CN111830178A - 谷胱甘肽的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了谷胱甘肽的检测方法，包括：制备具有谷胱甘肽和内标物的至少三种浓度的标准溶液，标准溶液中内标物的量相同；利用液质联用仪检测每一种标准溶液并获得第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中谷胱甘肽的浓度，拟合谷胱甘肽分别对应的标准曲线方程；向待处理样品内加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品；利用液质联用仪进行检测获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中谷胱甘肽的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

谷胱甘肽的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及谷胱甘肽的检测方法。

背景技术

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成且含有巯基的三肽，几乎存在于身体的每一个细胞，有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式。

目前，机体内谷胱甘肽含量测定的方法通常采用高效液相色谱法。但是，采用高效液相色谱法检测，通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了谷胱甘肽的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了谷胱甘肽的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有谷胱甘肽和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中谷胱甘肽的浓度，拟合谷胱甘肽对应的标准曲线方程；

向待处理样品内加入所述内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品；

利用液质联用仪在预设的检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中谷胱甘肽的浓度。

具体地，当标准溶液中的谷胱甘肽包括氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽时，标准溶液制备方式包括如下操作：

(1)标准储备液的配制

标准储备液A：精确称取还原型谷胱甘肽标准品置于容量瓶中，用0.1％甲酸水溶液(含10mg/mL的维生素C)进行溶解，并定容至容量瓶的标线，得到标准储备液A，立即封装，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。

标准储备液B：精确称取氧化型谷胱甘肽标准品置于容量瓶中，用0.1％甲酸水溶液(含10mg/mL的维生素C)溶解，并定容至容量瓶的标线，得到标准储备液B，立即封装，密封，并在-80℃条件下保存，有效期6个月。

标准工作液C：取适量上述标准储备液A、标准储备液B，用0.1％甲酸水溶液进行稀释混合，得到含有系列浓度的还原型谷胱甘肽、系列浓度的氧化型谷胱甘肽的系列标准工作液C，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；

内标储备液D：取还原型谷胱甘肽-¹³C₂ ¹⁵N标准品置于容量瓶，用0.1％甲酸水溶液进行溶解，并定容至容量瓶的标线得到内标储备液D，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

内标储备液E：取氧化型谷胱甘肽-¹³C₄ ¹⁵N₂标准品置于冻存管，用0.1％甲酸水溶液进行溶解，并定容至指定体积，得到内标储备液E，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

(2)混合内标工作液的配制

取适量内标储备液D和内标储备液E，用0.1％甲酸水溶液进行稀释，得到含还原型谷胱甘肽-¹³C₂ ¹⁵N、氧化型谷胱甘肽-¹³C₄ ¹⁵N₂的混合内标工作液，-80℃保存，密封，有效期3个月。

(3)制备至少三种浓度的标准溶液

分别移取相同量的至少三种浓度的标准工作液C和混合内标工作液分别置于离心管中，移取指定体积的磺基水杨酸溶液，顺次分别将加入磺基水杨酸溶液后的混合液在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀0.5-2min后，分别移取上述上清液作为标准溶液。

具体地，配制标准储备液A、标准储备液B、内标储备液D和内标储备液E便于再次进行检测时使用，无需检测人员每次检测都重复相同操作配制溶液，从而可以减少检测人员的重复操作。

优选地，

所述检测条件中的液相条件包括：

长度为50mm、内径为2.1mm以及填料粒径为3μm的色谱柱；

洗脱流动相为1-10mmol/L的甲酸铵的水溶液和甲醇，其中，甲酸铵的水溶液中含有体积比为0.05％-0.25％的甲酸；

柱温为30-50℃；流速为0.2-0.4mL/min。

具体地，色谱柱可以是Waters公司的Atlantis T3色谱柱，在流动相中增加甲酸可以调节流动相的PH值，并通过甲酸产生氢离子有助于电离，还可以避免甲酸量过多对色谱柱造成不可逆的损害。

针对甲酸铵的水溶液来说，甲酸铵的浓度1-10mmol/L是指1mmol/L到10mmol/L范围内的任一值，比如，1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L以及10mmol/L。

针对甲酸铵的水溶液中的甲酸的体积比来说，0.05％-0.25％是指0.05％到0.25％范围内的任一值，比如，0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％、0.22％以及0.25％。

针对柱温来说，30-50℃是指30℃到50℃范围内的任一值，比如，30℃、35℃、40℃、45℃以及50℃。

针对流速来说，0.2-0.4mL/min是指0.2mL/min到0.4mL/min范围内的任一值，比如，0.2mL/min、0.3mL/min以及0.4mL/min。

优选地，所述洗脱流动相采用等度洗脱，且甲酸铵的水溶液与甲醇的体积比为：95:5。

优选地，

所述检测条件中的质谱条件包括：

采用电喷雾电离源，正离子扫描模式，PRM监测模式，喷针位置：C，离子轨道阱分辨率：35000-70000；离子透镜射频电压：50.0；鞘气流速：40psi；辅助气流速：8arb；ESI加热温度：300℃；离子传输管温度：300℃；喷雾电压：4.50KV。

优选地，

标准溶液中的谷胱甘肽可以只包括氧化型谷胱甘肽或者还原型谷胱甘肽，也可以包括氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽。

当所述标准溶液中的谷胱甘肽包括氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽时，

所述内标物包括：氧化型谷胱甘肽对应的第一内标物和还原型谷胱甘肽对应的第二内标物；

氧化型谷胱甘肽对应的所述标准曲线方程的两个变量分别为：氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与所述第一内标物对应的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中氧化型谷胱甘肽的浓度与所述第一内标物的浓度的比值；

还原型谷胱甘肽对应的所述标准曲线方程的两个变量分别为：还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与所述第二内标物对应的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中还原型谷胱甘肽的浓度与所述第二内标物的浓度的比值。

具体地，为了检测标准溶液中氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽，标准溶液中还含有氧化型谷胱甘肽对应的第一内标物和还原型谷胱甘肽对应的第二内标物。

针对氧化型谷胱甘肽对应的标准曲线方程，当氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与第一内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y时，氧化型谷胱甘肽的浓度与第一内标物的浓度的比值作为横坐标x；当氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与第一内标物的色谱峰面积的比值作为横坐标x时，氧化型谷胱甘肽的浓度与第一内标物的浓度的比值作为纵坐标y。

针对还原型谷胱甘肽对应的标准曲线方程，当还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与第二内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y时，还原型谷胱甘肽的浓度与第二内标物的浓度的比值作为横坐标x；当还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与第二内标物的色谱峰面积的比值作为横坐标x时，还原型谷胱甘肽的浓度与第二内标物的浓度的比值作为纵坐标y。

优选地，

所述第一内标物包括氧化型谷胱甘肽的同位素-¹³C₄ ¹⁵N₂；

所述第二内标物包括还原型谷胱甘肽的同位素-¹³C₂ ¹⁵N。

可以理解的是，不同浓度的标准溶液中的第一内标物和第二内标物的量可以相同也可以不同，但是，不同浓度的标准溶液中的第一内标物的量均相同，且不同浓度的标准溶液中的第二内标物的量相同。

优选地，

所述沉淀蛋白试剂包括：2％-10％磺基水杨酸。该浓度的磺基水杨酸不仅可以完成对待处理样品中的蛋白进行沉淀，还可以避免磺基水杨酸用量过多抑制信号以及增加检测成本。

优选地，

为了增加标准溶液中的氧化型谷胱甘肽标准品和还原型谷胱甘肽标准品的溶解度，所述标准溶液中的稀释液为0.05％-0.2％的甲酸水溶液，其中，所述甲酸水溶液中含有10mg/mL的维生素C，以增加标准溶液中氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的稳定性。

优选地，

所述向待处理样品内加入所述内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品，包括：

将待处理样品超声2-10min，加入所述内标物，混匀，再加入沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-5min，顺次在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min。

具体地，通过对待处理样品进行超声，可以破碎红细胞，使待处理样品中的目标物分布更均匀，增加目标物的溶解性，有助于蛋白沉淀。在超声完毕后加入内标物，混匀，使得内标物在待处理样品中分布均匀。顺次再加入沉淀蛋白试剂进行蛋白沉淀，并进行高速涡旋，以使得蛋白沉淀的更完全，然后再进行高速离心，使得待处理样品固液分离。

针对超声时间来说，2-10min是指2min到10min范围内的任一时间，比如，2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min以及10min。

针对超声后的涡旋转速来说，1500-2000rpm是指1500rpm到2000rpm范围内的任一值，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm以及2000rpm。

针对涡旋时间来说，2-5min是指2min到5min范围内的任一时间，比如，2min、3min、4min以及5min。

针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm到15000rpm范围内的任一值，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。

针对离心时间来说，8-12min是指8min到12min范围内的任一时间，比如，8min、9min、10min、11min以及12min。

本发明提供了谷胱甘肽的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓度的谷胱甘肽的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的谷胱甘肽和内标物的浓度和多个检测结果，分别拟合谷胱甘肽对应的标准曲线方程，再对经过蛋白处理后得到的待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结果，基于上述的标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中谷胱甘肽的含量。通过对加入沉淀蛋白试剂后的待处理样品进行离心处理，可以得到能够测试的待测样品，前处理相对简单，耗费时间较少，无需通过衍生化试剂测试。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的谷胱甘肽的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的标准曲线中还原型谷胱甘肽的线性关系；

图3是本发明一实施例提供的标准曲线中氧化型谷胱甘肽的线性关系；

图4是本发明一实施例提供的标准溶液中的还原型谷胱甘肽的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的标准溶液中的还原型谷胱甘肽同位素内标的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的待测样品中的还原型谷胱甘肽的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的待测样品中的还原型谷胱甘肽同位素内标的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的标准溶液中的氧化型谷胱甘肽的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的标准溶液中的氧化型谷胱甘肽同位素内标的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的待测样品中的氧化型谷胱甘肽的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的待测样品中的氧化型谷胱甘肽同位素内标的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的柱温30℃时待测样品的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的柱温35℃时待测样品的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的柱温40℃时待测样品的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的柱温45℃时待测样品的色谱图；

图16是本发明一实施例提供的柱温50℃时待测样品的色谱图；

图17是本发明一实施例提供的流速0.2mL/min时待测样品的色谱图；

图18是本发明一实施例提供的流速0.25mL/min时待测样品的色谱图；

图19是本发明一实施例提供的流速0.35mL/min时待测样品的色谱图；

图20是本发明一实施例提供的流速0.4mL/min时待测样品的色谱图；

图21是本发明一实施例提供的有机相为10％甲醇-水溶液时待测样品的色谱图；

图22是本发明一实施例提供的有机相为2％甲醇-水溶液时待测样品的色谱图；

图23是本发明一实施例提供的有机相为5％甲醇-水溶液时待测样品的色谱图；

图24是本发明一实施例提供的流动相为5mmol/L的甲酸铵的水溶液和5％甲醇-水溶液时待测样品的色谱图；

图25是本发明一实施例提供的6％SSA沉淀蛋白后放置0小时的待测样品的色谱图；

图26是本发明一实施例提供的6％SSA沉淀蛋白后放置72小时的待测样品的色谱图；

图27是本发明一实施例提供的6％高氯酸沉淀蛋白后放置0小时的待测样品的色谱图；

图28是本发明一实施例提供的6％高氯酸沉淀蛋白后放置72小时的待测样品的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，检测待测样品中谷胱甘肽通常采用衍生化法，利用衍生化试剂与谷胱甘肽结构中的目标官能团反应生成衍生物，基于衍生物与谷胱甘肽的质量比来判断待测样品中谷胱甘肽的含量。但是，衍生化试剂通常稳定性较差，这样就增加了衍生化试剂的存储难度，从而增加检测待测样品中谷胱甘肽的难度。并且衍生化试剂与待测样品中谷胱甘肽反应需要在一定温度、PH值等条件下进行，这就进一步增加待测样品中谷胱甘肽的检测难度，并且衍生化反应需要的时间较长，这就增加了待测样品中谷胱甘肽整体的检测时长。

基于上述问题，本发明实施例提供了谷胱甘肽的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有谷胱甘肽和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中内标物的量相同；

步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中谷胱甘肽的浓度和内标物的浓度，拟合谷胱甘肽对应的标准曲线方程；

步骤104：向待处理样品内加入所述内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品；

步骤105：利用液质联用仪在预设的检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤106：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中谷胱甘肽的浓度。

在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的谷胱甘肽的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的谷胱甘肽和内标物的浓度和多个检测结果，分别拟合谷胱甘肽对应的标准曲线方程，再对经过蛋白处理后得到的待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结果，基于上述的标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中谷胱甘肽的含量。通过对加入沉淀蛋白试剂后的待处理样品进行离心处理，可以得到能够测试的待测样品，前处理相对简单，耗费时间较少，无需通过衍生化试剂测试。

下面以两个对比例来讲述本发明对样品前处理和检测条件的优点：

针对样品的前处理：

本方案例1：

(1)10μL同位素内标，加入100μL超声5min后的全血样品，至同一1.5mL离心管中；

(2)加6％磺基水杨酸SSA 300μL进行蛋白沉淀；

(3)室温混匀3min，离心10min，取上清进样分析。

对比例1：

《衍生化LC-MS/MS法测定大鼠血浆中内源性谷胱甘肽的含量》

(1)5μL内标(非同位素内标)，加入50μL全血样品至同一1.5mL离心管中；

(2)加入4-(N-马来酰亚胺)苯基三甲基碘化铵(MPTA，衍生试剂)5μL，20℃混匀40min，进行衍生；

(3)加入乙腈100μL，混匀1min，4℃离心10min，取上清液进样分析。

从本方案例1和对比例1可以看出，本发明采用蛋白沉淀的前处理方式，相较于对比例1中一次衍生化，一次20℃混匀40min和4℃离心，本发明不仅使前处理时间大大缩短，还节省了衍生试剂的配置时间及衍生条件优化的时间，并且避免使用刺激性，危险性高的化学试剂。

针对检测条件：

本方案例2：(1)流动相A：水(0.1％甲酸，5mM甲酸铵)，流动相B(甲醇)，等度洗脱；

(2)Waters公司的Atlantis T3色谱柱(2.1*50mm 3.0μm)，同时测定还原型和氧化型谷胱甘肽；

(3)流速：0.3mL/min，进样量：1μL，分析时间2min。

对比例2：衍生化LC-MS/MS法测定大鼠血浆中内源性谷胱甘肽的含量

(1)流动相A：水(0.1％甲酸)，流动相B(乙腈含0.1％甲酸)，梯度洗脱；

(2)Zorbax HILIC PLUS色谱柱(4.6*100mm 3.5μm)，只测定还原型谷胱甘肽；

(3)流速：1mL/min，进样量：10μL，分析时间5min。

基于本方案例2和对比例2可以看出，本方案不仅使GSH和GSSG得到很好得分离效果，而且使分析时间由5min减小到2min；相同样品量的情况下节省2.5倍的时间，大大节省了生物样品检测所需的时间，省时，高效。

下面以几个实施例对谷胱甘肽的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制

标准储备液A：精确称取还原型谷胱甘肽标准品20mg置于5mL容量瓶，用0.1％甲酸水溶液(含10mg/mL的维生素C)进行溶解，并定容至5mL，得到标准储备液A，立即分装，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。

标准储备液B：精确称取氧化型谷胱甘肽标准品20mg，置于5mL容量瓶，用0.1％甲酸水溶液(含10mg/mL的维生素C)溶解，并定容至5mL，得到标准储备液B，立即分装，密封，并在-80℃条件下保存，有效期6个月。

(b)标准工作液的配制

标准工作液C：取适量步骤(a)中标准储备液A、标准储备液B，用0.1％甲酸水溶液进行稀释混合，得到含有10.24-2500μmol/L的还原型谷胱甘肽、10.24-2500μmol/L的氧化型谷胱甘肽的系列标准工作液C，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；

(c)内标储备液的配制

内标储备液D：取还原型谷胱甘肽-¹³C₂ ¹⁵N标准品10mg置于10mL容量瓶，用0.1％甲酸水溶液进行溶解，并定容至10mL，得到内标储备液D，作为第二内标物，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

内标储备液E：取氧化型谷胱甘肽-¹³C₄ ¹⁵N₂标准品2.5mg置于2mL冻存管，用0.1％甲酸水溶液进行溶解，并定容至2mL，得到内标储备液E，作为第一内标物，密封，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

(d)混合内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液D和内标储备液E，用0.1％甲酸水溶液进行稀释，得到含还原型谷胱甘肽-¹³C₂ ¹⁵N 100μmol/L、氧化型谷胱甘肽-¹³C₄ ¹⁵N₂ 100μmol/L的混合内标工作液，-80℃保存，密封，有效期3个月。

(e)标准溶液的标定

利用移液器分别移取10μL七种不同浓度标准工作液C和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，移取加入380μL 6％磺基水杨酸溶液，混合制成七种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀1min后，分别移取上述上清液作为标准溶液；

其中，七种不同浓度的标准工作液分别为含有还原型谷胱甘肽：10.24μmol/L、25.6μmol/L、64μmol/L、160μmol/L、400μmol/L、1000μmol/L以及2500μmol/L，氧化型谷胱甘肽：10.24μmol/L、25.6μmol/L、64μmol/L、160μmol/L、400μmol/L、1000μmol/L以及2500μmol/L。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液质联用仪对实施例1中不同浓度的标准溶液进行检测，得到每种浓度的标准溶液对应的色谱图。

从各个色谱图中分别得到七种标准溶液中的氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、第一内标物和第二内标物分别对应的色谱峰面积。

以每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与第一内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y1，以氧化型谷胱甘肽的浓度与第一内标物的浓度的比值作为横坐标x1，将上述数据进行线性归回，拟合得到针对氧化型谷胱甘肽的标准曲线方程y1＝a*x1+b，其中，a、b为权重系数，a为该标准曲线方程的斜率，b为该标准曲线方程的截距。

以每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与第二内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y2，以氧化型谷胱甘肽的浓度与第二内标物的浓度的比值作为横坐标x2，将上述数据进行线性归回，拟合得到针对还原型谷胱甘肽的标准曲线方程y2＝c*x2+d，其中，c、d为权重系数，c为该标准曲线方程的斜率，d为该标准曲线方程的截距。

上述检测条件中的液相条件为：

色谱柱：Waters公司的Atlantis T3色谱柱(2.1*50mm 3.0μm)

流动相：含体积比为0.1％甲酸及浓度为5mmol/L的甲酸铵的水溶液，及甲醇。

柱温：40℃

进样量：1μl

流速：0.3mL/min

上述检测条件中的串联质谱条件为：

采用电喷雾电离源ESI，正离子扫描模式，平行反应监测模式，喷针位置：C；Orbitrap分辨率：35000；S-lens RF level：50.0；鞘气流速：40psi；辅助气流速：8arb；ESI加热温度：300℃；离子传输管温度：300℃；喷雾电压：4.50KV。

进一步地，液质联用仪中的质谱仪的参数如下表1所示：

其中，CE为碰撞电压，S-lens RF level为离子透镜射频电压。

通过上述的检测条件可见，本方案采用了同时包括含碳代和氮代的同位素内标，不但避免了成分复杂的内源性物质的干扰，也避免了个体间差异，同时使得特异性更强，检测的准确度更高。

需要说明的是，质谱仪检测时的相关参数范围如下述表2所示：

英文名称	中文名称	可设定范围
			Sheath Gas Flow Rate	鞘气流速	0-80psi
Aux Gas Flow Rate	辅助气流速	0-40arb
			Sweep gas Flow Rate	吹扫气气流速	0-10arb
Spray Voltage	喷雾电压	0-8.0KV
			Capillary temp	离子传输管温度	0-450℃
S-lens RF level	离子透镜射频电压	0-100
			Aux Gas heater temp	辅助气温度	0-600℃
HESI-II Probe	喷针位置	A、B、C、D四个位置
			Resolution	分辨率	17500、35000、70000

实施例3：待测样品的处理

取待处理样品至少1.0mL，混匀，得全血，上述全血置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；

用移液枪移取10μL实施例1步骤(d)的混合内标工作液于1.5mL的离心管中，将上述全血超声5min，取100μL加入上述1.5mL的离心管中，将两者混匀，再加入磺基水杨酸溶液，在1500rpm的转速下涡旋混合5min后，在15000rpm的转速下高速离心10min，移取一定量的离心后的上清液至干净进样小瓶中，移取得上清液即为待测样品；

实施例4：待测样品的检测

利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽的色谱峰面积，以及待测样品中第一内标物和第二内标物的色谱图。

针对待测样品中的氧化型谷胱甘肽，将氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与第一内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y1，代入氧化型谷胱甘肽对应的标准曲线方程y1＝a*x1+b中，得到氧化型谷胱甘肽的浓度与第一内标物的浓度的比值x1，由于待测样品中第一内标物的浓度已知，由此，可以计算出待测样品中氧化型谷胱甘肽的浓度。

针对待测样品中的还原型谷胱甘肽，将还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与第二内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y2，代入还原型谷胱甘肽对应的标准曲线方程y2＝c*x2+d中，得到还原型谷胱甘肽的浓度与第二内标物的浓度的比值x2，由于待测样品中第二内标物的浓度已知，由此，可以计算出待测样品中还原型谷胱甘肽的浓度。

实施例5：定量限和检测限测定

采用4％-5％的牛血清白蛋白配制成含GSH(10.24μmol/L)和GSSG(10.24μmol/L)的模拟血液样品，用4％-5％的牛血清白蛋白做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的模拟的血液样品稀释液，加入10μL混合内标工作液，按本实施例前处理及检测条件进行测定，结果，GSH、GSSG的检测限和定量限如下所示，稀释倍数及实际浓度见表3：

表3

还原型谷胱甘肽

(1)检测限(LOD)：0.0256umol/L，S/N＝5。

(2)定量限(LOQ)：0.0512umol/L，S/N＝13。

氧化型谷胱甘肽

(1)检测限(LOD)：0.08192umol/L，S/N＝3。

(2)定量限(LOQ)：0.1024umol/L，S/N＝15。

由表3可知，还原型谷胱甘肽的检测限及定量限均小于0.06umol/L，氧化型谷胱甘肽的检测限及定量限均小于0.11umol/L，灵敏度相对较高，对GSH和GSSG含量很低的生物样品也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例6：线性方程的测定

将实施例1中制备的七种浓度的标准工作液C利用实施例2中的检测条件进行质谱色谱连用技术的测定，得到各种浓度标准品及内标物的色谱图(其中，氧化型谷胱甘肽标准品的保留时间为1.01min、还原型谷胱甘肽标准品的保留时间分别为0.76min，氧化型谷胱甘肽内标物的保留时间为1.02min，还原型谷胱甘肽内标物的保留时间为0.74min)，确定各色谱峰峰面积。以氧化型谷胱甘肽标准品色谱峰面积与第一内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y3，标准工作液中氧化型谷胱甘肽的浓度与混合内标工作液中的第一内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x3。以还原型谷胱甘肽标准品色谱峰面积与第二内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y4，标准工作液中还原型谷胱甘肽的浓度与混合内标工作液中的第二内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x4。

将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y₃＝e*x₃+f、y₄＝g*x₄+h，得系数权重系数e、f、g、h；线性方程的测定结果见表4，线性方程图谱见图2、图3。

表4.氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽线性方程的测定

检测指标	线性范围	线性方程	相关系数	加权
					还原型谷胱甘肽	10.24-2500umol/L	Y＝9.345e-2X+3.515e-2	R<sup>2</sup>＝0.9931	1/X<sup>2</sup>
氧化型谷胱甘肽	10.24-2500umol/L	Y＝7.919e-2X+6.895e-2	R<sup>2</sup>＝0.9973	1/X<sup>2</sup>

表4为一次实施例中的线性关系数据，由表4可知，还原型谷胱甘肽在10.24-2500umol/L的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好；氧化型谷胱甘肽在10.24-2500umol/L的线性范围内，相关系数R²＞0.9900，线性关系良好。

实施例7：谷胱甘肽的检测方法的回收率和精密度

分别取还原型及氧化型谷胱甘肽标准工作液配制成高、中、低，及不加标品的正常人全血，共4种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例方法进行测定，平行测定4个样品。还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的回收率和精密度如表5。还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在不加标全血及低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.95％～105.17％，精密度为1.68％～7.50％结果见表5。

表5

综合上述验证试验，本实施例的回收率、检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除***误差。

图2为标准曲线中还原型谷胱甘肽的线性关系，图3为标准曲线中氧化型谷胱甘肽的线性关系。其中，图2和图3的横坐标均为配制的标准工作液的浓度，纵坐标均为色谱峰面积比。

在本实施例中，标准溶液中的还原型谷胱甘肽色谱图如图4所示；标准溶液中还原型谷胱甘肽同位素内标的色谱图如图5所示；待测样品中的还原型谷胱甘肽色谱图如图6所示；待测样品中的还原型谷胱甘肽同位素内标的色谱图如图7所示。由图4-7可见，待测样品中的还原型谷胱甘肽的保留时间与标准工作溶液中的谷胱甘肽的保留时间一致，该方法以还原型谷胱甘肽同位素标记物为内标物，使得还原型谷胱甘肽的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

在本实施例中，标准溶液中的氧化型谷胱甘肽色谱图如图8所示；标准溶液中的氧化型谷胱甘肽同位素内标的色谱图如图9所示；待测样品中的氧化型谷胱甘肽色谱图如图10所示；待测样品中的氧化型谷胱甘肽同位素内标的色谱图如图11所示。由图8-11可见，待测样品中的氧化型谷胱甘肽的保留时间与其标准工作溶液中的氧化型谷胱甘肽的保留时间一致，该方法以同位素标记物为内标物，使得氧化型谷胱甘肽的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例8：针对柱温的说明

图12至图16分别对应的试验是与实施例3和实施例4中待测样品的检测相对应的平行试验，图12至图16对应的试验与实施例3和实施例4中待测样品检测区别为柱温不同。图12至图16中除了目标峰外均为杂质峰，并且色谱图中位于上方的均为还原型谷胱甘肽的色谱图，位于下方的均为氧化型谷胱甘肽的色谱图。

图12为柱温30℃时待测样品的色谱图，保留时间0.85为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.20为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图13为柱温35℃时待测样品的色谱图，保留时间0.82为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.07为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图14为柱温40℃时待测样品的色谱图，保留时间0.77为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.97为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图15为柱温45℃时待测样品的色谱图，保留时间0.74为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.92为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图16为柱温50℃时待测样品的色谱图，保留时间0.74为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.86为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

通过图12至图16可见，流速相同时，柱温低于30℃时，氧化型谷胱甘肽的保留时间会大于1.2min，这样会增加样品的整体检测时间，影响样品检测的时效性。而柱温高于50℃时，还原型谷胱甘肽的保留时间会小于0.7min，与***的死体积和溶剂峰的保留时间相接近，不利于操作人员分辨目标峰。

实施例9：针对流速的说明

图17至图20分别对应的试验是与实施例3和实施例4中待测样品的检测相对应的平行试验，图17至图20对应的试验与实施例3和实施例4中待测样品检测区别为流速不同。图17至图20中除了目标峰外均为杂质峰，并且色谱图中位于上方的均为还原型谷胱甘肽的色谱图，位于下方的均为氧化型谷胱甘肽的色谱图。

图17为流速0.2mL/min时待测样品的色谱图，保留时间1.19min为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间为1.48氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图18为流速0.25mL/min时待测样品的色谱图，保留时间0.95min为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间为1.18氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图19为流速0.35mL/min时待测样品的色谱图，保留时间0.66min为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间为0.85氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图20为流速0.4mL/min时待测样品的色谱图，保留时间0.59min为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间为0.74氧化型谷胱甘肽色谱峰。

图17至图20可见，柱温相同，流速小于0.2mL/min时，氧化型谷胱甘肽的保留时间会大于1.5min，这样会使得待测样品检测时间过长，影响样品检测的时效性。而当流速大于0.4mL/min时，色谱柱的柱压会超过色谱柱所能承受的压力，在高压下长时间进行样品检测会对色谱柱造成不可逆的损伤。

实施例10：针对流动相的说明

图21至图24分别对应的试验是与实施例3和实施例4中待测样品的检测相对应的平行试验，图21至图24对应的试验与实施例3和实施例4中待测样品检测区别为流动相不同。图21至图24中除了目标峰外均为杂质峰，并且色谱图中位于上方的均为还原型谷胱甘肽的色谱图，位于下方的均为氧化型谷胱甘肽的色谱图。

图21为有机相为10％甲醇-水溶液作为流动相时的色谱图，保留时间1.01为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.10min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图22为有机相为2％甲醇-水溶液作为流动相时的色谱图，保留时间1.86为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间2.26min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图23为有机相为5％甲醇-水溶液作为流动相时的色谱图，保留时间1.17为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.62min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图24为5mmol/L的甲酸铵的水溶液和5％甲醇-水溶液作为流动相时的色谱图，其中，甲酸铵的水溶液中含有体积比为0.1％的甲酸，保留时间0.77为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.04min为氧化型谷胱甘肽色谱峰。

通过图21至图24可见，有机相为10％甲醇水溶液时，两个目标物的分离效果较差，这样会导致两个目标物定量时产生互相串扰的现象。有机相为2％甲醇水溶液时，两个目标物的保留时间相对较长，并且，氧化型谷胱甘肽色谱峰拖尾严重。有机相为5％甲醇水溶液时，氧化型谷胱甘肽色谱峰存在拖尾现象。而图24中的流动相对应的两个目标物的分离效果较好，不会产生相互串扰的现象，峰型较好且保留时间也相对较短。

实施例11：针对样品稳定性的说明

图25至图27分别对应的试验与实施例3和实施例4中待测样品的检测相对应的平行试验，是样品稳定性测试中的部分图谱。图25至图27中除了目标峰外均为杂质峰，并且色谱图中位于上方的均为还原型谷胱甘肽的色谱图，位于下方的均为氧化型谷胱甘肽的色谱图。

图25为6％SSA沉淀蛋白处理后放置0小时的色谱图，其中，保留时间0.74为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.99min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图26为6％SSA沉淀蛋白处理后放置72小时的色谱图，其中，保留时间0.76为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.99min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图27为6％高氯酸PCA沉淀蛋白处理后放置0小时的色谱图，其中，保留时间0.75为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间0.98min为氧化型谷胱甘肽色谱峰；

图28为6％高氯酸PCA沉淀蛋白处理后放置72小时的色谱图，其中，保留时间0.78为还原型谷胱甘肽色谱峰，保留时间1.01min为氧化型谷胱甘肽色谱峰。

沉淀蛋白试剂SSA和PCA前处理的样品在室温放置的稳定性数据如下述表6所示：

表6

沉淀蛋白试剂SSA和PCA前处理的样品在4℃放置的稳定性数据如下述表7所示：

表7

由上述表6和表7可知：

1)样品经6％SSA前处理后，室温放置，GSH 48h降为原值的83.79％，72h降为原值的79.53％，GSSG 72h定值几乎不变。

2)样品经6％PCA前处理后，室温放置，GSH 48h降为原值的61.12％，72h降为原值的57.22％，GSSG 72h降为原值的91.05％。

3)样品经6％PCA前处理后，4℃放置，GSH 48h降为原值的79.28％，72h与48h相近，GSSG72h定值几乎不变。

4)样品经6％SSA前处理后，4℃放置，GSH 48h降为原值的82.80％，72h降为原值的87.34％，GSSG 72h定值几乎不变。

综上所述，最终选择6％SSA前处理后样品稳定性相对较好。

图4至图28的横坐标均为保留时间，纵坐标均为信号强度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有谷胱甘肽和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中谷胱甘肽的浓度和内标物的浓度，拟合谷胱甘肽对应的标准曲线方程；

向待处理样品内加入所述内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品；

利用液质联用仪在预设的检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中谷胱甘肽的浓度。

2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的液相条件包括：

长度为50mm、内径为2.1mm以及填料粒径为3μm的色谱柱；

洗脱流动相为1-10mmol/L的甲酸铵的水溶液和甲醇，其中，甲酸铵的水溶液中含有体积比为0.05％-0.25％的甲酸；

柱温为30-50℃；

流速为0.2-0.4mL/min。

3.根据权利要求2所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述洗脱流动相采用等度洗脱；

甲酸铵的水溶液与甲醇的体积比为：95:5。

4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述检测条件中的质谱条件包括：

采用电喷雾电离源，正离子扫描模式，平行反应监测模式，喷针位置：C，离子轨道阱分辨率：35000-70000；离子透镜射频电压：50.0；鞘气流速：40psi；辅助气流速：8arb；离子源加热温度：300℃；离子传输管温度：300℃；喷雾电压：4.50KV。

5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

当所述标准溶液中的谷胱甘肽包括氧化型谷胱甘肽时，所述内标物包括：氧化型谷胱甘肽对应的第一内标物；

氧化型谷胱甘肽对应的所述标准曲线方程的两个变量分别为：氧化型谷胱甘肽的色谱峰面积与所述第一内标物对应的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中氧化型谷胱甘肽的浓度与所述第一内标物的浓度的比值。

6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

当所述标准溶液中的谷胱甘肽包括还原型谷胱甘肽时，所述内标物包括：还原型谷胱甘肽对应的第二内标物；

还原型谷胱甘肽对应的所述标准曲线方程的两个变量分别为：还原型谷胱甘肽的色谱峰面积与所述第二内标物对应的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中还原型谷胱甘肽的浓度与所述第二内标物的浓度的比值。

7.根据权利要求5所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述第一内标物包括氧化型谷胱甘肽的同位素-¹³C₄ ¹⁵N₂。

8.根据权利要求6所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述第二内标物包括还原型谷胱甘肽的同位素-¹³C₂ ¹⁵N。

9.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述沉淀蛋白试剂包括：2％-10％磺基水杨酸；

和/或，

所述标准溶液中的稀释液为0.05％-0.2％的甲酸水溶液，其中，所述甲酸水溶液中含有10mg/mL的维生素C。

10.根据权利要求1至9中任一所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，

所述向待处理样品内加入所述内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并高速离心，取上清液作为待测样品，包括：

将待处理样品超声2-10min，加入所述内标物，混匀，再加入沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-5min，顺次在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min。

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