CN111848597A - 一种异噁唑啉类化合物异构体及其制备方法 - Google Patents

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CN111848597A CN201910353139.7A CN201910353139A CN111848597A CN 111848597 A CN111848597 A CN 111848597A CN 201910353139 A CN201910353139 A CN 201910353139A CN 111848597 A CN111848597 A CN 111848597A
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Abstract

本发明的具体实施方式提供一种异噁唑啉类化合物异构体、制备方法、其单晶及制备方法、及其杀菌组合物，本发明的具体实施方式首次成功获得了异噁唑啉类化合物异构体，进一步，成功制备了不同异构体的单晶，从而成功对不同异构体的结构和立体构型进行了表征和识别，更进一步，通过研究，发明了其中一种异构体为高活性杀菌剂。

Description

一种异噁唑啉类化合物异构体及其制备方法
技术领域
本发明属于有机合成领域，具体涉及一种异噁唑啉类化合物异构体、制备方法、其单晶及制备方法、及其杀菌组合物。
背景技术
异噁唑啉类化合物可在农业上用作杀菌剂。例如，异噁唑啉类化合物可用于防治下列病害：玉米和大麦的长尾孢属病害，小麦和大麦白粉病，小麦叶锈病和杆锈病，小麦颖枯病，大麦条锈病，大麦叶锈病，马铃薯早疫病，马铃薯晚疫病，花生叶斑病，葡萄白粉病，葡萄黑腐病，苹果黑星病，苹果白粉病，黄瓜白粉病，黄瓜炭疽病，水果褐腐病，灰霉病，豆类白粉病，水稻纹枯病，水稻稻瘟病，等等。因此，异噁唑啉类化合物可用于谷物的贮藏，可作为杀菌剂应用于小麦、大麦、水稻、花生、豆类、葡萄和其他水果、坚果、蔬菜田和草坪中，以防治病害。
在已有研究中，如CN1091444C和CN105085502A对其有相关研究公开，但是其公开仅是涉及到其顺式异构对映体和反式异构对映体的混合物及不同纯度含量的杀菌效果的报道。
发明内容
本发明具体实施方式的首次成功提供一种异噁唑啉类化合物的手性单体，具体方案如下：
一种异噁唑啉类化合物异构体，具有下式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的任意一个：
Figure BDA0002044110100000021
其中，R1、R3各自独立地为甲基或乙基，R2选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子或氰基中的一种，R4选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子、氰基或氢原子中的一种，X为碳原子或氮原子。
可选的，所述R1、R3分别为甲基，R2为对位取代，R4为氢原子，X为氮原子。
可选的，所述R2为氯原子。
一种上述异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，其特征在于，所述异构体由所述异噁唑啉类化合物的消旋化合物通过高效液相色谱手性分离制备获得，分离条件为：色谱柱为键合型色谱柱，流动相为含有0.01～10wt％乙酸的甲醇水混合液，流量0.1～10.0ml/min，柱温0～50℃，检测波长180～380nm。
可选的，所述色谱柱为大赛璐色谱柱CHIRALPAK IG。
可选的，所述流动相为含有0.1～0.5wt％乙酸的甲醇水溶液。
可选的，所述检测波长为210～230nm。
一种所述异噁唑啉类化合物异构体形成的单晶。
一种所述异噁唑啉类化合物异构体的单晶的制备方法，利用该化合物异构体在不同溶剂中的溶解特性，以及结晶体的表观热力学行为，制备所述单晶。
可选的，所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、石油醚，或其混合物。
一种植物杀菌组合物，包括下式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体：
Figure BDA0002044110100000031
与现有技术相比，本发明具体实施方式首次成功获得了异噁唑啉类化合物手性单体，进一步，成功制备获得不同异构体的单晶，从而成功对不同异构体的结构和立体构型进行了表征和识别，更进一步，通过研究，发现式(1)的异构体对灰葡萄孢、核盘菌、链核盘菌的菌丝生长抑制作用和孢子萌发抑制作用远远超过其它异构体。
附图说明
图1实施例1测得的分离前5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉高效液相色谱图；
图2实施例1测得的分离后5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉各异构体高效液相色谱图；
图3实施例2测得的5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉各异构体单晶X衍射谱图。
具体实施方式
本发明的具体实施方式提供一种异噁唑啉类化合物异构体，具有下式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的任意一个：
Figure BDA0002044110100000041
其中，R1、R3各自独立地为甲基或乙基，R2选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子或氰基中的一种，R4选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子、氰基或氢原子中的一种，X为碳原子或氮原子。
本发明的具体实施方式中，所述(C1-C3)烷基是指含有1个到3个碳的烷基，具体例如甲基、乙基、丙基或异丙基，所述(C1-C3)烷氧基是指含有1个到3个碳的烷氧基，具体例如甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基，所述卤代是指氟、氯、溴或碘的一取代或多取代，所述卤素原子是指氟、氯、溴或碘原子。
本发明的具体实施方式中，所述R2或R4的可以为对应苯环上邻位、间位或对位上的取代。
下表1中列出了本发明式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的部分典型化合物，但本发明并不限于以下的结构。
表1
编号 R<sub>1</sub> R<sub>2</sub> R<sub>3</sub> R<sub>4</sub> X
1 CH<sub>3</sub> 3-Cl CH<sub>3</sub> H C
2 CH<sub>3</sub> 4-Cl CH<sub>3</sub> H C
3 CH<sub>3</sub> 3-CH<sub>3</sub>O CH<sub>3</sub> 3-Cl C
4 CH<sub>3</sub> 3-CH<sub>3</sub>O CH<sub>3</sub> 4-Cl C
5 CH<sub>3</sub> 4-Cl CH<sub>3</sub> H N
6 CH<sub>3</sub> 3-CH<sub>3</sub>O CH<sub>3</sub> H N
7 C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> 2-Cl CH<sub>3</sub> H N
8 C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> 3-Cl CH<sub>3</sub> H N
9 C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> 4-Cl CH<sub>3</sub> H N
10 CH<sub>3</sub> 4-Br CH<sub>3</sub> H N
11 C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> 4-Cl C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> H N
12 CH<sub>3</sub> 4-Cl C<sub>2</sub>H<sub>5</sub> H N
本发明的具体实施方式中，还提供一种上述式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的任意一个异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，所述异噁唑啉类化合物的消旋化合物通过高效液相色谱手性分离制备获得，分离条件为：色谱柱为键合型色谱柱，流动相为含有0.01～10wt％乙酸的甲醇水混合液，流动相使用含有乙酸的甲醇水混合溶液相比于甲醇水混合溶液，使所述异构体能够有效分离，流量0.1～10.0ml/min，柱温0～50℃，检测波长180～380nm；进一步优选为所述色谱柱为大赛璐色谱柱CHIRALPAK IG，流动相为含有0.1～0.5wt％乙酸的甲醇水溶液，具体如含有0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％或0.5wt％乙酸的甲醇水溶液，其中甲醇和水的体积比为50:50～90:10，具体可以为50:50、60:40、70:30、80:20或90:10等等；流量为0.5～1.5ml/min，具体可以为0.5ml/min、1.0ml/min或1.5ml/min等等；柱温30～40℃，具体可以为30℃、35℃或40℃等等；检测波长210～230nm，具体可以为210nm、220nm或230nm等等，当检测波长在220nm左右时，所述异噁唑啉类化合物具有较强的吸收。对于所述所述异噁唑啉类化合物的消旋化合物，可以是购买的，也可以是按照现有技术(如中国专利ZL99113093.6)的方法制备而成。
本发明的具体实施方式中，还提供一种上述式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的任意一个异噁唑啉类化合物异构体的单晶及其制备方法，本申请人通过研究发现，利用该化合物异构体在不同溶剂中的溶解特性，以及结晶体的表观热力学行为，可以选取合适的溶剂体系，成功制得上述式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的四个异构体的单晶，具体的包括以下步骤：将所述异构体化合物溶于溶剂中，形成溶液，根据晶体的溶解性设置溶剂组成和结晶温度。作为举例，具体方法如下：称取所述式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构固体于玻璃瓶中，加入二氯甲烷或乙酸乙酯将样品溶解后，加入到石油醚或石油醚与乙酸乙酯/二氯甲烷的混合溶剂中，室温条件下结晶，待晶体成长后过滤，得到无色晶体，自然干燥后，得到单晶。
本发明的具体实施方式中还提供一种植物杀菌组合物，其中，包括前述式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体，本申请的发明人通过研究发现，与其它异构体相比，下式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体具有特别优异的抑菌作用和治疗活性。
Figure BDA0002044110100000061
本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物，可以和其它已知的杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂或肥料等一起混合使用。
本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物，特别适合在农业上用作杀菌剂，例如，可用于防治下列病害：玉米和大麦的长尾孢属病害，小麦和大麦白粉病，小麦叶锈病和杆锈病，小麦颖枯病，大麦条锈病，大麦叶锈病，马铃薯早疫病，马铃薯晚疫病，花生叶斑病，葡萄白粉病，葡萄黑腐病，苹果黑星病，苹果白粉病，黄瓜白粉病，黄瓜炭疽病，水果褐腐病，灰霉病，霜霉病，豆类白粉病，水稻纹枯病，水稻稻瘟病，等等；尤其是可用于谷物的贮藏，以及用于防治小麦、大麦、水稻、花生、豆类、葡萄等水果、坚果、蔬菜田和草坪中的病害。
本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物，可以以不同的方式施用，根据作物及病害的不同，可以采用茎叶喷雾、种子处理、土壤处理等方式来施用。所述式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体的稀释浓度(即，与载体的配比)和使用量取决于所应用的设备、施用方法、天气条件、待处理的作物和欲防治的病害等因素。
本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物可以单独使用，也可以和其他已知的杀菌剂、杀虫剂、除草剂、植物生长剂(如植物生长调节剂、植物营养素)或土壤调节剂(如肥料)等附加成分一起混合使用。因此，本发明的农药组合物还可以包含上述这些附加成分中的任意一种或多种。作为其他杀菌剂，例如可以列举菌核净、腐霉利、氯苯咯菌胺、异菌脲、乙烯菌核利、菌核利、乙菌利、甲菌利、乙霉威、甲基硫菌灵、硫菌灵、磺菌威等；还可以列举嘧菌酯、肟菌酯、二甲苯氧菌胺(SSF-129)、咯菌腈、氟喹唑、环菌唑、灭菌唑、嘧菌胺、嘧霉胺、环酰菌胺、环啶菌胺、福美双、啶菌恶唑、啶酰菌胺、丙硫菌唑、氰烯菌酯、吡唑醚菌酯等。
本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物可以通过本领域的常规方法制备而成。如上所述，所述杀菌组合物包含式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体、以及农业上适合的载体，根据情况，还可以包含其他可选的成分。在本文中，“农业上适合的载体”具有本领域的一般含义，所述载体是指具有乳化作用、分散作用和/或稀释作用但不损害活性组分效果并对土壤、设备、作物和农业环境无影响的成分。例如，载体可以为农业上适用的稀释剂、分散剂等，其形态可以为固体，也可以为液体。根据农药组合物剂型的不同，还可添加助剂，例如表面活性剂、稳定剂、消泡剂、抗沉降剂、粘合剂(如聚丙烯醇，用于改善在作物上的附着性能)等。
根据需要，本发明具体实施方式的所述植物杀菌组合物可以为各种合适的剂型，例如水溶液、水分散液、油溶液、油分散液、糊剂、粉剂、可湿性粉剂、浓乳剂、颗粒剂、引诱剂、油雾剂等。可湿性粉剂、浓乳剂、糊剂以高浓度配制并在使用前用水稀释。在制备引诱剂时，通常还需加入食物或其他吸引昆虫的成分。在制备茎叶喷洒制剂时，通常还需要加入助剂例如润湿剂、展着剂、分散剂、粘合剂或增稠剂来改善使用效果。常用的助剂及使用方法在许多文献中都有描述，例如《洗涤剂和乳化剂手册》。
为制备乳剂，可先将本发明具体实施方式的式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体溶于合适的溶剂，例如丙酮、甲醇、乙醇或二甲基甲酰胺中再用水稀释，其浓度可在1～90％的范围内，更适宜的浓度为5～50％。
为制备浓乳剂，可先将本发明具体实施方式的式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物溶于一种溶剂或混合溶剂中，再加入乳化剂来增强该化合物在水中的分散效果。浓乳剂中活性物通常在10～90％的范围内。在可流动浓乳剂中活性物可达到75％。
为制备适于喷洒的可湿性粉剂，可将将本发明具体实施方式的式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物与研细的固体粉末如粘土、无机硅酸盐、碳酸盐以及润湿剂、粘合剂和/或分散剂掺混而形成混合物。活性物的量通常在20～99％的范围内，更适宜的在45～75％的范围内。例如，典型的50％可湿粉剂由50重量份本发明所述化合物、45重量份硅酸盐和5份木质素硫酸钠组成。
粉剂可由将本发明具体实施方式的式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物与研细的惰性固体粉末混合而成。适宜的固体粉末例如为植物粉、硅酸盐、碳酸盐或粘土。粉剂中活性物含量通常在20～80％的范围内，随后稀释至1～10％的使用浓度。
实施例
实施例1 5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉对应异构体的制备
5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉(按ZL99113093.6中的实施例1方法制备)，所述5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉在如下测试条件下HPLC测定：测试条件，色谱柱为大赛璐色谱柱CHIRALPAK IG0.46cm I.D.×15cm L，流动相为含有0.02wt％乙酸的甲醇水混合液(甲醇与水的体积比为80:20)，流量1.0ml/min，柱温35℃，溶剂为甲醇，检测波长200nm,测得的HPLC谱图如图1。如图1，有4个峰，分别为5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉的4个异构体出峰位置，从左到右依次记为：异构体1、异构体2、异构体3和异构体4。
将所述5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基-3-(3-吡啶基)异噁唑啉，采用高效液相色谱(HPLC)手性分离，其中，色谱柱为大赛璐色谱柱CHIRALPAK IG0.46cmI.D.×15cm L，流动相为含有0.02wt％乙酸的甲醇水混合液(甲醇与水的体积比为80:20)，流量1.0ml/min，柱温35℃，溶剂为甲醇，检测波长200nm，分别获得异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的粉末。将所述异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的粉末进行同上的HPLC测定，获得如图2的HPLC谱图，从图2可以看出异构体1、异构体2、异构体3和异构体4成功分离。
实施例2单晶制备
分别将实施例1制备获得的异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的粉末，称取0.3g于玻璃小瓶中，加入5mL二氯甲烷，在室温下将样品溶解。加入5mL二氯甲烷和石油醚混合溶剂，体积比为1:1，在25-30℃下结晶120小时，析出晶体并长大，过滤，得到无色晶体，干燥后，分别获得异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的单晶，分别对该四个异构体的粉末和单晶进行DSC测试，表征其热力学行为，结果如下表1-1。分别对该四个异构体的单晶进行X衍射测试分别获得异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的衍射谱图如图3所示。对异构体1的单晶衍射测试结果进行结构解析，下表1-2、表1-3分别提供了异构体1的键长和键角。如下表1-1，四个异构体的熔点不同，四个单晶的熔点和相变热均高于混合结晶；异构体1和异构体2的熔点相近，异构体3和异构体4的熔点相近。但异构体1，2和异构体3，4的熔点差别较大。如图3，根据R-S命名规则可以确定构体1、异构体2、异构体3和异构体4为对应的以下结构。
Figure BDA0002044110100000091
DSC测试：DSC-1(仪器型号)，以5℃/min的升温速率升温至350℃。
X衍射测试：室温下，检测仪：RigakuSupernova diffractometer(50kV,0.8mA,MoKαgraphitemonochromated radiation,
Figure BDA0002044110100000101
。
表1-1实施例1和实施例2四个异构体混合结晶和单晶的DSC测试结果
样品名称 熔融起始温度/℃ 熔融峰值温度/℃ 放热量(J/g)
异构体1单晶 49.11 53.11 92.16
异构体1混合结晶 46.63 50.70 77.81
异构体2单晶 48.76 52.58 82.71
异构体2混合结晶 45.69 50.22 76.35
异构体3单晶 88.07 90.52 96.94
异构体3混合结晶 78.27 82.97 70.37
异构体4单晶 85.46 88.17 91.37
异构体4混合结晶 73.46 80.14 54.82
表1-2异构体1单晶的键长
Figure BDA0002044110100000102
表1-3异构体1单晶的键角
Figure BDA0002044110100000111
对比例2
与实施例2同样的方法，将其溶剂一和溶剂二分别替换为同一溶剂丙酮、石油醚、或二氯甲烷进行单晶培养，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的粉末，均未得到对应的单晶。
实施例3生物活性实验
将实施例1的异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的粉末分别对灰葡萄孢、核盘菌、链核盘菌的菌丝生长抑制作用和孢子萌发抑制作用，对灰霉病的1天保护活性、对灰霉病的1天治疗活性、对灰霉病的内吸活性测试。菌丝生长抑制作用测试
供试样品异构体1的处理浓度设为1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0.0156μg/ml、0.0039μg/ml、0.0001μg/ml，异构体2、异构体3、异构体4的处理浓度设为3200μg/ml、800μg/ml、200μg/ml、50μg/ml、12.5μg/ml、3.125μg/ml，另设无菌水作为空白对照；试验采用生长速率法，即将熔好的PDA培养基冷却至60℃-70℃，按所设浓度加入定量药剂，制成含有不同浓度药液的含毒平板，待其充分冷却后，接种直径5mm的供试病原菌菌片，每处理3次重复。处理后的平板置于培养箱中培养(25℃±1℃)，4d后进行调查。调查时，分别测量每个处理的供试病原菌菌落直径，依下式计算抑菌率，根据各药剂浓度对数值及对应的相对抑制率的几率值作回归分析，计算各药剂的毒力回归方程、EC50及相关参数。
Figure BDA0002044110100000121
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对灰葡萄孢菌丝生长的半数致死浓度EC50值分别为0.1406μg/ml、579.3825μg/ml、982.3069μg/ml、1186.3414μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表2。
表2各异构体对灰葡萄孢菌丝生长抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝5.5338+0.6266X 0.1406 0.9842 0.0913-0.2165
异构体2 Y＝3.3098+0.6118X 579.3825 0.9837 365.1714-919.2510
异构体3 Y＝2.9766+0.6762X 982.3069 0.9945 727.5455-1326.277
异构体4 Y＝2.7270+0.7394X 1186.3414 0.9972 947.3211-1485.6694
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对核盘菌菌丝生长的半数致死浓度EC50值分别为0.0116μg/ml、104.3266μg/ml、171.0176μg/ml、196.2868μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表3。
表3各异构体对核盘菌菌丝生长抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝6.6715+0.8643X 0.0116 0.9889 0.0083-0.0163
异构体2 Y＝3.7206+0.6339X 104.3266 0.9994 95.9714-113.4092
异构体3 Y＝3.503+0.6704X 171.0176 0.9970 139.4559-209.7224
异构体4 Y＝3.4057+0.6953X 196.2868 0.9963 155.4855-247.7948
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对链核盘菌菌丝生长的半数致死浓度EC50值分别为0.0274μg/ml、236.5721μg/ml、292.1567μg/ml、381.7585μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表4。
表4各异构体对链核盘菌菌丝生长抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝6.4536+0.9304X 0.0274 0.9917 0.0196-0.0383
异构体2 Y＝3.5646+0.6046X 236.5721 0.9963 152.2880-367.5036
异构体3 Y＝3.4542+0.6269X 292.1567 0.9968 189.3666-450.7423
异构体4 Y＝3.3449+0.6410X 381.7585 0.9971 245.3566-593.9909
孢子萌发抑制作用测试
供试样品异构体1的处理浓度设为16μg/ml、4μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0.0156μg/ml、0.0039μg/ml，异构体2、异构体3和异构体4的处理浓度设为1600μg/ml、400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml，另设溶剂作为空白对照；试验采用孢子萌发，即按所设浓度，在96孔细胞培养板的微孔中加入定量药剂，制成含有不同浓度药液的含毒平板，然后接种病原菌孢子悬浮液(5-8×104个/ml)，每处理4次重复。处理后的平板置于培养箱中培养(22℃±1℃)。当空白对照孢子萌发率达到90％以上时，检查各处理孢子萌发情况。每处理各重复随机调查3个视野(孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发)，分别记录萌数和孢子总数。依下式计算抑菌率，根据各药剂浓度对数值及对应的孢子萌发相对抑制率的几率值作回归分析，计算各药剂的毒力回归方程、EC50及相关参数。
Figure BDA0002044110100000131
Figure BDA0002044110100000132
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对灰葡萄孢孢子萌发的半数致死浓度EC50值分别为0.0862μg/ml、117.2724μg/ml、174.2043μg/ml、238.4008μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表5。
表5各异构体对灰葡萄孢孢子萌发抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝5.7272+0.6833X 0.0862 0.9890 0.0578-0.1286
异构体2 Y＝3.6203+0.6667X 117.2724 0.9936 78.3613-175.5051
异构体3 Y＝3.4791+0.6786X 174.2043 0.9929 115.1400-263.5673
异构体4 Y＝3.3399+0.6982X 238.4008 0.9991 155.1674-366.2813
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对核盘菌孢子萌发的半数致死浓度EC50值分别为0.0076μg/ml、91.0908μg/ml、147.4859μg/ml、174.7169μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表6。
表6各异构体对核盘菌孢子萌发抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝6.8667+0.8825X 0.0076 0.9819 0.0054-0.0107
异构体2 Y＝3.5777+0.7258X 91.0908 0.9911 62.7251-132.2839
异构体3 Y＝3.5030+0.6902X 147.4859 0.9873 98.9704-219.7838
异构体4 Y＝3.5543+0.6447X 174.7169 0.9815 113.1990-269.6668
测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对核盘菌孢子萌发的半数致死浓度EC50值分别为0.0656μg/ml、101.1219μg/ml、162.7285μg/ml、218.1402μg/ml；其中，异构体1的半数致死浓度明显低于其它被测样品，结果见表7。
表7各异构体对链核盘菌孢子萌发抑制作用
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝5.8342+0.7052X 0.0656 0.9955 0.0447-0.0961
异构体2 Y＝3.5453+0.7255X 101.1219 0.9939 69.6590-146.7956
异构体3 Y＝3.4248+0.7122X 162.7285 0.9932 109.8451-241.0718
异构体4 Y＝3.2389+0.7530X 218.1402 0.9930 146.8909-323.9489
保护活性测试
供试样品异构体1的处理浓度设为50μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml，异构体2、异构体3和异构体4的处理浓度设为1200μg/ml、1000μg/ml、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml，另设清水作为空白对照；选择生长一致的盆栽二出复叶平展期大豆幼苗，按上面所设浓度采用作物喷雾机进行茎叶喷雾处理，每处理4次重复。喷雾器类型为立体作物喷雾机，喷雾压力为1.5kg/cm2，喷液量约为675L/hm2。处理后的上述试验材料自然阴干，24小时后接种病原菌。采用接种器将灰葡萄孢孢子悬浮液(5-8×106个/ml)喷雾于寄主作物上，然后移入人工气候室培养(22±2℃，RH>90，无光照)，4天后调查样品的防治效果。调查时，根据空白对照的发病情况，调查供试样品的叶片发病程度。病情分级方法如下：
0级：无病斑；
1级：单叶片有病斑3个；
3级：单叶片有病斑4-6个；
5级：单叶片有病斑7-10个；
7级：单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；
9级：单叶片有病斑密集占叶面积四分之一以上。
根据下式计算病情指数和防治效果，求出药剂的毒力回归方程及EC90及相关参数。
Figure BDA0002044110100000151
Figure BDA0002044110100000152
活体苗测试结果表明，异构体1、异构体2、异构体3和异构体4对灰霉病的1天保护活性EC50值分别为13.2911μg/ml、420.0580μg/ml、672.2217μg/ml、709.3989μg/ml；其中，异构体体1的1天保护活性明显高于其它被测样品，结果见表8。
表8各异构体对灰霉病的保护活性
药剂 回归方程 EC<sub>50</sub>(μg/ml) 相关系数 95％置信区
异构体1 Y＝0.1288+4.3354X 13.2911 0.9919 12.0524-14.6572
异构体2 Y＝-3.5593+3.2780X 420.0580 0.9809 382.1594-461.7151
异构体3 Y＝-7.7601+4.5128X 672.2217 0.9820 630.0372-717.2308
异构体4 Y＝-8.2906+4.6619X 709.3989 0.9849 667.4075-0.9849
治疗活性测试
采用接种器将灰葡萄孢孢子悬浮液(5-8×106个/ml)喷雾于生长一致的盆栽二出复叶平展期大豆幼苗上，然后移入人工气候室培养(22±2℃，RH>90，无光照)，24小时后，移出人工气候室，自然阴干。供试样品异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的处理浓度设为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，另设清水作为空白对照；按上面所设浓度，采用作物喷雾机对上述已接种的材料进行茎叶喷雾处理(喷雾机设置同3.3)，每处理4次重复。处理后的上述试验材料自然阴干后，重新移入人工气候室，继续培养，3天后，调查样品的治疗活性。调查时，根据空白对照的发病情况，调查供试样品的叶片发病程度。治疗活性评价标准如下：
-：相对于空白对照，治疗效果低于5％；
+：相对于空白对照，治疗效果在6-14％；
++：相对于空白对照，治疗效果在15-29％；
+++：相对于空白对照，治疗效果在30-49％；
++++：相对于空白对照，治疗效果大于50％。
测试结果表明，在25-200μg/ml浓度下，被测样品异构体1的1天治疗活性优于异构体2、异构体3和异构体4被测样品异构体1的1天治疗活性优于其它供试样品，结果见表9。
表9各异构体对灰霉病的治疗活性
Figure BDA0002044110100000161
注：-：相对于空白对照，治疗效果低于5％；+：相对于空白对照，治疗效果在6-14％；++：相对于空白对照，治疗效果在15-29％；+++：相对于空白对照，治疗效果在30-49％；++++：相对于空白对照，治疗效果大于50％。
内吸活性测试
供试样品异构体1、异构体2、异构体3和异构体4的处理剂量设为0.4μg/叶、0.2μg/叶、0.1μg/叶，另设清水作为空白对照；选择温室内生长整齐一致盆栽韭菜苗作为寄主，在叶片上进行定点滴药处理，每处理4次重复。处理后的上述试验材料自然阴干，24小时后接种病原菌。采用接种器将灰葡萄孢孢子悬浮液(5-8×106个/ml)喷雾于寄主作物上，然后移入人工气候室培养(22±2℃，RH>90，无光照)，4天后调查样品的内吸活性。调查时，根据空白对照的发病情况，调查供试样品的叶片发病程度。内吸活性评价标准如下：
-：相对于空白对照，防治效果低于5％；
+：相对于空白对照，防治效果在6-14％；
++：相对于空白对照，防治效果在15-29％；
+++：相对于空白对照，防治效果在30-49％；
++++：相对于空白对照，防治效果大于50％。
测试结果表明，在0.4μg/叶剂量下，被测样品异构体1的内吸活性优于异构体2、异构体3和异构体4；在0.1-0.2μg/叶剂量下，被测样品异构体1的内吸活性优于其它供试样品，结果见表10。
表10各构体对灰霉病的内吸活性
Figure BDA0002044110100000171
注：-：相对于空白对照，防治效果低于5％；+：相对于空白对照，防治效果在6-14％；++：相对于空白对照，防治效果在15-29％；+++：相对于空白对照，防治效果在30-49％；++++：相对于空白对照，防治效果大于50％。
测试样品异构体1对上述三种病原菌的菌丝生长抑制作用和孢子萌发抑制作用显明优于其它测试样品及对照药剂；对灰霉病的1天保护活性明显高于其它测试样品及对照药剂；对灰霉病的的1天治疗活性明显优于其它测试样品；对灰霉病的内吸活性优于其它测试样品。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (11)

1.一种异噁唑啉类化合物异构体，其特征在于，具有下式(1)、式(2)、式(3)或式(4)所示结构的任意一个：
Figure FDA0002044110090000011
其中，R1、R3各自独立地为甲基或乙基，R2选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子或氰基中的一种，R4选自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基、卤素原子、氰基或氢原子中的一种，X为碳原子或氮原子。
2.根据权利要求1所述的异噁唑啉类化合物异构体，其特征在于，所述R1、R3分别为甲基，R2为对位取代，R4为氢原子，X为氮原子。
3.根据权利要求2所述的异噁唑啉类化合物异构体，其特征在于，所述R2为氯原子。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，其特征在于，所述异构体由所述异噁唑啉类化合物的消旋化合物通过高效液相色谱手性分离制备获得，分离条件为：色谱柱为键合型色谱柱，流动相为含有0.01～10wt％乙酸的甲醇水混合液，流量0.01～10.0ml/min，柱温0～50℃，检测波长180～380nm。
5.根据权利要求4所述异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，其特征在于，所述色谱柱为大赛璐色谱柱CHIRALPAK IG。
6.根据权利要求4所述异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，其特征在于，所述流动相为含有0.1～0.5wt％乙酸的甲醇水混合溶液。
7.根据权利要求4所述异噁唑啉类化合物异构体的制备方法，其特征在于，所述检测波长为210～230nm。
8.一种由权利要求1-3任意一项所述异噁唑啉类化合物异构体形成的单晶。
9.一种如权利要求8所述异噁唑啉类化合物异构体的单晶的制备方法，其特征在于，利用该化合物异构体在不同溶剂中的溶解特性，以及结晶体的表观热力学行为，制备所述单晶。
10.根据权利要求9所述单晶的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、石油醚，或其混合物。
11.一种植物杀菌组合物，其特征在于，包括权利要求1-3任意一项中式(1)所示结构的异噁唑啉类化合物异构体：
Figure FDA0002044110090000021
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