CN111826393B - 一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用，属于基因工程技术领域。OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻粒型和/或粒重中的应用。OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐盐性和或耐热性中的应用。实验表明，OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1通过负调控作用影响水稻的抗性或粒型粒重。

Description

一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用。

背景技术

水稻是重要粮食作物之一，同时也是单子叶植物研究的模式植物，世界上有近一半的人口以其为主食(Sakamoto and Matsuoka 2008)。但是，随着全球人口的不断增长，而耕地面积不断减少，如何保持水稻产量的相应增长已成了一个重大挑战。粒重是决定作物产量的主要因素之一，它与粒形和籽粒灌浆密切相关(Xing and Zhang 2010)。尽管已有一些与粒形粒重相关的QTL位点和基因被克隆，然而对这些基因的功能研究大多仍处在相互独立的情况，其相互之间关系并不是太清楚，且多数都与植物激素相关(Zuo and Li 2014；Li et al.2018)。例如，TGW6通过影响生长素供应来调控细胞数目和粒长粒重(Ishimaruet al.2013)；BG1通过激活生长素的转运来增大籽粒(Liu et al.2015)；GL2能通过激活油菜素内酯信号来增大籽粒(Che et al.2015)；GW5/GSE5也同样能通过增强BR信号来增大籽粒(Duan et al.2016；Liu et al.2017)。除了生长素和油菜素内酯以外，细胞***素在调控籽粒大小方面也有着显著的作用。细胞***素氧化酶/脱氢酶OsCKX4，具有降解细胞***素的功能，其显性激活突变体ren1-D由于细胞***素含量下降，籽粒变小(Gao etal.2014)；BG3/OsPUP4及其同源蛋白OsPUP7通过调控细胞***素的转运来增大籽粒(Xiaoet al.2018)。

实际上，细胞***素在植物的生长发育过程中起着诸多不可或缺的作用，包括细胞***分化、叶片衰老、营养分配、瘤状物的形成、逆境应答和生长素的作用及分布等等(Osugi and Sakakibara 2015)。细胞***素不仅对水稻籽粒大小和穗粒数有着重要调控作用之外，在耐逆方面的调控效果也非常显著。OsAHP1和OsAHP2的干涉植株，由于细胞***素信号减弱，表现出一系列细胞***素缺乏的表型，包括节间变短、侧根增加、早衰、分糵减少、育性下降，此外，对盐的敏感性增加(Sun et al.2014)。OsCKX2的干涉植株中的细胞***素增加，对盐的抗性增强(Joshi et al.2017)。受成熟和胁迫诱导表达基因SARK的启动子驱动细胞***素合成基因IPT表达，能够提高水稻植株的耐干旱能力(Reguera etal.2013)。高温会显著降低水稻高温敏感品种穗中的细胞***素含量，施加外源细胞***素可以减轻高温热害(Wu et al.2016；Wu et al.2017)。尽管如此，细胞***素相关基因对水稻耐高温的调控还少有报道。

由于细胞***素能在木质部和韧皮部中进行运输，那么高等植物体内应该存在着负责跨膜转运细胞***素的导入和导出***(Cedzich et al.2008；Hirose et al.2008)。在拟南芥中，ATP-结合盒转运蛋白亚家族G14(ABCG14)位于细胞膜上，主要在根的维管组织中表达，能将细胞***素向维管组织中转运，参与了细胞***素由根向地上部的运输(Koet al.2014；Zhang et al.2014)。ABCG18在水稻中的同源蛋白也有类似的功能(Zhao etal.2005)。蛋白平衡性核苷酸转运蛋白(ENT)在酵母中具有转运核苷态的iP和tZ的能力，这类蛋白包括拟南芥中的AtENT3、AtENT6和AtENT7，以及水稻中的OsENT2(Hirose etal.2005；Hirose et al.2008)。此外，嘌呤通透酶(PUP)家族蛋白被认为是具有转运细胞***素能力的一类蛋白(Gillissen et al.2000；Burkle et al.2003；Qi and Xiong 2013；Girke et al.2014)。AtPUP1在酵母中具有转运腺嘌呤的能力，也能够转运包括tZ在内的细胞***素(Burkle et al.2003)。竞争性抑制实验的结果表明，AtPUP2同样能转运细胞***素(Burkle et al.2003)。AtPUP14也具有转运细胞***素的能力，其定位在细胞膜上，能够将具有生物学活性的细胞***素导入细胞内，从而减少了可供膜受体识别的细胞***素含量(Zurcher et al.2016)。在水稻中，也有一个成员OsPUP7能够在酵母中转运细胞***素的衍生物咖啡因，其相关突变体中细胞***素含量升高暗示了它具有转运细胞***素的潜在功能(Qi and Xiong 2013)。最新的研究结果表明，OsPUP7的同源蛋白BG3/OsPUP4能与其协同作用，共同参与细胞***素向维管组织中的转运(Xiao et al.2018)。然而还没有关于OsPUP1蛋白在转运细胞***素中的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种OsPUP1基因或其编码蛋白的新应用，OsPUP1基因或其编码蛋白在调控水稻粒型粒重和/或抗性中的应用。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻粒型和/或粒重中的应用。

优选的，所述水稻粒型包括水稻的粒宽。

优选的，所述OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1通过负调控作用影响水稻粒型和/或粒重。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐热性中的应用。

优选的，所述OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1通过负调控作用影响水稻的耐热性。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐盐性中的应用。

优选的，所述OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1通过负调控作用影响水稻的耐盐性。

优选的，所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的OsPUP1基因或其编码蛋白在调控水稻粒型和/或粒重中的应用。通过构建OsPUP1过表达水稻，对水稻籽粒进行分析表明，与野生型水稻(WT)相比，OsPUP1过表达植株(OE)表现出粒宽变小、千粒重下降的情况，且与OsPUP1基因表达量成正相关(图1)。结果说明OsPUP1对粒宽和粒重有着显著的负调控作用。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐热性中的应用。将出芽后的OsPUP1过表达水稻和野生型中花11的种子生长10d后，用45℃(12h光照/12h黑暗)进行高温处理，处理29h后移出至28℃恢复生长。7d后统计幼苗的成活率。与野生型水稻相比，OsPUP1过表达植株(OE)在高温处理后的幼苗成活率显著下降。说明OsPUP1能显著负调控水稻耐热性。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐盐性中的应用。OsPUP1过表达水稻和野生型中花11，用含200mM NaCl的木村B营养液处理45h后，用正常的木村B营养液培养7d，然后统计幼苗的成活率。与野生型水稻相比，OsPUP1过表达水稻(OE)在盐处理后的幼苗成活率显著下降。结果说明OsPUP1能显著负调控水稻耐盐性。

附图说明

图1为OsPUP1过表达植株的粒型粒重，其中A、籽粒外观图；B、粒长分析；C、粒宽分析；D、干粒重分析；E、OsPUP1基因表达量分析；用t-test进行显著性分析，**表示P<0.01；

图2为OsPUP1过表达植株的耐热性分析，其中A、高温处理前；B、高温处理后恢复；C、成活率分析；用t-test进行显著性分析，**表示P<0.01；

图3为OsPUP1过表达植株的耐盐性分析；A、盐处理后恢复；B、成活率分析；用t-test进行显著性分析，**表示P<0.01；

图4为实时荧光定量PCR分析OsPUP1在水稻各组织中的表达模式；

图5为GUS染色分析OsPUP1的表达模式；A、整体根；B、根横切面；C、茎横切面；D、叶横切面；E、颖壳横切面；

图6为OsPUP1在水稻原生质体中的亚细胞定位分析；ER表示内质网，BF表示明场。

具体实施方式

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻粒型和/或粒重中的应用。

在本发明中，所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(acccaagcagattaagctaattaactaccatcaacacaccctaatccaaaggtgccaagcttgcaggaaacagtaagctagctagcagtctagcactgcttcatttgatcatggccaccattactgctgctagtcccagacccagtgctgctcctgcagccatggaagagaccagcaaggcgatgcctactagcgagtggcctgccgccagcggcggcaatgcgtcgccgccggcgaggtcccggccgtcgctgctggtcatattcagcgcgtgcctcgtcctcctcggcgccggcgggccgctcctcctccgcgtctacttcgtgcacggcgggacccggctgtggctgtccgccacgctccagatctccggctggccgctgctgctgccgccgctgtgcgtgtcgctctaccgcggccgcaggcacgggatcggcaacctcctcctcccgcggcgcctcgtcggcgccgccgccgtgctcggcgggctgtacgccgtgtcgtgcttcgtgtacgcgctggggtcgcaggcgctgccgctgtccacgtcgtcgctgctgctggcgacgcagctggccttcaccgccgtgttcgcgttcctcttcgtgggcctccggttcacgccgttctcggccaacgccgtcgtgctgctcaccatcggcccggcggtgctgggcgtcgggccgtcgtcggggaagccggcgggggagtcctccagggcgtactggacggggttctgcgaggccatcggcgcggcggcgctagccgggctggtgatcccgctcgtcgaggtcgccacggcgaggtacgggcgccgcacggggcccgcggcgagggtgccgcctccctacgcgacggtgatgcagatgcaggcggtgatgggcgcggcgggcacggcggtgtgcgtgctcggcatggcgatcaagggcgacttccaggcggtggcgcgggaagcggcggcgttcgggctcggcgcggccaactactacctcgtcctcgcctgggacgccgtgtcgtggcagctgctcaacctgggcatcatggggctcatcacctgcgcgtcgtcgctgctcgccggcatcatgatcgccgtgctcctgccgctctcgcaggtcctcgccgtcatcttcctccacgagaagttcgacgggacgaagggcatcgcgctcgtgctctcgctctggggattcgcctcctacctctacggcgagaaggcgcagaagaagaaggaggcgcagaagatgcgcgagcgcgagcaggaggtggcgctggcacagaagaccgcagacgtggagtcagcggcgccttagtttacaatgggattgtacgtgtctacttgggtgggtcgtatacatatttacgggtgtagtgaacatgtttctcagtgtagttttacagtacagtggcatgcataaattttgtacgagattgtttcaaattctgtatgacattgtttcattatatggtactagcacgcagaaaaagcaagtgctatagttgtatcaac)。所述OsPUP1基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示(atggccaccattactgctgctagtcccagacccagtgctgctcctgcagccatggaagagaccagcaaggcgatgcctactagcgagtggcctgccgccagcggcggcaatgcgtcgccgccggcgaggtcccggccgtcgctgctggtcatattcagcgcgtgcctcgtcctcctcggcgccggcgggccgctcctcctccgcgtctacttcgtgcacggcgggacccggctgtggctgtccgccacgctccagatctccggctggccgctgctgctgccgccgctgtgcgtgtcgctctaccgcggccgcaggcacgggatcggcaacctcctcctcccgcggcgcctcgtcggcgccgccgccgtgctcggcgggctgtacgccgtgtcgtgcttcgtgtacgcgctggggtcgcaggcgctgccgctgtccacgtcgtcgctgctgctggcgacgcagctggccttcaccgccgtgttcgcgttcctcttcgtgggcctccggttcacgccgttctcggccaacgccgtcgtgctgctcaccatcggcccggcggtgctgggcgtcgggccgtcgtcggggaagccggcgggggagtcctccagggcgtactggacggggttctgcgaggccatcggcgcggcggcgctagccgggctggtgatcccgctcgtcgaggtcgccacggcgaggtacgggcgccgcacggggcccgcggcgagggtgccgcctccctacgcgacggtgatgcagatgcaggcggtgatgggcgcggcgggcacggcggtgtgcgtgctcggcatggcgatcaagggcgacttccaggcggtggcgcgggaagcggcggcgttcgggctcggcgcggccaactactacctcgtcctcgcctgggacgccgtgtcgtggcagctgctcaacctgggcatcatggggctcatcacctgcgcgtcgtcgctgctcgccggcatcatgatcgccgtgctcctgccgctctcgcaggtcctcgccgtcatcttcctccacgagaagttcgacgggacgaagggcatcgcgctcgtgctctcgctctggggattcgcctcctacctctacggcgagaaggcgcagaagaagaaggaggcgcagaagatgcgcgagcgcgagcaggaggtggcgctggcacagaagaccgcagacgtggagtcagcggcgccttag)。所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(MATITAASPRPSAAPAAMEETSKAMPTSEWPAASGGNASPPARSRPSLLVIFSACLVLLGAGGPLLLRVYFVHGGTRLWLSATLQISGWPLLLPPLCVSLYRGRRHGIGNLLLPRRLVGAAAVLGGLYAVSCFVYALGSQALPLSTSSLLLATQLAFTAVFAFLFVGLRFTPFSANAVVLLTIGPAVLGVGPSSGKPAGESSRAYWTGFCEAIGAAALAGLVIPLVEVATARYGRRTGPAARVPPPYATVMQMQAVMGAAGTAVCVLGMAIKGDFQAVAREAAAFGLGAANYYLVLAWDAVSWQLLNLGIMGLITCASSLLAGIMIAVLLPLSQVLAVIFLHEKFDGTKGIALVLSLWGFASYLYGEKAQKKKEAQKMREREQEVALAQKTADVESAAP*)。

在本发明中，通过分析统计过表达OsPUP1基因的水稻籽粒的粒长和粒宽发现，OsPUP1基因能显著降低水稻粒宽性状。同时对过表达OsPUP1基因的水稻籽粒的千粒重进行统计分析发现，OsPUP1基因能显著降低水稻千粒重的性状。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐热性中的应用。

在本发明中，所述OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1优选通过负调控作用影响水稻的耐热性。所述耐热性，是采用45℃高温处理水稻。所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述OsPUP1基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐盐性中的应用。

在本发明中，所述OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1优选通过负调控作用影响水稻的耐盐性。所述耐盐性是采用含200mM NaCl的溶液处理水稻。所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述OsPUP1基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，为了明确OsPUP1在水稻各组织中表达情况，针对OsPUP1基因进行实时荧光定量PCR，检测水稻各组织中OsPUP1基因在转录水平上的表达量，结果表明，OsPUP1基因在水稻各组织中均有表达，而在根中表达最高，在穗中的表达量随着穗的发育不断增加。通过进一步GUS染色分析，表明OsPUP1主要在水稻的维管组织表达并发挥功能。通过亚细胞定位分析表明OsPUP1定位在内质网上。

下面结合实施例对本发明提供的一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

OsPUP1过表达水稻植株的构建及功能验证

一、重组植物表达载体pCAMBIA2301-Actin/OsPUP1的构建

从水稻数据库Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)获得OsPUP1(LOC_Os03g08880.1)的基因序列、编码序列及编码蛋白氨基酸序列。提取粳稻中花11的总RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，采用下述引物序列对OsPUP1的编码序列进行PCR扩增，反应体系为50μL：1μL KOD FX(TOYOBO)、25μL 2×PCRbuffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、2.5μL 10pM/μL引物F、2.5μL 10pM/μL引物R、2μL cDNA模板、7μL ddH₂O；反应程序：94℃预变性3min，94℃变性15sec、58℃退火20sec、68℃延伸120sec，扩增35个循环。扩增采用的引物两端分别引入pCAMBIA2301-Actin中限制性内切酶XbaI和PstI的识别位点(如下划线所示)，引物序列如下：

F：5'-CCGGGGATCCTCTAGAATGGCCACCATTACTGCT-3'(SEQ ID No.4)；

R：5'-AAAGCAGGGCATGCCTGCAGCTAAGGCGCCGCTGACTC-3'(SEQ ID No.5)。

利用同源重组酶将PCR产物与用XbaI和PstI酶切后的pCAMBIA2301-Actin线性载体进行连接。将经测序表明pCAMBIA2300-Actin载体的酶切位点XbaI和PstI之间的小片段替换为OsPUP1的编码序列后所得的重组载体命名为pCAMBIA2300-Actin/OsPUP1。

二、OsPUP1过表达水稻植株的获得

将步骤一构建的重组植物表达载体pCAMBIA2300-Actin/OsPUP1转入农杆菌AGL1中，再侵染粳稻品种中花11的愈伤组织，具体的转化筛选方法参见文献(易自力,曹守云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358)。最终获得转入pCAMBIA2300-Actin/OsPUP1的水稻植株。进一步通过对后代单株进行G418抗性筛选，鉴定出OsPUP1过表达纯系植株。

实施例2

OsPUP1过表达植株的籽粒分析

在田间自然条件下种植OsPUP1过表达植株和野生型中花11。对它们的种子粒型粒重进行统计分析。

结果表明，与野生型水稻(WT)相比，OsPUP1过表达植株(OE)表现出粒宽变小、千粒重下降，且与OsPUP1基因表达量成正相关(图1)。这一结果说明OsPUP1对粒宽和粒重有着显著的负调控作用。

实施例3

OsPUP1过表达植株的耐热性分析

将出芽后的OsPUP1过表达植株和野生型中花11的种子播于PCR板，用木村B营养液在28℃(12h光照/12h黑暗)光照培养箱中进行水培。生长10d后，用45℃(12h光照/12h黑暗)进行高温处理，处理29h后移出至28℃(12h光照/12h黑暗)进行恢复生长。恢复生长7d后统计幼苗的成活率。

结果表明，与野生型相比，OsPUP1过表达植株(OE)在高温处理后的幼苗成活率显著下降(图2)。这一结果说明OsPUP1能显著负调控水稻耐热性。

实施例4

OsPUP1过表达植株的耐盐性分析

将出芽后的OsPUP1过表达植株和野生型中花11的种子播于PCR板，用木村B营养液在28℃(12h光照/12h黑暗)光照培养箱中进行水培。生长10d后，用含200mM NaCl的木村B营养液对它们进行盐处理，处理45h后，用正常的木村B营养液培养7d，然后统计幼苗的成活率。

结果表明，与野生型相比，OsPUP1过表达植株(OE)在盐处理后的幼苗成活率显著下降(图3)。这一结果说明OsPUP1能显著负调控水稻耐盐性。

实施例5

实时荧光定量PCR分析OsPUP1在水稻各组织中表达情况

本实施例中所涉及的OsPUP1基因来源于水稻(Oryza sativa L.)，从粳稻品种中花11的根、茎、叶片、叶鞘和穗中分别提取总RNA并反转录得到cDNA。进而以cDNA为模板，针对OsPUP1基因进行实时荧光定量PCR，反应体系为20μL：10μl TB

Premix Ex Taq^TMII(TAKARA)，1μL 10pM/μL引物F、1μL 10pM/μL引物R、1μl cDNA模板、7μl ddH₂O；PCR反应程序：95℃预变性1min，95℃变性5sec、60℃退火10sec、72℃延伸1min，扩增45个循环，延伸过程进行荧光采集，反应结束后设定读熔解曲线。数据的计算采用Comparative Ct方法。以Ubiquitin2作为PCR内参。每个基因扩增时进行三次生物学重复。检测水稻各组织中OsPUP1基因在转录水平上的表达量。实验设置3次重复，结果取平均值。

用于检测OsPUP1基因的引物序列如下：

qOsPUP1-F：5'-TCGCCGTCATCTTCCTCCA-3'(SEQ ID No.6)；

qOsPUP1-R：5'-CGTCTGCGGTCTTCTGTG-3'(SEQ ID No.7)。

以Ubiquitin2作为内参基因，其引物序列为：

Ubiquitin2-F：5'-GAGCCTCTGTTCGTCAAGTA-3'(SEQ ID No.8)；

Ubiquitin2-R：5'-ACTCGATGGTCCATTAAACC-3'(SEQ ID No.9)。

将Ubiquitin2的表达量视为参照，计算OsPUP1基因的相对表达量。

qRT-PCR分析表明，OsPUP1基因在水稻各组织中均有表达，而在根中表达最高，在穗中的表达量随着穗的发育不断增加(图4)。

实施例6

GUS染色分析OsPUP1在水稻各组织中表达情况

一、重组植物表达载体pCAMBIA2391Z/pOsPUP1的构建

提取粳稻中花11的基因组DNA，然后以其为模板，采用下述引物序列对OsPUP1的起始字码子上游2091bp的启动子序列进行PCR扩增，反应体系为50μL：1μL KOD FX(TOYOBO)、25μL 2×PCRbuffer forKOD FX、10μL 2mM dNTPs、2.5μL 10pM/μL引物F、2.5μL 10pM/μL引物R、2μL cDNA模板、7μL ddH₂O；反应程序：94℃预变性3min，94℃变性15sec、58℃退火20sec、68℃延伸120sec，扩增35个循环。扩增采用的引物两端分别引入pCAMBIA2391Z中限制性内切酶PstI和BamHI的识别位点(如下划线所示)，引物序列如下：

F：5'-TACGCCAAGCTTGGCTGCAGCTTCTAGGCTTCTAGCACT-3'(SEQ ID No.10)；

R：5'-GAATTCCCGGGGATCCGATCAAATGAAGCAGTGCT-3'(SEQ ID No.11)。

利用同源重组酶将PCR产物与用PstI和BamHI酶切后的pCAMBIA2391Z线性载体进行连接。将经测序表明pCAMBIA2391Z载体的酶切位点PstI和BamHI之间的小片段替换为OsPUP1的启动子序列后所得的重组载体命名为pCAMBIA2391Z/pOsPUP1。

二、转基因水稻植株各组织的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色分析

将步骤一构建的重组植物表达载体pCAMBIA2391Z/pOsPUP1转入农杆菌AGL1中，再侵染粳稻品种中花11的愈伤组织。最终获得转入pCAMBIA2391Z/pOsPUP1转基因水稻植株。对阳性植株的根、茎、叶、颖壳进行染色后发现，信号主要出现在各组织的维管组织(图5)，说明OsPUP1主要在水稻的维管组织表达并发挥功能。

实施例7

OsPUP1的亚细胞定位分析

提取粳稻中花11的总RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，采用下述引物序列对OsPUP1的编码序列进行PCR扩增，反应体系为50μL：1μL KOD FX(TOYOBO)、25μL 2×PCRbuffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、2.5μL 10pM/μL引物F、2.5μL 10pM/μL引物R、2μLcDNA模板、7μL ddH₂O；反应程序：94℃预变性3min，94℃变性15sec、58℃退火20sec、68℃延伸120sec，扩增35个循环。扩增采用的引物两端分别引入pCAMBIA2300-35S-GFP中限制性内切酶BamHI和XbaI的识别位点(如下划线所示)，引物序列如下：

F：5'-CAAGGAGCTCGGATCCATGGCCACCATTACTGCT-3'(SEQ ID No.12)；

R：5'-GCAGGTCGACTCTAGACTAAGGCGCCGCTGACTC-3'(SEQ ID No.13)。

利用同源重组酶将PCR产物与用BamHI和XbaI酶切后的pCAMBIA2301-35S-GFP线性载体进行连接。将经测序表明pCAMBIA2301-35S-GFP载体的酶切位点BamHI和XbaI之间的小片段替换为OsPUP1的编码序列后所得的重组载体命名为pCAMBIA2300-35S-GFP/OsPUP1。然后将其转入水稻原生质体，培养后用激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示，当将重组质粒pCAMBIA2300-35S-GFP/OsPUP1与内质网标签ER-RFP质粒进行共转化时，GFP-OsPUP1的荧光能与ER-RFP的荧光共定位，这一结果证明OsPUP1定位在内质网上(图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1507

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccaagcag attaagctaa ttaactacca tcaacacacc ctaatccaaa ggtgccaagc 60

ttgcaggaaa cagtaagcta gctagcagtc tagcactgct tcatttgatc atggccacca 120

ttactgctgc tagtcccaga cccagtgctg ctcctgcagc catggaagag accagcaagg 180

cgatgcctac tagcgagtgg cctgccgcca gcggcggcaa tgcgtcgccg ccggcgaggt 240

cccggccgtc gctgctggtc atattcagcg cgtgcctcgt cctcctcggc gccggcgggc 300

cgctcctcct ccgcgtctac ttcgtgcacg gcgggacccg gctgtggctg tccgccacgc 360

tccagatctc cggctggccg ctgctgctgc cgccgctgtg cgtgtcgctc taccgcggcc 420

gcaggcacgg gatcggcaac ctcctcctcc cgcggcgcct cgtcggcgcc gccgccgtgc 480

tcggcgggct gtacgccgtg tcgtgcttcg tgtacgcgct ggggtcgcag gcgctgccgc 540

tgtccacgtc gtcgctgctg ctggcgacgc agctggcctt caccgccgtg ttcgcgttcc 600

tcttcgtggg cctccggttc acgccgttct cggccaacgc cgtcgtgctg ctcaccatcg 660

gcccggcggt gctgggcgtc gggccgtcgt cggggaagcc ggcgggggag tcctccaggg 720

cgtactggac ggggttctgc gaggccatcg gcgcggcggc gctagccggg ctggtgatcc 780

cgctcgtcga ggtcgccacg gcgaggtacg ggcgccgcac ggggcccgcg gcgagggtgc 840

cgcctcccta cgcgacggtg atgcagatgc aggcggtgat gggcgcggcg ggcacggcgg 900

tgtgcgtgct cggcatggcg atcaagggcg acttccaggc ggtggcgcgg gaagcggcgg 960

cgttcgggct cggcgcggcc aactactacc tcgtcctcgc ctgggacgcc gtgtcgtggc 1020

agctgctcaa cctgggcatc atggggctca tcacctgcgc gtcgtcgctg ctcgccggca 1080

tcatgatcgc cgtgctcctg ccgctctcgc aggtcctcgc cgtcatcttc ctccacgaga 1140

agttcgacgg gacgaagggc atcgcgctcg tgctctcgct ctggggattc gcctcctacc 1200

tctacggcga gaaggcgcag aagaagaagg aggcgcagaa gatgcgcgag cgcgagcagg 1260

aggtggcgct ggcacagaag accgcagacg tggagtcagc ggcgccttag tttacaatgg 1320

gattgtacgt gtctacttgg gtgggtcgta tacatattta cgggtgtagt gaacatgttt 1380

ctcagtgtag ttttacagta cagtggcatg cataaatttt gtacgagatt gtttcaaatt 1440

ctgtatgaca ttgtttcatt atatggtact agcacgcaga aaaagcaagt gctatagttg 1500

tatcaac 1507

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Ile Thr Ala Ala Ser Pro Arg Pro Ser Ala Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Met Glu Glu Thr Ser Lys Ala Met Pro Thr Ser Glu Trp Pro Ala

20 25 30

Ala Ser Gly Gly Asn Ala Ser Pro Pro Ala Arg Ser Arg Pro Ser Leu

35 40 45

Leu Val Ile Phe Ser Ala Cys Leu Val Leu Leu Gly Ala Gly Gly Pro

50 55 60

Leu Leu Leu Arg Val Tyr Phe Val His Gly Gly Thr Arg Leu Trp Leu

65 70 75 80

Ser Ala Thr Leu Gln Ile Ser Gly Trp Pro Leu Leu Leu Pro Pro Leu

85 90 95

Cys Val Ser Leu Tyr Arg Gly Arg Arg His Gly Ile Gly Asn Leu Leu

100 105 110

Leu Pro Arg Arg Leu Val Gly Ala Ala Ala Val Leu Gly Gly Leu Tyr

115 120 125

Ala Val Ser Cys Phe Val Tyr Ala Leu Gly Ser Gln Ala Leu Pro Leu

130 135 140

Ser Thr Ser Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gln Leu Ala Phe Thr Ala Val

145 150 155 160

Phe Ala Phe Leu Phe Val Gly Leu Arg Phe Thr Pro Phe Ser Ala Asn

165 170 175

Ala Val Val Leu Leu Thr Ile Gly Pro Ala Val Leu Gly Val Gly Pro

180 185 190

Ser Ser Gly Lys Pro Ala Gly Glu Ser Ser Arg Ala Tyr Trp Thr Gly

195 200 205

Phe Cys Glu Ala Ile Gly Ala Ala Ala Leu Ala Gly Leu Val Ile Pro

210 215 220

Leu Val Glu Val Ala Thr Ala Arg Tyr Gly Arg Arg Thr Gly Pro Ala

225 230 235 240

Ala Arg Val Pro Pro Pro Tyr Ala Thr Val Met Gln Met Gln Ala Val

245 250 255

Met Gly Ala Ala Gly Thr Ala Val Cys Val Leu Gly Met Ala Ile Lys

260 265 270

Gly Asp Phe Gln Ala Val Ala Arg Glu Ala Ala Ala Phe Gly Leu Gly

275 280 285

Ala Ala Asn Tyr Tyr Leu Val Leu Ala Trp Asp Ala Val Ser Trp Gln

290 295 300

Leu Leu Asn Leu Gly Ile Met Gly Leu Ile Thr Cys Ala Ser Ser Leu

305 310 315 320

Leu Ala Gly Ile Met Ile Ala Val Leu Leu Pro Leu Ser Gln Val Leu

325 330 335

Ala Val Ile Phe Leu His Glu Lys Phe Asp Gly Thr Lys Gly Ile Ala

340 345 350

Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Phe Ala Ser Tyr Leu Tyr Gly Glu Lys

355 360 365

Ala Gln Lys Lys Lys Glu Ala Gln Lys Met Arg Glu Arg Glu Gln Glu

370 375 380

Val Ala Leu Ala Gln Lys Thr Ala Asp Val Glu Ser Ala Ala Pro

385 390 395

<210> 3

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccacca ttactgctgc tagtcccaga cccagtgctg ctcctgcagc catggaagag 60

accagcaagg cgatgcctac tagcgagtgg cctgccgcca gcggcggcaa tgcgtcgccg 120

ccggcgaggt cccggccgtc gctgctggtc atattcagcg cgtgcctcgt cctcctcggc 180

gccggcgggc cgctcctcct ccgcgtctac ttcgtgcacg gcgggacccg gctgtggctg 240

tccgccacgc tccagatctc cggctggccg ctgctgctgc cgccgctgtg cgtgtcgctc 300

taccgcggcc gcaggcacgg gatcggcaac ctcctcctcc cgcggcgcct cgtcggcgcc 360

gccgccgtgc tcggcgggct gtacgccgtg tcgtgcttcg tgtacgcgct ggggtcgcag 420

gcgctgccgc tgtccacgtc gtcgctgctg ctggcgacgc agctggcctt caccgccgtg 480

ttcgcgttcc tcttcgtggg cctccggttc acgccgttct cggccaacgc cgtcgtgctg 540

ctcaccatcg gcccggcggt gctgggcgtc gggccgtcgt cggggaagcc ggcgggggag 600

tcctccaggg cgtactggac ggggttctgc gaggccatcg gcgcggcggc gctagccggg 660

ctggtgatcc cgctcgtcga ggtcgccacg gcgaggtacg ggcgccgcac ggggcccgcg 720

gcgagggtgc cgcctcccta cgcgacggtg atgcagatgc aggcggtgat gggcgcggcg 780

ggcacggcgg tgtgcgtgct cggcatggcg atcaagggcg acttccaggc ggtggcgcgg 840

gaagcggcgg cgttcgggct cggcgcggcc aactactacc tcgtcctcgc ctgggacgcc 900

gtgtcgtggc agctgctcaa cctgggcatc atggggctca tcacctgcgc gtcgtcgctg 960

ctcgccggca tcatgatcgc cgtgctcctg ccgctctcgc aggtcctcgc cgtcatcttc 1020

ctccacgaga agttcgacgg gacgaagggc atcgcgctcg tgctctcgct ctggggattc 1080

gcctcctacc tctacggcga gaaggcgcag aagaagaagg aggcgcagaa gatgcgcgag 1140

cgcgagcagg aggtggcgct ggcacagaag accgcagacg tggagtcagc ggcgccttag 1200

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggggatcc tctagaatgg ccaccattac tgct 34

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaagcagggc atgcctgcag ctaaggcgcc gctgactc 38

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgccgtcat cttcctcca 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtctgcggt cttctgtg 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagcctctgt tcgtcaagta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actcgatggt ccattaaacc 20

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacgccaagc ttggctgcag cttctaggct tctagcact 39

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattcccgg ggatccgatc aaatgaagca gtgct 35

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caaggagctc ggatccatgg ccaccattac tgct 34

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaggtcgac tctagactaa ggcgccgctg actc 34

Claims (3)

1.OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻粒型和/或粒重中的应用，所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述水稻粒型为水稻的粒宽。

2.OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐热性中的应用，所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.OsPUP1基因或编码蛋白OsPUP1在调控水稻耐盐性中的应用，所述OsPUP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述编码蛋白OsPUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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