CN111929394B - 华法林的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了华法林的检测方法，包括：制备具有华法林和内标物的至少三种浓度的标准溶液；利用液相色谱质谱联用仪分别检测每一种标准溶液，获得每种标准溶液的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中的华法林和内标物的浓度拟合华法林的标准曲线方程；对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；向第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和内标物，涡旋混合并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；利用液相色谱质谱联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中华法林的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

华法林的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及华法林的检测方法。
背景技术
华法林是香豆素类抗凝剂的一种，有对抗维生素K的作用。可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝脏的合成。
目前，检测样品中华法林含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而高效液相色谱法检测华法林通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了华法林的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了华法林的检测方法，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有华法林和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液相色谱质谱联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的华法林和内标物的浓度，拟合华法林的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
利用液相色谱质谱联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中华法林的浓度。
需要说明的是，第一上清液为血清或血浆。
具体地，为了提高被取样人的依从性，待处理样品的取用量为2-10μL。
待测样品中的内标物的浓度与标准溶液中的内标物的浓度相同。
优选地，所述内标物为华法林-D5。采用目标物的同位素作为内标物，可以避免在对目标物检测时内标物与目标物发生反应，而影响目标物的检测。
优选地，
所述检测条件中的液相条件，包括：
洗脱流动相为有机相和水相，其中，有机相包括甲醇溶液和/或乙腈溶液；
柱温为18℃-50℃；
流速为0.2-0.6mL/min。
优选地，待测样品的进样量为0.1-10μL。当进样量为0.1μL时信噪比为16.1，可满足定量要求，当进样量超过10μL测试信号饱和。
具体地，液相条件的色谱柱包括Waters Atlantis dC18色谱柱(内径2.1×柱长50mm、填料的粒径5μm)、AglientExtend-C18(内径2.1×柱长50mm、填料的粒径5μm)、AglientXDB-C8(内径2.1×柱长50mm、填料的粒径5μm)、SHIMADZU-SP-C18(内径2.1×柱长50mm、填料的粒径2.6μm)、Aglient-SB-Aq(内径2.1×柱长50mm、填料的粒径5μm)。
针对洗脱流动相来说，可以是由甲醇溶液和水相组成的洗脱流动相，也可以是由乙腈溶液和水相组成的洗脱流动相，还可以是由水相与甲醇溶液和乙腈溶液以任意比例混合后组成的洗脱流动相。
针对柱温来说，18℃-50℃是指18℃到50℃范围内的任一值，比如，18℃、20℃、23℃、25℃、30℃、33℃、35℃、40℃、43℃、45℃以及50℃。
针对流速来说，0.2-0.6mL/min是指0.2mL/min到0.6mL/min范围内的任一值，比如，0.2mL/min、0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min、0.4mL/min、0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min以及0.6mL/min。
优选地，所述洗脱流动相中的有机相与水相的比例为：
0-0.5min：20-30％:80-70％；
0.51-1.5min：90-95％:10-5％；
1.51-2.5min：20-30％:80-70％。
具体地，有机相和水相在洗脱流动相中的占比总和为1，因此，
针对洗脱流动相在0-0.5min时的比例，20-30％:80-70％是指20％：80％至30％:70％范围内的任一比值。比如，有机相与水相的比例为20％：80％、25％：75％或30％：70％。
针对洗脱流动相在0.51-1.5min时的比例，90-95％:10-5％是指，90％：10％至95％：5％范围内的任一比值，比如，有机相与水相的比例为90％：10％、93％：7％或者95％：5％。
针对洗脱流动相在1.51-2.5min时的比例，20-30％:80-70％是指，20％：80％至30％:70％范围内的任一比值。比如，有机相与水相的比例为20％：80％、25％：75％或30％：70％。
优选地，所述洗脱流动相中的有机相中含有0-1mmol/L的缓冲盐和0-0.5％的甲酸；
所述洗脱流动相中的水相中含有0-10mmol/L的缓冲盐和0-0.5％的甲酸。
其中，洗脱流动相中的缓冲盐包括甲酸铵或乙酸铵。
具体地，当洗脱流动相中甲酸的添加量大于1％时，流动相的pH低于2.5，通过该pH的洗脱流动相进行检测会对色谱柱造成不可逆的损伤，因此，洗脱流动相的有机相和水相中的甲酸的含量之和不大于1％。当洗脱流动相的有机相中的缓冲盐的添加量大于1mmol/L，或者洗脱流动相的水相中的缓冲盐的添加量大于10mmol/L时，有机相中的缓冲盐、水相中的缓冲盐处于饱和状态，会存在缓冲盐析出的情况，若利用该有机相进行检测，已析出的缓冲盐会堵塞色谱柱，影响样品测试。
针对洗脱流动相中的甲酸来说，0-0.5％是指0-0.5％范围内的任一比例，比如，0、0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.08％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％以及0.5％。
针对洗脱流动相中有机相中的缓冲盐来说，0-1mmol/L是指0mmol/L-1mmol/L范围内的任一值，比如，0mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L以及1mmol/L。
针对洗脱流动相中水相中的缓冲盐来说，0-10mmol/L是指0mmol/L-10mmol/L范围内的任一值，比如，0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L以及10mmol/L。
优选地，所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液相色谱质谱联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；
所述液相色谱质谱联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):8-12，雾化气流速(L/min):30-35，加热气温度(℃):300-350，毛细管电压(V):3000-4000。
针对加热气流速来说，8-12L/min是指8L/min至12L/min范围内的任一值，比如，8L/min、9L/min、10L/min、11L/min以及12L/min。
针对雾化气流速来说，30-35L/min是指30L/min至35L/min范围内的任一值，比如，30L/min、31L/min、32L/min、33L/min、34L/min以及35L/min。
针对加热气温度来说，300-350℃是指300℃至350℃范围内的任一值，比如，300℃、310℃、320℃、330℃、340℃以及350℃。
针对毛细管电压来说。3000-4000V是指3000V至4000V范围内的任一值，比如，3000V、3100V、3200V、3300V、3400V、3500V、3600V、3700V、3800V、3900V以及4000V。
优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述第一检测结果中的华法林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中的华法林的浓度与内标物的浓度的比值。
可以理解的是，当标准溶液中的华法林的色谱峰面积与标准溶液中的内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y时，标准溶液中的华法林的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x。
若标准溶液中的华法林的色谱峰面积与标准溶液中的内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的横坐标x时，标准溶液中华法林的浓度与标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的纵坐标y。
优选地，所述沉淀蛋白试剂包括：甲醇溶液、乙腈溶液、三氯乙酸、磺基水杨酸和高氯酸中的至少一种。
沉淀蛋白试剂可以是甲醇溶液、乙腈溶液、三氯乙酸、磺基水杨酸或者高氯酸，还可以是上述任意两种沉淀蛋白试剂按照任意比例混合后的溶液。
采用乙腈溶液、甲醇溶液作为沉淀蛋白试剂，可以使得华法林及其内标相对更稳定，防止降解。
优选地，所述沉淀蛋白试剂与所述第一上清液的体积比为5:1-500:1。以使对第一上清液内的蛋白完全沉淀的情况下，避免沉淀蛋白试剂的量与第一上清液的比例大于500:1时第一上清液被过度稀释，使得稀释后的第一上清液中的目标物低于液相色谱质谱联用仪的检测限，L1点信噪比为25.4，而导致目标物无法被检测到。
针对沉淀蛋白试剂与第一上清液的体积比来说，5:1-500:1是指，5:1至500:1范围内的任意比例，比如，5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、50:1、70:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1以及500:1。
优选地，所述向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入含有内标物的内标工作液，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min；
顺次向混合后的所述第一上清液中加入沉淀蛋白试剂，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合2-4min后，并在10000-15000rpm的转速下高速离心5-10min，取离心后的第二上清液作为待测样品。
具体地，在向第一上清液内加入内标工作液后，可先对该混合液进行涡旋混合，以保证第一以上清液与内标物混合均匀。顺次再加入沉淀蛋白试剂，然后进行涡旋混合，以通过沉淀蛋白试剂在涡旋过程中沉淀第一上清液中的蛋白，再通过高速离心，第二上清液即为沉淀蛋白后的待测样品。
具体地，可以通过下述步骤制备标准溶液：
(1)标准工作液的配制
精确称取华法林标准品4.38mg置于2mL容量瓶，用稀释液进行溶解，并定容于2mL，得到标准储备液，其华法林浓度为2190μg/mL；用含水量为稀释液进行稀释，得到浓度分别为15.00μg/mL、7.50μg/mL、3.75μg/mL、1.88μg/mL、0.94μg/mL、0.47μg/mL、0.23μg/mL的华法林标准工作液，并于-80℃保存，有效期3个月。
(2)内标工作液的配制
将将0.5mg内标溶于1mL含水量为液稀释液中，得到标准内标储备液，浓度为500μg/mL的溶液，置于-20℃保存。取10μL储备液B加入4990μL稀释液进行稀释得到1μg/mL的内标工作液，置于-80℃保存。
(3)标准溶液的标定
用移液器移取步骤(1)中至少三种不同浓度的标准溶液、步骤(2)中的内标工作液和稀释液，并分别置于离心管中，再将上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，混合制成至少三种标准溶液。
上述标准工作液、内标工作液和标准溶液中的稀释液包括含水量为0-30％的甲醇水溶液，也就是说，该甲醇水溶液中的甲醇溶液与水溶液的比例为100:0-70:30。稀释液中的含水量最高为30％，可以避免标准工作液、内标工作液和标准溶液中含水量过大在进行储存时，溶液因温度过低凝固。
本发明提供了华法林的检测方法，通过液相色谱质谱联用仪对含有不同浓度的华法林的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的华法林的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到华法林的标准曲线方程，再待处理样品进行高速离心处理，可以得到离心后的血清或血浆，顺次加入沉淀蛋白试剂和内标物进行蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品。利用与标准溶液相同的检测方法对待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中华法林的含量。通过对待处理样品进行离心、蛋白沉淀后即可得到能够进行测试待测样品，样品的前处理相对简单，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的华法林的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的待测样品中的华法林的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的华法林的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的流速0.2mL/min、柱温18℃下待测样品的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的流速0.3mL/min、柱温25℃下待测样品的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的流速0.4mL/min、柱温30℃下待测样品的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的流速0.4mL/min、柱温45℃下待测样品的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的流速0.6mL/min、柱温50℃下待测样品的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的流速0.1mL/min、柱温15℃时的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为乙腈时的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为5％三氯乙酸的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为6％磺基水杨酸的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的待测样品的进样量为0.1μL的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂与第一上清液的比例为500：1的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的色谱柱为AglientExtend-C18的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的色谱柱为AglientXDB-C8的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的色谱柱为SHIMADZU-SP-C18的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的色谱柱为Aglient-SB-Aq的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的一种流动相的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的另一种流动相的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的又一种流动相的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的又一种流动相的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，检测待测样品中华法林通常采用衍生化法，利用衍生化试剂与华法林结构中的目标官能团反应生成衍生物，基于衍生物与华法林的质量比来判断待测样品中华法林的含量。但是，衍生化试剂通常稳定性较差，这样就增加了衍生化试剂的存储难度，从而增加检测待测样品中华法林的难度。并且衍生化试剂与待测样品中华法林反应需要在一定温度、PH值等条件下进行，这就进一步增加待测样品中华法林的检测难度，并且衍生化反应需要的时间较长，这就增加了待测样品中华法林整体的检测时长。
基于上述问题，本发明实施例提供了华法林的检测方法，如图1所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有华法林和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
步骤102：利用液相色谱质谱联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的华法林和内标物的浓度，拟合华法林的标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤105：向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
步骤106：利用液相色谱质谱联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中华法林的浓度。
在本发明实施例中，通过液相色谱质谱联用仪对含有不同浓度的华法林的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的华法林的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到华法林的标准曲线方程，再待处理样品进行高速离心处理，可以得到离心后的血清或血浆，顺次加入沉淀蛋白试剂和内标物进行蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品。利用与标准溶液相同的检测方法对待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中华法林的含量。通过对待处理样品进行离心、蛋白沉淀后即可得到能够进行测试待测样品，样品的前处理相对简单，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
下面通过几个实施例对华法林的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准储备液的配制
精确称取华法林标准品4.38mg置于2mL容量瓶，用含水量为30％的甲醇水溶液进行溶解，并定容于2mL，得到标准储备液A，其华法林浓度为2190μg/mL；用含水量为30％的甲醇水溶液进行稀释，得到浓度分别为15.00μg/mL、7.50μg/mL、3.75μg/mL、1.88μg/mL、0.94μg/mL、0.47μg/mL、0.23μg/mL的华法林标准工作液，-80℃保存，有效期3个月。
(b)内标工作液的配制
将0.5mg内标溶于1mL含水量为30％的甲醇水溶液中，得到标准内标储备液B，浓度为500μg/mL的溶液，置于-20℃保存。取10μL储备液B加入4990μL含水量为30％的甲醇水溶液进行稀释得到1μg/mL的内标工作液，置于-80℃保存。
(c)标准溶液的标定
用移液器移取步骤(a)中七种不同浓度的标准工作液10μL、步骤(b)中的10μL内标工作液和80μL含水量为30％的甲醇水溶液分别置于1.5mL离心管中，并分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s，混合制成七种含有不同浓度华法林标准品的标准溶液，并且七种标准溶液中的内标物的量相同。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液相色谱质谱联用仪对实施例1中七种浓度的标准溶液分别进行检测，得到七种不同浓度的华法林的标准溶液的色谱图。
从上述华法林的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中华法林的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的华法林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准溶液中的华法林的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的七种不同浓度的数据进行线性归回，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，其中，a和b为权重系数，a为标准曲线方程的斜率，b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Waters Atlantis dC18色谱柱(2.1×50mm，5μm)。
仪器：安捷伦1290-6430高效液相色谱质谱联用仪。
洗脱条件：水相和甲醇溶液；
柱温：30℃，进样量：2μL，流速：0.4mL/min。
质谱检测器为ESI(+)检测模式，离子源参数为：加热气流速(L/min):10，雾化气流速(L/min):35，加热气温度(℃):350，毛细管电压(V):4000。
其中，洗脱流动相的比例如下述表1所示：
表1
时间/min 甲醇/％ 水/％
0 30 70
0.5 30 70
0.51 90 10
1.5 90 10
1.51 30 70
2.5 30 70
其中，液相色谱质谱联用仪中的质谱检测器离子对参数如下述表2所示：
表2
物质名称 母离子 子离子 Dwell Fragmentor CE CAV
华法林(定量) 309 251 150 120 14 7
华法林(定性) 309 121 150 120 42 7
华法林-d5 314 256 150 120 14 7
其中，Dewll为扫描时间，Fragmentor为碎裂电压，CE为碰撞电压，CAV6：为线性加速电压。
实施例3：待测样品的处理
3.1取待处理样品至少50-80μL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，将上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
3.2用移液枪移取10μL实施例1步骤(b)的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入10μL步骤3.1中的上清液，在2000rpm的转速下涡旋混合30s，顺次向离心管中加入80μL甲醇，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，并在12000rpm的转速下高速离心10min，移取100μL上清液至干净的内插管中，移取的上清液即为待测样品。
实施例4：待测样品的检测
移取步骤3.2中的待测样品80μL，利用液相色谱质谱联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中华法林和内标物的色谱峰面积，将待测样品中的华法林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y＝a*x+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中华法林的浓度与内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算得到待测样品中的华法林的浓度。
综上可见，通过上述检测方法检测待测样品中的华法林含量，仅需取50-80μL的待处理样品进行处理，即可得到待测样品，从而可以使得用户的依从性较好。
实施例5：华法林的检测方法的线性关系和定量限
分别移取步骤(a)中七种浓度的华法林标准工作液10μL，分别向移取的每种浓度的华法林标准工作液中加入10μL步骤(b)中的内标工作液和80μL甲醇，混匀后利用液相色谱质谱联用仪按照实施例2中的检测条件进行检测，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明华法林的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.077ng/mL
(2)定量限(LOQ)：0.23ng/mL
(3)线性范围：华法林在0.023μg/mL到1.5μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.999。
实施例6：华法林的检测方法的回收率和精密度
移取步骤(a)中的华法林标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例(2)中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度如下述表3所示：
表3
加标量 0.47μg/mL 1.88μg/mL 7.5μg/mL
平均回收率 99.91％ 103.61％ 105.06％
精密度RSD 2.51％ 1.92％ 0.73％
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中华法林浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
图2为待测样品中的华法林的色谱图，图3为标准溶液中的华法林的色谱图。华法林和内标的保留时间一致。图2和图3中，位于上方的均为内标的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图；
其中，图2的横坐标的单位长度为0.1，图2中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×103；
图3的横坐标的单位长度为0.1，图3中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103。
由图2和图3可知，本实施例方法中的目标物识别准确，分析时间短、干扰小，特异性强。
实施例7：针对柱温和流动相的流速的说明
图4至图9分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为流动相流速和柱温不同。其中，图4至图9中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图4为流速0.2mL/min、柱温18℃时的色谱图，图4的横坐标的单位长度为0.1，图4中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图5为流速0.3mL/min、柱温25℃时的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.1，图5中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×103；
图6为流速0.4mL/min、柱温30℃时的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.1，图6中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104；
图7为流速0.4mL/min、柱温45℃时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为0.1，图7中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×103；
图8为流速0.6mL/min、柱温50℃时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为0.1，图8中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103。
图9为流速0.1mL/min、柱温15℃时的色谱图，图9的横坐标的单位长度为0.2，图9中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104。
通过图4至图9可见，柱温15℃、流速小于0.1mL/min时，华法林和内标物的保留时间大于4.2min，这样会使得待测样品整体的检测时间过长，影响样品检测的时效性。并且由于流动相的流速过低，待测样品在高效液相色谱质谱联用仪中的离子化效率较差，使得检测信号较差，不利于待测样品的检测。
而当流速大于0.6mL/min，柱温大于50℃时，色谱柱的柱压会超过色谱柱所能承受的压力，当待测样品检测数量较多时，会对色谱柱造成不可逆的损伤，并且待测样品检测的准确性也会降低。并且，此时的柱温已超过色谱柱能够承受的温度，这样会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响样品检测效果。
实施例8：针对沉淀蛋白试剂的说明
图10至图12分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为沉淀蛋白试剂不同。其中，图10至图12中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图10是沉淀蛋白试剂为乙腈时的色谱图，图10的横坐标的单位长度为0.1，图10中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103；
图11是沉淀蛋白试剂为5％三氯乙酸的色谱图，图11的横坐标的单位长度为0.1，图11中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×103；
图12是沉淀蛋白试剂为6％磺基水杨酸色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.1，图12中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104。
实施例9：针对进样量的说明
图13对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为进样量不同。其中，图13中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图13是待测样品的进样量为0.1μL的色谱图，图13的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×101。
具体地，待测样品的进样量为0.1μL时信噪比为16.1，可满足定量要求，而超过10ul信号饱和，因此，本方案的进样量为0.1-10μL。
实施例10：针对沉淀蛋白试剂用量的说明
图14对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为沉淀蛋白试剂用量不同。其中，图14中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图14是沉淀蛋白试剂与第一上清液的比例为500：1的色谱图，图14的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×101。
具体地，沉淀蛋白试剂与第一上清液的比例小于5倍时，第一上清液的用量较少不变移取。沉淀蛋白试剂与第一上清液的比例为500倍时，L1点信噪比为25.4，沉淀蛋白试剂与第一上清液的比例大于500时，第一上清液被沉淀蛋白试剂过度稀释，这会导致无法保证定量检测。
实施例11：针对色谱柱的说明
图15至图18分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为对待测样品进行测试时所使用的色谱柱不同。其中，图15至图18中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图15是色谱柱为AglientExtend-C18的色谱图，图15的横坐标的单位长度为0.1，图15中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103；
图16是色谱柱为AglientXDB-C8的色谱图，图16的横坐标的单位长度为0.1，图16中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×103；
图17是色谱柱为SHIMADZU-SP-C18的色谱图，图17的横坐标的单位长度为0.1，图17中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103；
图18是色谱柱为Aglient-SB-Aq的色谱图，图18的横坐标的单位长度为0.1，图18中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×103。
实施例12：针对流动相的说明
图19至图22分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品的检测区别为流动相不同。其中，图19至图22中的色谱图中，位于上方的均内标物华法林-D5的色谱图，位于下方的均为华法林的色谱图。
图19是流动相为H2O-0.1％FA与MeOH-0.1％FA的色谱图，图19的横坐标的单位长度为0.1，图19中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103；
图20是流动相为H2O-10mM NH4AC与MeOH的色谱图，图20的横坐标的单位长度为0.1，图20中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103；
图21是流动相为：
H2O-0.1％FA+1mM NH4FA与MeOH-0.1％FA+1mM NH4FA的色谱图，图21的横坐标的单位长度为0.1，图21中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103；
图22是流动相为H2O-0.2％FA+4mM NH4FA与MeOH-0.2％FA，图22的横坐标的单位长度为0.1，图22中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×104，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×103。
通过图19至图22可见，洗脱流动相的有机相、水相中是否添加缓冲盐和甲酸对待测样品的检测影响较小，对于目标物和内标物的色谱峰的峰型影响较小，但是，洗脱流动相中添加缓冲盐和甲酸可以促进目标物和内标物的离子化，利于待测样品的检测。
需要说明的是，图2至图22的横坐标均为采集时间，纵坐标均为离子信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃····〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.华法林的检测方法，其特征在于，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有华法林和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液相色谱质谱联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的华法林和内标物的浓度，拟合华法林的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，所述待处理样品的取用量为2-10 μL；
向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
所述沉淀蛋白试剂选自甲醇溶液，所述沉淀蛋白试剂与所述第一上清液的体积比为1:8；
利用液相色谱质谱联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中华法林的浓度；
所述内标物为华法林-D5；
所述检测条件中的液相条件，包括：
色谱柱为Waters Atlantis dC18 2.1*50 mm 5 μm；Aglient Extend-C18 2.1*50 mm5 μm；2.1*50 mm 5 μm；Aglient XDB-C8 2.1*50 mm 5 μm；SHIMADZU-SP-C18 2.1*50 mm 5μm或Aglient-SB-Aq 2.1*50 mm 5 μm；
洗脱流动相为有机相和水相，其中，有机相为甲醇溶液；
柱温为18℃-50℃；
流速为0.2-0.6 mL/min；
所述洗脱流动相中的有机相与水相的比例为：
Figure 648414DEST_PATH_IMAGE001
所述洗脱流动相中的有机相中含有0-1 mmol/L的缓冲盐和0-0.5%的甲酸；
所述洗脱流动相中的水相中含有0-10 mmol/L的缓冲盐和0-0.5%的甲酸；
所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液相色谱质谱联用仪中的质谱检测器为ESI+检测模式；
所述液相色谱质谱联用仪中的离子源参数为：加热气流速:8-12L/min，雾化气流速:30-35 L/min，加热气温度:300-350℃，毛细管电压:3000-4000 V；
所述检测方法的检测限为0.077 ng/mL，定量限为0.23 ng/mL。
2.根据权利要求1所述的华法林的检测方法，其特征在于，
所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述第一检测结果中的华法林的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中的华法林的浓度与内标物的浓度的比值。
3.根据权利要求1或2所述的华法林的检测方法，其特征在于，
所述向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品，包括：
向所述第一上清液内加入含有内标物的内标工作液，在1500-2500rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min；
顺次向混合后的所述第一上清液中加入沉淀蛋白试剂，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合2-4min后，并在10000-15000rpm的转速下高速离心5-10min，取离心后的第二上清液作为待测样品。
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