51g，1.07mmol)与钯碳(0.08g)溶解在30ml异丙醇中，混合加热回流，向回流液中滴加水合肼(0.5ml水合肼溶解在10ml异丙醇中)，反应1h，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。冷却后过滤反应混合物，将滤液减压浓缩，得到产物0.34g(32)，产率为71％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₄H₂₇N₇O₂:446.2226[M+H]⁺；Found 446.2304[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.46(d,J＝2.2Hz,1H),8.88(s,1H),7.78(t,J＝5.3Hz,1H),7.46(d,J＝2.3Hz,1H),7.22(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),7.08–6.96(m,2H),6.70(d,J＝8.7Hz,1H),6.49–6.26(m,3H),6.09(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),5.25(s,2H),3.66(s,3H),2.90(s,4H),2.55(s,3H),2.32–2.25(m,4H).

化合物4的合成：将化合物32(0.42g，0.943mmol)溶解在30ml THF中，滴加DIEA(312μl，1.89mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当低温反应器内部温度到达-3℃的时候，滴加丙烯酰氯的THF溶液(153μl，1.89mmol)，过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱，旋干，加入50ml水和CH₂Cl₂(50ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v),得到红棕色产物约0.254g(化合物4)，产率为54％。化合物4的氢谱图如图6所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₇H₂₉N₇O₃:500.2332[M+H]⁺；Found500.2415[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.56(d,J＝13.2Hz,1H),10.50–10.31(m,1H),8.94(d,J＝43.4Hz,1H),7.76–7.53(m,3H),7.48–7.32(m,2H),7.26–7.13(m,1H),7.09(dt,J＝9.6,2.8Hz,1H),6.98(dd,J＝8.1,2.4Hz,1H),6.64(dd,J＝8.9,4.5Hz,1H),6.45(dd,J＝17.0,10.0Hz,1H),6.35–6.19(m,2H),5.76(dd,J＝10.0,2.1Hz,1H),3.63(d,J＝4.7Hz,3H),2.86(s,4H),2.43(s,4H),2.21(s,3H).

实施例7、本发明化合物5和化合物6的合成

化合物5和化合物6的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物33的合成：将关键中间体2(化合物20)(0.68g，1.68mmol)溶解在30ml甲醇中。然后加入SnCl₂(1.57g，8.3mmol)和4滴浓盐酸。将反应混合溶液在65℃条件下回流加热。回流反应6h之后，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节溶液pH至中性偏碱，溶液变浑浊，将反应溶液旋干，然后用二氯甲烷萃取，得到白色的固体产物0.603g(33)，产率为96％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₁₈H₁₉ClN₄O₃:375.1146[M+H]⁺,397.1034[M+Na]⁺；Found 375.1220[M+H]⁺，397.1038[M+Na]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.57(d,J＝3.7Hz,1H),7.08(t,J＝8.0Hz,1H),6.55–6.48(m,2H),6.44–6.33(m,4H),6.14(s,2H),5.37(s,2H),1.09(s,9H).

化合物34的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(50ml)，化合物33(0.56g,1.5mmol)，4-(4-甲基哌嗪)-3-硝基苯胺(18)(0.35g，1.5mmol)，将上述反应混合物以360转/分钟的速度搅拌5-10分钟，在上述反应溶液中加入碳酸钾(0.69g,3mmol)，Pd₂(dba)₃(28mg,0.03mmol)，XPhos(29mg，0.06mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/10，v/v)。待反应液冷却至室温，旋干，萃取，干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)得到红棕色固体0.46g(34)，产率约53％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₉H₃₄N₈O₅:575.2652[M+H]⁺；Found 575.2730[M+H]⁺。

化合物35的合成：将化合物34(0.46g，0.8mmol)用10ml甲醇溶解，在室温下搅拌5分钟。将NaOH溶液(0.4g氢氧化钠溶解在10ml纯化水中，取4ml)滴加到反应器中，继续搅拌反应5h。TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。得到红棕色固体0.28g(35)，产率约为76％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₃H₂₄N₈O₃:461.1971[M+H]⁺；Found461.2041[M+H]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.81–11.32(m,1H),9.60–8.87(m,1H),8.31–8.05(m,1H),7.91–7.45(m,1H),7.29–6.90(m,3H),6.77–6.04(m,4H),5.26(d,J＝15.1Hz,1H),2.96–2.65(m,3H),2.37(dt,J＝26.1,4.8Hz,3H),2.19(d,J＝9.9Hz,2H)..

化合物5的合成：将化合物35(250mg，0.54mmol)，溶解在30ml THF中，滴加DIEA(178μl,1.08mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当反应器内部温度到达-3℃的时候，滴加丙烯酰氯的THF溶液(87μl，1.08mmol)；滴加过程中，温度保持在-5～0℃之间；过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱，旋干，加入100ml水和CH₂Cl₂(150ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)。该反应分两批进行，共得到产物0.42g(化合物5)，产率为76％。化合物5的氢谱图如图7所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₆H₂₆N₈O₄ 515.2077[M+H]⁺；Found 515.2156[M+H]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.90–11.39(m,1H),10.36(s,1H),9.42(d,J＝26.9Hz,1H),8.11(s,1H),7.82–7.61(m,2H),7.55(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.36(dt,J＝25.9,8.1Hz,1H),7.23–7.04(m,2H),6.99(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),6.43(ddd,J＝16.9,12.9,10.1Hz,1H),6.35–6.11(m,2H),5.77(td,J＝10.4,2.1Hz,1H),3.05–2.59(m,4H),2.45–2.25(m,4H),2.18(d,J＝7.7Hz,3H).

化合物6的合成：将化合物5(300mg，0.58mmol)溶解在30ml甲醇中。然后加入SnCl₂(600mg，3.16mmol)和10滴浓盐酸。将反应混合溶液在65℃条件下回流加热。回流反应6h之后，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝5/1)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至溶液呈中性。然后用二氯甲烷萃取，得到棕色的固体产物约140mg(化合物6)，产率为50％。化合物6的氢谱图如图8所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₆H₂₈N₈O₂485.2335[M+H]⁺；Found 485.2407[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.44(d,J＝27.0Hz,1H),10.32(s,1H),8.72(s,1H),7.75–7.53(m,3H),7.46–7.31(m,1H),7.06–6.94(m,2H),6.92–6.74(m,2H),6.69–6.62(m,1H),6.48–6.37(m,1H),6.29–6.11(m,2H),5.76(dt,J＝12.1,4.5Hz,1H),4.41(s,1H),4.22(t,J＝6.6Hz,1H),2.89–2.59(m,4H),2.23(d,J＝11.9Hz,3H),1.46–1.18(m,4H).

实施例8、本发明化合物7～9的合成

化合物7～9的合成路线如下：

具体制备方法如下：

化合物33的合成：将关键中间体2(化合物20)(6.06g，15mmol)溶解在150ml甲醇中。然后加入SnCl₂(14g，75mmol)和30滴浓盐酸。将反应混合溶液在65℃条件下回流加热。回流反应6h之后，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至溶液呈中性偏碱，溶液变浑浊，将反应溶液旋干，然后用二氯甲烷萃取，得到白色的固体产物5.43g(33)，产率为97％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₁₈H₁₉ClN₄O₃:375.1146[M+H]⁺，397.1034[M+Na]⁺；Found 375.1220[M+H]⁺，397.1038[M+Na]⁺.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.57(d,J＝3.7Hz,1H),7.08(t,J＝8.0Hz,1H),6.55–6.48(m,2H),6.44–6.33(m,4H),6.14(s,2H),5.37(s,2H),1.09(s,9H)..

化合物36的合成：将化合物33(5.61g，15mmol)，溶解在50ml THF中，滴加DIEA(4.96ml，30mmol)，将反应装置放置到低温反应器中。当反应器内部温度到达-3℃的时候，滴加丙烯酰氯的THF溶液(2.43ml，30mmol)。过夜反应，TLC监测表明反应完毕(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝10/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至中性偏碱，旋干，加入100ml水和CH₂Cl₂(150ml×3)萃取，合并有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/5，v/v)，得到产物白色固体(分两批进行)10.42g(36)。产率为81％。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₂₁H₂₁ClN₄O₄:451.1251[M+Na]⁺；Foun451.1140[M+Na]⁺。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.93(s,1H),7.74(s,1H),7.27(d,J＝3.7Hz,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.10(d,J＝8.7Hz,1H),6.83(d,J＝9.1Hz,1H),6.50(d,J＝3.7Hz,1H),6.29(d,J＝16.8Hz,1H),6.14–6.01(m,3H),5.60(d,J＝11.1Hz,1H),1.13(s,9H).

化合物7的合成：在圆底烧瓶中加入t-BuOH(100ml)，化合物36(4.7g,11mmol)，4-(4-甲基哌嗪)-3-硝基苯胺(18)(2.36g，10mmol)，将上述反应混合物以360转/分钟的速度搅拌5-10分钟，在上述反应溶液中加入碳酸钾(6.08g,44mmol)，Pd₂(dba)₃(500mg,0.55mmol)，XPhos(262mg，0.55mmol)，将反应混合液在110℃下回流搅拌反应约6h，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝100/10，v/v)，得到产物约3.5g(化合物7)，产率约为56％。化合物7的氢谱图如图9所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd for C₃₂H₃₆N₈O₆:629.2758[M+H]⁺，651.2656[M+Na]⁺；Found 629.2837[M+H]⁺，651.2679[M+Na]⁺。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.04(dd,J＝24.9,2.0Hz,1H),7.69(d,J＝6.6Hz,2H),7.24(d,J＝6.6Hz,3H),7.03–6.82(m,3H),6.42–6.26(m,2H),6.17(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),6.02(s,2H),5.66(dd,J＝10.1,1.4Hz,1H),2.91(t,J＝4.7Hz,4H),2.50(t,J＝4.7Hz,4H),2.28(d,J＝3.6Hz,3H),1.11(s,9H).

化合物8的合成：将化合物7(628mg，1mmol)溶解在乙醇和水的混合溶剂中(CH₃OH/H₂O＝3/1，v/v)。然后加入SnCl₂(94.8mg，5mmol)和两滴浓盐酸。将反应混合溶液在65℃条件下回流加热。回流反应6h之后，TLC监测反应结束(展开剂：CH₂Cl₂/CH₃OH＝5/1，v/v)。用饱和碳酸钠溶液调节pH至溶液呈中性。然后用二氯甲烷萃取，得到棕色的固体产物约323mg(化合物8)。产率约为54％。化合物8的氢谱图如图10所示。HRMS(ESI⁺)m/z:calcd forC₃₂H₃₈N₈O₄:599.3016[M+H]⁺；Found 599.3088[M+H]⁺。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.35(s,1H),9.05(d,J＝6.7Hz,1H),7.69–7.63(m,1H),7.62–7.58(m,1H),7.44(t,J＝8.1Hz,1H),7.22(t,J＝4.2Hz,1H),7.07–6.95(m,2H),6.86(d,J＝8.6Hz,1H),6.66(dd,J＝18.1,8.4Hz,1H),6.44(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),6.32(dd,J＝11.9,3.7Hz,1H),6.26(dd,J＝16.9,1.9Hz,1H),6.13(s,2H),5.77(dd,J＝10.2,2.0Hz,1H),4.44(s,2H),2.72(s,4H),2.24(s,3H),1.11(s,9H).

化合物9的合成：将180mg(0.3mmol)化合物8溶解在稀盐酸溶液中(125μl溶解在100ml水中，取50ml)，放置在-3℃条件下(低温反应器中)；将21mg(0.3m mol)的亚硝酸钠溶液(溶解在5ml水中)，滴加到上述混合溶液中，搅拌使之重氮化，将溶液温度保持在0-5℃，但不要让它上升到10℃以上；将250mg(1.5mmol)碘化钾溶解在5ml水中，加入上述溶液，并搅拌；在实验室温度下过夜反应；反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液调节溶液pH至中性偏碱，旋干。然后用二氯甲烷和水萃取。过柱子得到产物约60mg(化合物9)。产率为28.2％。化合物9的氢谱图如图11所示。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ7.66–7.56(m,2H),7.29(d,J＝3.6Hz,1H),7.13(d,J＝2.5Hz,1H),7.01(ddd,J＝20.5,8.0,2.4Hz,2H),6.96–6.88(m,1H),6.68(d,J＝8.3Hz,1H),6.50–6.35(m,2H),6.27(dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),6.11(s,2H),5.89–5.67(m,1H),4.27–4.02(m,2H),3.53(d,J＝11.3Hz,3H),3.19(d,J＝14.4Hz,4H),2.90(s,4H),1.12(s,9H).

以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、本发明化合物的抗癌活性

该试验例所述部分材料及试剂如表2所示，主要仪器如表3。

表2.部分实验材料与试剂

表3.主要仪器

1、试验方法

1.1 化合物溶液的配制

分别称取本发明化合物1～9，溶于1ml的二甲亚砜(DMSO)中，配制成10mM的药物溶液，分装后置于-20℃冰箱避光保存。实验前用相应的培养液稀释至所需浓度。

1.2 细胞培养实验

HBE细胞和BEAS-2B细胞为正常肺支气管上皮细胞系，用DMEM高糖培养基(补充10％胎牛血清及1％双抗)对HBE细胞、BEAS-2B细胞进行培养至生长对数期；H460细胞、A549细胞、H1975细胞和HCC827细胞为肺癌细胞系，用RPMI1640培养基(补充10％胎牛血清及1％双抗)对H460细胞、A549细胞、H1975细胞、HCC827细胞进行培养至对数期。其中，H1975细胞和HCC827细胞为EGFR突变型细胞。

1.3 细胞增殖抑制实验(Cell Counting Kit-8，CCK8法)

将细胞培养至生长密度的90％时，用0.25％胰蛋白酶将细胞消化，配制成单个细胞悬液，对细胞进行计数，以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积100μl。将培养板移入CO₂孵箱中，在37℃、5％CO₂条件下，孵育24h。将不同浓度的化合物加入每孔中，每个浓度5个复孔，化合物作用细胞48h。按操作手册每孔加入CCK8检测试剂，继续孵育1h，终止培养。选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸光度值，记录结果。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘图。并用Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)。每个实验至少重复3次。

1.4 细胞凋亡实验

细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染法检测。取对数生长期的各种不同的细胞，以1×10⁶个/孔的浓度将细胞均匀接种于6孔板内，每孔加2ml，孵育过夜，然后分别加入不同的化合物，每种化合物均设置不同的浓度。18h后，使用不含EDTA的0.25％胰蛋白酶收集细胞，PBS溶液洗2次。然后按照说明书使用细胞凋亡检测试剂盒对细胞染色，流式细胞仪检测分析。

1.5 细胞周期实验

取对数生长期的各种不同的细胞，以1×10⁶个/孔的浓度将细胞均匀接种于6孔板内，每孔加2ml，孵育过夜，然后分别加入不同的化合物，每种化合物均设置不同的浓度。18h后，收集细胞，并用PBS重悬，再离心去上清后逐滴加入0.5ml预冷的75％无水乙醇，涡旋以混匀细胞，4℃过夜。1000rpm/min，离心4min，弃上清。配置碘化丙啶染色液，分别取5.6ml染色缓冲液，210μl碘化丙啶染色液(25X)，56μl RNaseA(2.5mg/ml)。在每管细胞中加入0.4ml碘化丙啶染色液，重悬细胞，室温避光孵育30min。轻轻吹打混匀，过滤至流式管中，4℃避光保存样本，1h之内上流式细胞仪检测。

1.6 相关蛋白监测

1.6.1 细胞总蛋白的提取

(1)分别取对数生长期的各种细胞系细胞以3×10⁶个/孔的浓度将细胞均匀接种于6孔板内，培养24h；

(2)去培养上清，PBS洗涤细胞2次，加无血清培养基作用细胞1h。

(3)去培养上清，分别加入不同浓度各化合物，处理2h；

(4)去上清，用预冷的PBS洗两次，弃去上清液；

(5)每孔细胞加入100μl细胞裂解液，于冰上裂解10min，用细胞刮刮下细胞，将细胞裂解液转移至预冷的1.5ml EP管中，超声处理，然后12000rpm 4℃离心10min，小心吸取上清液，-20℃保存。

1.6.2 BCA法测定蛋白质浓度

(1)依次向96孔培养板中加入BSA标准品(0.5mg/ml)0，1，2，4，8，12，16，20μl，然后用预冷的PBS补足总体积至20μl；

(2)将待测样品稀释20倍，每孔20μl加入96孔板中；

(3)加入BCA工作液200μl/孔置于恒温箱中培养30min，冷却至室温；

(4)用酶标仪于562nm处测定各孔吸光度，用水较零；

(5)绘制蛋白标准曲线，并计算待测样品的蛋白浓度。

1.6.3 SDS-PAGE蛋白电泳

(1)配制浓度为12％的分离胶(见表4)

(2)向两块玻璃板中间注入分离胶，避免产生气泡，灌注分离胶至梳子下边缘1cm，轻柔加入双蒸水进行水封；

(3)配制浓度为5％浓缩胶(见表5)

(4)灌注好分离胶后，室温放置30min，待分离胶聚合完全，缓缓倒出上层的双蒸水，用滤纸条吸净残留的双蒸水；

(5)将浓缩胶迅速注入至玻璃板顶，***梳子以防产生气泡，室温静置30min后待用；

(6)取分装好的细胞总蛋白，加入5×上样缓冲液5μl，100℃水浴10min使蛋白变性，离心上样；

(7)于蛋白样品两侧孔中加入4μl预染蛋白marker；

(8)开启电泳仪，电泳分离出所需条带，可终止电泳。

表4. 12％分离胶配制(15ml)

表5. 5％的浓缩胶配制(4ml)

1.6.4 转膜

(1)将适当大小的PVDF膜浸泡于甲醇中约30s，之后转移至电转液；

(2)制作海绵垫-滤纸-分离胶-PVDF膜滤纸-海绵垫“三明治”，放入转膜槽中；

(3)倒入转移缓冲液，放入冷却装置；

(4)于恒流300mA的条件下转移100min。转膜结束后，将PVDF膜取出，标记正反面和标准分子量参照蛋白的位置。

1.6.5 封闭、一抗孵育、二抗孵育

(1)转膜成功的膜放入配置好的1×封闭液中，置于封闭液中室温封闭1h左右；

(2)将EGFR蛋白及其下流蛋白用1×一抗稀释液稀释，4℃孵育过夜，β-actin抗体作为内参；

(3)1×TBST洗膜3次，每次5min，1×二抗稀释液，室温孵育1h，最后用1×TBST洗膜3次，每次15min。

1.6.6 ECL显影

(1)ECL化学荧光发光液A和B按1:1的比例混合，混匀后待用；

(2)将混合好的ECL试剂加到PVDF膜上(1ml/10cm²)，化学发光得到条带；

(3)凝胶成像***拍照。

1.6.7 Western Blot法分析各种化合物对通路蛋白表达影响实验。

采用Western Blot法分析各种化合物对通路蛋白表达影响。

2、试验结果

2.1 CCK8法检测本发明化合物对不同肺癌细胞系的增殖抑制作用

本发明9个目标化合物选择不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol)用CCK8法测试对不同肺癌细胞的增殖抑制，以市售艾维替尼作为阳性对照物，对不同肺癌细胞活性进行评价，选择肺部正常细胞系和不同的肺癌细胞系进行实验，48h实验结果如表6和图12所示，从这一些化合物中筛选出抗癌细胞活性高的化合物，进一步研究化合物的抗肿瘤活性。

表6.本发明化合物对正常细胞和不同肺癌细胞系的抑制活性(IC₅₀/μM)

从实验结果可以看出，除了化合物9以外，其它化合物均具有一定的体外肿瘤细胞系的增殖抑制活性。

(1)与阳性对照市售艾维替尼相比，化合物1(实验室合成的艾维替尼)对人正常支气管上皮样细胞BEAS-2B细胞和HBE细胞的抑制活性，以及对不同的肺癌细胞(人大细胞肺癌细胞H460细胞，人肺腺癌细胞A549细胞，EGFR突变型细胞H1975细胞和HCC827细胞)的抑制活性和阳性对照基本保持一致。

(2)与化合物1相比，化合物2对人正常支气管上皮样细胞BEAS-2B细胞和HBE细胞的抑制活性，以及对不同的肺癌细胞(人大细胞肺癌细胞H460细胞，人肺腺癌细胞A549细胞，EGFR突变型细胞H1975细胞和HCC827细胞)的抑制活性和阳性对照基本保持一致。

(3)与化合物1相比，化合物3对人正常支气管上皮样细胞BEAS-2B细胞和HBE细胞的抑制活性，以及对不同的肺癌细胞(人大细胞肺癌细胞H460细胞，人肺腺癌细胞A549细胞和EGFR突变型细胞H1975细胞)的抑制活性，均更低，但对HCC827细胞的抑制活性则与化合物1相近，表现出化合物3对HCC827细胞的良好选择性。

(4)化合物4对不同细胞系的抑制效果与化合物3相似。

(5)化合物5对不同细胞系的抑制效果与化合物2相似。

(6)化合物6对不同细胞系的抑制效果与化合物3相似。

(7)化合物7对不同细胞系的抑制效果与化合物2相似。

(8)化合物8对HCC827细胞具有一定的抑制效果，对其它细胞系抑制效果相对较差。

(9)化合物9对不同的细胞系抑制效果相对其它几个化合物均较差。

综上，对不同的细胞系，化合物2，5，7表现出与艾维替尼相近的抑制效果，而化合物3、4、6则对EGFR突变型细胞HCC827细胞具有很强的靶向选择性。特别是：和阳性对照市售艾维替尼相比，化合物6对正常上皮细胞HBE细胞毒性小，选择系数超过490倍(对比HBE细胞和HCC827细胞的IC₅₀)。

2.2 化合物对EGFR磷酸化的抑制

免疫印迹分析证实本发明化合物5和6在H1975细胞中有效抑制EGFR-Tyr992磷酸化。除了抑制EGFR-Tyr992的磷酸化，这两个化合物还抑制了H1975细胞中参与癌细胞增殖和存活的下游两个重要靶点Akt和ERK1/2的磷酸化(图13和图14)。与EGFR磷酸化数据一致，这两个化合物对野生型EGFR细胞中Akt和ERK1/2磷酸化的抑制作用要弱得多。总的来说，从分子机理来看，EGFR磷酸化检测结果表明新合成的两个化合物对EGFR磷酸化的抑制和艾维替尼(图15)保持了一致，它抑制了EGFR T790M和其他敏感突变。

2.3 细胞凋亡测定

由于化合物对肿瘤细胞的良好抑制作用，以化合物5和6为代表，用流式进一步检测了其对细胞凋亡的诱导作用。结果如图16、图17、表7和表8所示。

实验分别选用了人肺癌细胞HCC827细胞和H1975细胞作为检测***，对照组为空白对照(DMSO)，化合物测试浓度为0.5μM和5μM，用化合物处理18h后，采用流式进行检测。在细胞凋亡结果图中，象限E1中的细胞为坏死细胞，象限E2为晚期凋亡细胞，象限E3区域中的细胞代表活细胞，象限E4中的细胞为早期凋亡细胞。从测试结果可以看出，化合物5和6对HCC827和H1975细胞均有一定的凋亡诱导作用。

表7.化合物5、化合物6和艾维替尼对HCC827细胞的凋亡影响

表8.化合物5、化合物6和艾维替尼对H1975细胞的凋亡影响

2.4 细胞周期测定

采用PI染法检测细胞周期，确定化合物5和6对HCC827细胞和H1975细胞的阻滞作用，从而进一步证明药物对细胞增殖的抑制。实验结果显示(图18、图19、表9和表10)，与对照组相比，化合物处理后的两种细胞在G0/G1期的比例均有明显增高。而相应的S期和G2/M期的细胞比例下降，这表明药物将癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。

表9.化合物5、化合物6和艾维替尼对HCC827细胞的周期影响

表10.化合物5、化合物6和艾维替尼对H1975细胞的周期影响

试验例2、本发明化合物的激酶抑制活性

根据相关文献，测试五种激酶(EGFR,EGFR-LT,EGFR-LTC,BTK,JAK3)的激酶抑制活性。备注：EGFR,EGFR-LT,EGFR-LTC:wild-type EGFR,L858R/T790M(EGFR-LT),or L858R/T790M/C797S(EGFR-LTC)mutant protein。分别测试10种化合物对不同激酶在相同浓度下的抑制率(EGFR-80Nm,EFFR-LT-2nM,EGFR-LTC-2nM,BTK-4nM,JAK3-1nM)和单个化合物对5种不同激酶的IC50值(化合物4，5和6)。

该试验例所述部分材料及试剂如表11所示。

表11.部分实验材料与试剂

1、Mobility shift assay检测实验

1.1 配制1倍激酶缓冲液和终止液

1)1倍激酶缓冲液

50mM HEPES,pH 7.5

0.0015％Brij-35

2)终止液

100mM HEPES,pH 7.5

0.015％Brij-35

0.2％Coating Reagent#3

50mM EDTA

1.2 化合物配制

1)化合物稀释

在化合物对不同激酶的IC₅₀测试中，浓度为10μM，配制成50倍浓度，即500μM。在96孔板上第一个孔中加入95μl的100％DMSO，再加入5μl10mM化合物溶液，即配制成500μM化合物溶液，在化合物的单浓度抑制率测试中，分别将10种化合物对应不同的激酶设置成不同的浓度(EGFR-80n M,EFFR-LT-2nM,EGFR-LTC-2nM,BTK-4nM,JAK3-1nM)。

2)转移5倍化合物到反应板

从配制好的测试的50倍浓度化合物中取10μl到一块96孔板中，加入90μl激酶缓冲液，配制成5倍浓度化合物。

从5倍浓度化合物96孔板中取出5μl到一块384孔反应板。例如，96孔板的A1孔转移到384孔板的A1和A2孔中，96孔板的A2孔转移到384孔板的A3和A4孔中，以此类推。

1.3 激酶反应与终止

1)将激酶加入1倍激酶缓冲液，形成2.5倍激酶溶液；

2)转移10μl上述2.5倍激酶溶液到384孔板反应板中，阴性对照孔加入1倍激酶缓冲液。室温下孵育10分钟；

3)将FAM标记的多肽和ATP加入1倍激酶缓冲液，形成2.5倍底物溶液；

4)转移10μl上述2.5倍底物溶液到384孔板反应板中；

5)28℃下孵育60分钟，向384孔板反应板中加30μl终止液终止反应，生化培养箱型号：SPX-100B-Z。

1.4 数据读取

CaliperEZ ReaderⅡ上读取转化率数据

1.5 数据计算

1)从CaliperEZ ReaderⅡ上复制转化率数据；

2)把转化率转化成抑制率数据

Percent inhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100

“min”为不加酶进行反应的对照样孔读数；“max”为加入DMSO作为对照孔读数

3)用XLFit excel add-in version 5.4.0.8拟合IC50值

拟合公式:Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+(IC50/X)^HillSlope)

2、Lantha Screen Assay检测反应

2.1 配制1倍激酶缓冲液

1倍激酶缓冲液

50mM HEPES,pH 7.5

0.0015％Brij-35

2.2 化合物配制

1)化合物的检测起始浓度为10μM，配置成100倍浓度，即1000μM。在96孔板上第一个孔中加入90μl的100％DMSO，再加入10μl 10mM化合物溶液，即配制成1000μM化合物溶液。转移50μl上述配制的100μM化合物溶液到384孔Echo板中；

2)转移50μl 100％DMSO到两个空的孔中作为不加化合物和不加酶的对照；

3)使用Echo 550转移100nl化合物到384孔测试板中。

2.3 激酶反应与终止

1)将EGFR(T790M,C797S,L858R)加入1倍激酶缓冲液，形成2倍的激酶溶液；

2)转移5μl上述2倍激酶溶液到384孔板反应孔中，阴性对照孔加入1倍激酶缓冲液。室温下孵育10分钟；

3)将Fluorescein-PolyGT和ATP加入1倍激酶缓冲液，形成2倍底物溶液；

4)转移5μl的2倍底物溶液到384孔板反应板中；

5)室温下孵育30分钟；

6)配制2倍的抗体和EDTA混合液，在384孔反应板中加入10μl上述混合液终止反应；

7)常温放置60分钟。

2.4 数据读取

Envision2014 Multilable Reader上读取在340nm处激发，520nm和495nm处发射的数值。

2.5 数据计算

1)复制荧光读数的数值比(Lantha signal(520nm/495nm))

2)将上述数据通过公式转换为抑制百分率

Percent inhibition＝(max-Lantha signal)/(max-min)*100

“min”为不加酶进行反应的对照样孔读数；“max”为加入DMSO作为对照孔读数

3)将数据导入MS Excel，IC50结果使用XLFit excel add-in version 5.4.0.8进行曲线拟合

拟合公式:Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+(IC50/X)^HillSlope)

3、实验结果

表12.化合物4,5,6对不同激酶的抑制活性(IC₅₀/nM)

表13.系列化合物对EGFR的单浓度抑制活性(80nM)

表14.系列化合物对EGFR T790M L858R的单浓度抑制活性(2nM)

表15.系列化合物对EGFR(T790M,C797S,L858R)的单浓度抑制活性(2nM)

表16.系列化合物对BTK的单浓度抑制活性(4nM)

表17.系列化合物对JAK3的单浓度抑制活性(1nM)

从上述结果可以看出，化合物4，5，6对EGFR L858R/T790M双突变的IC50值分别为3.1nM、2.7nM、3.4nM；比野生型EGFR(IC50值分别为217nM、145nM、64nM)的抑制活性分别高70倍，54倍，18倍，显示出该系列化合物对突变型EGFR具有良好的抑制活性和选择性。

综上，本发明化合物对正常细胞毒性低，对肺癌细胞系具有明显的抑制效果，特别是对于EGFR突变型细胞HCC827细胞具有良好的选择性，抑制效果显著；本发明化合物可以诱导EGFR突变型细胞H1975细胞和HCC827细胞的凋亡，同时将这两种细胞的周期阻滞在了G0/G1期。同时，本发明化合物可以有效抑制EGFR的磷酸化，以及H1975细胞中参与癌细胞增殖和存活的通路下游的两个重要激酶Akt和ERK1/2的磷酸化。此外，本发明化合物对突变型EGFR具有良好的抑制活性和选择性。本发明化合物能够用于制备治疗肺癌，特别是非小细胞肺癌的药物，其对于EGFR突变型肺癌具有较强的抑制作用，且毒性较小；本发明还能用于制备酪氨酸激酶抑制剂，特别是EGFR磷酸化抑制剂，具有良好的应用前景。

Claims (3)

1.一种化合物、或其盐，其特征在于：所述化合物为如下化合物之一：

2.权利要求1所述的化合物、或其盐在制备治疗EGFR突变型非小细胞肺癌的药物中的用途。

3.一种药物，它是由权利要求1所述的化合物、或其盐为活性成分，加上药物上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

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