CN111826430A - 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法 - Google Patents

一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111826430A
CN111826430A CN202010724836.1A CN202010724836A CN111826430A CN 111826430 A CN111826430 A CN 111826430A CN 202010724836 A CN202010724836 A CN 202010724836A CN 111826430 A CN111826430 A CN 111826430A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lncrna
genes
differential
pgcs
histone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010724836.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李碧春
张晨
左其生
张亚妮
孙红艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202010724836.1A priority Critical patent/CN111826430A/zh
Publication of CN111826430A publication Critical patent/CN111826430A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，属于生物技术领域。通过生物信息学分析将RNA‑seq和CHIP‑seq联合筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化酶共同调控的靶基因，为研究PGCs形成的表观遗传和遗传机制网络提供参考。

Description

一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的 方法
技术领域
本发明涉及一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，lncRNA调控机制集中于将染色质调节蛋白募集到基因组DNA位置上的研究。Rocha ST1等发现，删除Xist lncRNA的离散区域（BF-重复结构域）会减少Xi上PRC2的募集，但不会影响 XCI74诱导过程中整个Xi的转录沉默或Xist定位；Wang KC等发现HOTTIP通过与WDR5蛋白物理性互作调控H3K4me3组蛋白修饰活性激活基因表达。尽管现有研究已从单一的lncRNA功能研究转变为lncRNA与组蛋白修饰间的协同机制研究，但在鸡PGCs上lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控的靶基因的研究还未有挖掘。
作为***和卵子祖先的原始生殖细胞，因其独特的迁移方式成为鸟类的克隆、基因编辑和濒危鸟类的拯救工作的良好材料。然而鸡PGCs发生机制不清，导致体内分离和体外诱导均难以大量获取来满足实验需要。PGCs形成的过程取决于多网络精确调控，包括特异性转录因子，染色质修饰和信号传导等途径。研究表明，lncRNA通过多种机制调控基因的表达，包括与转录因子结合调控基因启动；与miRNA形成内源性竞争机制等。尽管现有研究已从单一的lncRNA功能研究转变为lncRNA与组蛋白修饰间的协同机制研究，但也仅仅停留在lncRNA募集单个染色质调节蛋白发挥功能。在PGCs形成中lncRNA和组蛋白甲基化酶共同调控的靶基因还未有研究。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，通过生物信息学分析将RNA-seq和CHIP-seq联合筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化酶共同调控的靶基因，为研究PGCs形成的表观遗传和遗传机制网络提供参考。
本发明的技术方案如下：
一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，包括：在鸡PGCs中分别干扰lncRNA和过表达lncRNA，培养48h后，观察荧光表达情况。提取RNA，进行RNA-seq测序。将获得的测序结果进行分析，按照 log2（Fold Change）>1或<-1，P <0.05的原则获得差异上调/下调的基因，对差异基因分别进行COG，GO注释和KEGG通路分析。
首先对差异基因的功能和参与的信号通路进行大致的分析。利用获得的差异上调/下调基因与组蛋白甲基化（H3K4me2）在PGCs上的CHIP-seq富集的基因进行Venny分析，GO注释和KEGG通路分析，获得与PGCs相关的关键信号通路。将其中的差异基因进行热图分析，分析其在不同处理中的RPKM值变化，筛选出干扰/过表达lncRNA后变化显著的差异基因。结合ESCs和PGCs的RNA-seq数据，筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化（H3K4me2）调控且在PGCs中高表达的差异基因。
接着利用在线CHIP-seq数据库（http://cistrome.org/db/#/）对差异基因进行分析，选择Mll2组蛋白甲基化酶复合体（ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5/MLL2）作为CHIP-seq的拉取蛋白进行生物信息分析。此时，可获得组蛋白甲基化酶在不同差异基因中富集的评分，选择评分高的富集蛋白进行验证。
利用RIP 实验验证lncRNA和组蛋白甲基化酶的结合，利用CHIP-qPCR验证组蛋白甲基化酶和差异基因的结合，。利用CHOP-qPCR验证lncRNA和差异基因的结合。通过以上步骤可确定lncRNA和组蛋白甲基化共调控的关键靶基因。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法简单可行，具有较高的可行性，研究中分析流程清晰明了，研究思路清楚，研究步骤易操作，具有广泛的应用性。实验者可通过实验进行研究寻找lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控的靶基因，也可通过网络公共数据库按照本方法分析共调控靶基因，操作方便，应用领域广阔。
具体实施方式
筛选干扰/过表达lncRNA后差异表达基因
在鸡PGCs中分别干扰lncRNA和过表达lncRNA，培养48h后，观察荧光表达情况。提取RNA，进行RNA-seq测序。经过主成分分析，热图分析，火山图分析后，可发现干扰/过表达lncRNA后，产生大量差异基因（差异基因筛选原则：log2（Fold Change）>1或<-1，P <0.05）。分别对lncRNA干扰后降低和lncRNA过表达后升高的基因进行COG,GO注释和KEGG通路分析，主要对结果中涉及的细胞增殖、分化、发育相关的生物学过程和信号通路进行研究。说明干扰/过表达lncRNA后影响PGCs细胞正常发育和生长。
．筛选受lncRNA调控且存在组蛋白甲基化富集的差异基因
将上述获得的干扰/过表达lncRNA后，下调/上调的差异基因与PGCs上的CHIP-seq富集的基因进行Venny分析，此时可获得既受lncRNA调控又存在H3K4me2富集的差异基因。对获得的差异基因进行Venny分析，GO注释和KEGG通路分析，获得与PGCs相关的关键信号通路和生物学过程。将其中富集的差异基因在按照RNA-seq数据进行热图分析，分析在不同处理中差异基因的表达情况，筛选出干扰/过表达lncRNA后变化显著的差异基因。结合ESCs和PGCs的RNA-seq数据，筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化（H3K4me2）调控且在PGCs中高表达的差异基因。
筛选存在组蛋白甲基化酶结合且受lncRNA调控的差异基因
利用在线CHIP-seq数据库（http://cistrome.org/db/#/）对差异基因进行分析，选择Mll2组蛋白甲基化酶复合体（ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5/MLL2）作为CHIP-seq的拉取蛋白进行生物信息分析。此时，可获得组蛋白甲基化酶在不同差异基因中富集的评分，选择评分高的富集蛋白进行验证。
4.验证PGCs中同时lncRNA和组蛋白甲基化酶调控的靶基因
对筛选到的候选靶基因进行生物信息学分析，根据其启动子区的长度将其分为200bp的截短片段，根据片段设计引物。在PGCs中分别转染ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5的标签载体，培养48h后，收集样品进行裂解。利用CHIP试剂盒进行CHIP-qPCR实验，验证组蛋白甲基化酶与靶基因启动子区的结合。同时构建lncRNA的生物素标签载体转染PGCs，培养48h后，收集样品进行CHOP实验，验证lncRNA和靶基因启动子区的结合。在PGCs中同时转染ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5标签载体和lncRNA过表达载体，培养48h后，收集样本进行RIP实验，验证lncRNA和组蛋白甲基化酶的结合。通过以上实验可验证lncRNA可与组蛋白甲基化酶结合形成复合体募集到靶基因的启动子区调控其表达。

Claims (6)

1.一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，包括以下步骤：
1）筛选干扰/过表达lncRNA后差异表达基因；
2）筛选受lncRNA调控且存在组蛋白甲基化富集的差异基因；
3）筛选存在组蛋白甲基化酶结合且受lncRNA调控的差异基因；
4）验证PGCs中同时lncRNA和组蛋白甲基化酶调控的靶基因。
2.根据权利要求1所述的一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，步骤1）：
在鸡PGCs中分别干扰lncRNA和过表达lncRNA，培养48h后，观察荧光表达情况；提取RNA，进行RNA-seq测序；将获得的测序结果进行分析，按照差异基因筛选原则获得差异上调/下调的基因，对差异基因分别进行COG，GO注释和KEGG通路分析。
3.根据权利要求2所述的一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，步骤2）：
对差异基因的功能和参与的信号通路进行大致的分析，利用获得的差异上调/下调基因与组蛋白甲基化在PGCs上的CHIP-seq富集的基因进行Venny分析，GO注释和KEGG通路分析，获得与PGCs相关的关键信号通路；将其中的差异基因进行热图分析，分析其在不同处理中的RPKM值变化，筛选出干扰/过表达lncRNA后变化显著的差异基因；结合ESCs和PGCs的RNA-seq数据，筛选出受lncRNA和组蛋白甲基化调控且在PGCs中高表达的差异基因。
4.根据权利要求4所述的一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，步骤3）：
利用在线CHIP-seq数据库对差异基因进行分析，选择Mll2组蛋白甲基化酶复合体ASH2L/DPY30/RBBP5/WDR5/MLL2作为CHIP-seq的拉取蛋白进行生物信息分析；此时，可获得组蛋白甲基化酶在不同差异基因中富集的评分，选择评分高的富集蛋白进行验证。
5.根据权利要求4所述的一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，步骤4）：
利用RIP 实验验证lncRNA和组蛋白甲基化酶的结合，利用CHIP-qPCR验证组蛋白甲基化酶和差异基因的结合，利用CHOP-qPCR验证lncRNA和差异基因的结合；通过以上步骤可确定lncRNA和组蛋白甲基化共调控的关键靶基因。
6.根据权利要求2所述的一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法，其特征是，步骤1）中，差异基因筛选原则：log2（Fold Change）>1或<-1，P <0.05。
CN202010724836.1A 2020-07-24 2020-07-24 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法 Pending CN111826430A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010724836.1A CN111826430A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010724836.1A CN111826430A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111826430A true CN111826430A (zh) 2020-10-27

Family

ID=72924819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010724836.1A Pending CN111826430A (zh) 2020-07-24 2020-07-24 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111826430A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265450A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 扬州大学 一种研究组蛋白H3K4me2酶/转录因子复合体调控靶基因转录的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838791A (zh) * 2016-04-21 2016-08-10 扬州大学 一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA 的分析方法
US20170056524A1 (en) * 2014-03-13 2017-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeted epigenetic modification
CN106754924A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 南京医科大学 一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
CN108220434A (zh) * 2017-12-13 2018-06-29 南京医科大学第二附属医院 一种长链非编码rna及其组合物在诊断/治疗胆管癌中的应用
CN109486817A (zh) * 2018-11-13 2019-03-19 南京医科大学第二附属医院 一种长链非编码rna及其组合物在诊断治疗胆管癌中的应用
CN110343752A (zh) * 2019-07-03 2019-10-18 扬州大学 一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法
US20190390253A1 (en) * 2016-12-22 2019-12-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170056524A1 (en) * 2014-03-13 2017-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeted epigenetic modification
CN105838791A (zh) * 2016-04-21 2016-08-10 扬州大学 一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA 的分析方法
CN106754924A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 南京医科大学 一种长非编码rna及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用
US20190390253A1 (en) * 2016-12-22 2019-12-26 Guardant Health, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
CN108220434A (zh) * 2017-12-13 2018-06-29 南京医科大学第二附属医院 一种长链非编码rna及其组合物在诊断/治疗胆管癌中的应用
CN109486817A (zh) * 2018-11-13 2019-03-19 南京医科大学第二附属医院 一种长链非编码rna及其组合物在诊断治疗胆管癌中的应用
CN110343752A (zh) * 2019-07-03 2019-10-18 扬州大学 一种研究PGCs分化过程中Wnt信号与组蛋白联合作用于靶基因机制的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙甜甜等: "长非编码RNA与其他表观遗传机制在肿瘤中的相互调控", 《上海交通大学学报(医学版)》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265450A (zh) * 2021-06-11 2021-08-17 扬州大学 一种研究组蛋白H3K4me2酶/转录因子复合体调控靶基因转录的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Single-cell sequencing for precise cancer research: progress and prospects
Scherl et al. Functional proteomic analysis of human nucleolus
WO2018199589A1 (ko) 위암의 생물학적 특성에 기반한 군 구분 및 예후 예측 시스템
CN107435070A (zh) 拷贝数变异的检测和分类
Londei et al. Ribosome biogenesis in archaea
KR20200001159A (ko) 고추 과피의 신미 정도를 판별하기 위한 마커 및 이의 용도
Austin et al. Translational advances in the field of pulmonary hypertension molecular medicine of pulmonary arterial hypertension. From population genetics to precision medicine and gene editing
Su et al. ATAC-Seq-based identification of extrachromosomal circular DNA in mammalian cells and its validation using inverse PCR and FISH
CN111826430A (zh) 一种研究鸡PGCs中lncRNA和组蛋白甲基化酶共调控靶基因的方法
Liu et al. Technologies and applications of single-cell DNA methylation sequencing
Austin et al. Molecular medicine of pulmonary arterial hypertension: from population genetics to precision medicine and gene editing
Deryusheva et al. “Lost and found”: snoRNA annotation in the Xenopus genome and implications for evolutionary studies
Lu et al. DNA methylation dynamics of sperm cell lineage development in tomato
CN105209642A (zh) 基因组测序和表观遗传分析的方法
WO2017035821A1 (zh) RNA 5mC重亚硫酸盐测序的文库构建方法及其应用
WO2023060539A1 (en) Compositions and methods for detecting target cleavage sites of crispr/cas nucleases and dna translocation
CN110520540A (zh) 核酸修饰和鉴定方法
CN113174441B (zh) 一种鸭剩余采食量相关的lncRNA及其应用
Wu et al. Innovative insights into extrachromosomal circular DNAs in gynecologic tumors and reproduction
CN106520758A (zh) 一种萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNA的筛选与鉴定方法
Lin et al. Scalable CRISPR-Cas9 chemical genetic screens in non-transformed human cells
US20200190567A1 (en) Method For Detecting Activity Change Of Transposon In Plant Before And After Stress Treatment
Yoo et al. An optimized method for the construction of a DNA methylome from small quantities of tissue or purified DNA from arabidopsis embryo
Huang et al. Xie
CN107893122A (zh) 一种捕获染色质短片段之间相互作用位点的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201027